專(zhuān)利名稱(chēng)：利用生物物質(zhì)的2-吡咯烷酮的制備方法
利用生物物質(zhì)的2-吡咯烷酮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種2-卩比咯燒酮(2-pyrrolidone)的制備方法,涉及利用生物物質(zhì)(biomass)來(lái)從谷氨酸(glutamic acid)或者谷氨酸鹽(glutamate)制備2_批咯燒酮的方法。
背景技術(shù)：
2-吡咯烷酮是在聚合物的制備、化學(xué)反應(yīng)的溶劑、特殊墨水等多種領(lǐng)域作為工業(yè)用原材料使用的有用的化學(xué)物質(zhì)。作為以往廣泛熟知的代表性的2-吡咯烷酮制備方法，是記載于巴斯夫公司(BASF)的專(zhuān)利申請(qǐng)(W003 /022811)的方法，是將作為石油化學(xué)物質(zhì)的丁內(nèi)酯(gammabutyrolactone)與氨水(ammonia)在液相中以高溫高壓反應(yīng)條件下連續(xù)制備的方法。并且，公知的有將琥珀酸或琥珀酸酐作為起始物質(zhì)(美國(guó)專(zhuān)利第4904804號(hào))，或者將順丁烯二酸(maleic acid)(美國(guó)專(zhuān)利第5912358號(hào))或琥拍腈(Succinonitrile)(美國(guó)專(zhuān)利第4325872號(hào)、第4193925號(hào)、第4181662號(hào)及第4123438號(hào))作為起始物質(zhì)來(lái)制備2-吡咯烷酮的方法等，這些原料為原油依賴(lài)型，價(jià)格變動(dòng)嚴(yán)重，且由于石油資源的不足而預(yù)想到持續(xù)性的價(jià)格上升。因這種預(yù)想，最近活躍展開(kāi)要從低價(jià)的生物物質(zhì)獲得化學(xué)物質(zhì)的研究，作為其實(shí)例，通過(guò)發(fā)酵從生物物質(zhì)獲得谷氨酸(glutamic acid),并通過(guò)酶反應(yīng)制備作為一種氨基酸(amino acid)且作為健康功能食品原材料的4-氨基丁酸(4_aminobutyricacid)(或者‘ Y -氨基丁酸’、‘GABA, gamma-aminobutyric acid’ )的方法,并且,還公開(kāi)一些從4-氨基丁酸制備2-吡咯烷酮的方法。作為從4-氨基丁酸制備2-吡咯烷酮的公知的方法，于1990年P(guān)athak等(Tetrahedron46 (5):1733-1744 (1990))報(bào)告出在致癌性物質(zhì)的前驅(qū)體合成的中間過(guò)程中，在4-氨基丁酸和過(guò)量的中性氧化鋁(alumina)存在下，將甲苯(toluene)作為反應(yīng)溶劑在回流溫度下反應(yīng)約10小時(shí)來(lái)合成2-吡咯烷酮的方法，并且，在2009年韓國(guó)化學(xué)研究院(韓國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2009-0128767號(hào))中，在4-氨基丁酸添加催化劑或者脫水劑，并將甲苯作為反應(yīng)溶劑，以與上述Pathak相同的方法制備了 2-吡咯烷酮。但是，這樣的方法具有如下缺點(diǎn):反應(yīng)后需要除去催化劑的過(guò)濾工序；需要追加原材料費(fèi)用；需要從反應(yīng)溶劑分離提純2-吡咯烷酮。另一方面，日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2002-121183號(hào)中公開(kāi)一種在200°C -300°C的高溫、高壓水(15兆帕斯卡-30 (megapascal))中使4_氨基丁酸和水進(jìn)行反應(yīng)來(lái)制備2_批咯烷酮的方法。但是，該方法也由于高溫高壓反應(yīng)而產(chǎn)生不必要的應(yīng)用費(fèi)用的上升和在大量生產(chǎn)伴隨著莫大的設(shè)備投資的缺點(diǎn)。日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2009-159840號(hào)在利用4-氨基丁酸來(lái)制備吡咯烷酮(pyrrolidone)的方法中揭示了多種反應(yīng)溶劑條件，尤其主張，若在4-氨基丁酸混合吡咯烷酮?jiǎng)t可以降低反應(yīng)溫度，此時(shí)，揭示的反應(yīng)溫度優(yōu)選為180°C。但是，該專(zhuān)利也未能提出針對(duì)過(guò)高的反應(yīng)溫度帶來(lái)的費(fèi)用問(wèn)題和由于在180°C的反應(yīng)溫度下爆發(fā)性的生成的水(水蒸氣)而產(chǎn)生的工序運(yùn)轉(zhuǎn)的困難等，大量生產(chǎn)時(shí)可能產(chǎn)生的問(wèn)題的解決方案。并且，雖然熟知4-氨基丁酸在作為熔點(diǎn)的溫度(202°C)下分解成2-吡咯烷酮和水的公知的事實(shí)(默克索引(Merck indeX)430)，然而將該方法利用于大量生產(chǎn)不可能一次性攪拌多量的4-氨基丁酸的同時(shí)在作為熔點(diǎn)的溫度(202°C)下熔化而生成2-吡咯烷酮和水，并且由于在此時(shí)產(chǎn)生的多量的水(水蒸氣)爆發(fā)性生成的同時(shí)工作液體溢出等工序運(yùn)轉(zhuǎn)上相當(dāng)困難。另一方面，當(dāng)前處于利用生物物質(zhì)從谷氨酸或者谷氨酸鹽最終制備吡咯烷酮的整體工序的相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)完全未出現(xiàn)的實(shí)情。假如，開(kāi)發(fā)利用生物物質(zhì)可以從谷氨酸或者谷氨酸鹽制備吡咯烷酮的有效的工序，這將在吡咯烷酮生產(chǎn)領(lǐng)域中可以大大提高經(jīng)濟(jì)性。在本說(shuō)明書(shū)全文中參考多篇論文及專(zhuān)利文獻(xiàn)，并標(biāo)記了其引用部分。引用的論文及專(zhuān)利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容，作為參照全部插入到本說(shuō)明書(shū)中，而將更加明確說(shuō)明本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水準(zhǔn)及本發(fā)明的內(nèi)容?！?br>
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的技術(shù)課題本發(fā)明人為了開(kāi)發(fā)能夠以高收獲率及低生產(chǎn)費(fèi)用大量制備2-吡咯烷酮的方法而努力。其結(jié)果，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)出直接利用生物物質(zhì)能夠以高收獲率及低生產(chǎn)費(fèi)用從谷氨酸或者谷氨酸鹽大量制備2-吡咯烷酮的工序方案(protocol )，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于，提供2-吡咯烷酮的制備方法。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)，由發(fā)明內(nèi)容、權(quán)利要求書(shū)及附圖將變得更加明確。解決課題的技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，本發(fā)明提供2-吡咯烷酮的制備方法，該2-吡咯烷酮的制備方法包括以下步驟:步驟(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為全細(xì)胞催化劑具有谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase)的微生物來(lái)制備4_氨基丁酸；步驟(b)，通過(guò)過(guò)濾從上述培養(yǎng)基獲得上述4-氨基丁酸；以及步驟(C)，將上述4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮。本發(fā)明人為了開(kāi)發(fā)能夠以高收獲率及低生產(chǎn)費(fèi)用大量制備2-吡咯烷酮的方法而努力。其結(jié)果，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)出直接利用生物物質(zhì)從谷氨酸或者谷氨酸鹽能夠以高收獲率及低生產(chǎn)費(fèi)用制備大量2-吡咯烷酮的工序方案。按各個(gè)不同的步驟，對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，如下:步驟(a):利用生物物質(zhì)制備4-氨基丁酸根據(jù)本發(fā)明，不破碎微生物，將微生物本身作為全細(xì)胞催化劑而利用，來(lái)制備
4-氨基丁酸。作為全細(xì)胞催化劑的微生物可以利用未進(jìn)行任何物理/化學(xué)變形的微生物。優(yōu)選地，在本發(fā)明中具有作為全細(xì)胞催化劑利用的谷氨酸脫羧酶的微生物，是為了破壞細(xì)胞膜的選擇透性而用有機(jī)溶劑(優(yōu)選為疏水性有機(jī)溶劑)預(yù)處理的微生物。在本發(fā)明中利用的微生物是具有谷氨酸脫羧酶的微生物，優(yōu)選地可以利用曲霉屬(aspergillus)、梭菌屬(clostridium)、埃希氏菌屬(Escherichia)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)或者李斯特菌屬(listeria)微生物，更加優(yōu)選地可以利用埃希氏菌屬、乳桿菌屬或者乳球菌屬，最為優(yōu)選地可以利用腸埃希氏菌(Escherichia coli，俗稱(chēng)為大腸桿菌)。作為上述曲霉屬微生物，優(yōu)選地，可以使用棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、淺藍(lán)灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、彎頭曲霉(AspergillusdefIectus)、費(fèi)氏曲霉(Aspergillus fischerianus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或者赫曲霉(Aspergillus ochraceus)，更加優(yōu)選地，可以使用費(fèi)氏曲霉、黃曲霉或者米曲霉，最為優(yōu)選地，可以使用米曲霉。在上述梭菌屬微生物，優(yōu)選地，可以使用丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、耐氧梭菌(C.aerotolerans)、巴氏梭菌(C.baratii )、拜氏梭菌(C.bei jerinckii )、雙酶梭菌(C.bifermentans)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfingens)、肉毒梭菌(C.botulinum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、尸毒梭菌(C.cadaveris)、氣腫疽梭菌(C.chauvoei)、梭狀梭菌(C.c lostri dioforme)、狗腸梭菌(C.colicanis)、艱難梭菌(C.difficile)、醋化梭菌(C.estertheticum)、譎詐梭菌(C.fallax)或者費(fèi)塞氏梭菌(C.feseri)，更加優(yōu)選地，可以使用拜氏梭菌(C.bei jerinckii)、雙酶梭菌(C.bifermentans)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfingens)或者肉毒梭菌(C.botulinum)，最優(yōu)選地，可以使用產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfingens)。在上述埃希氏菌屬微生物，可以使用阿爾伯蒂埃希氏菌(E.albertii)、蟑螂埃希氏菌(E.blattae)、腸埃希氏菌(E.coli)、費(fèi)格森埃希氏菌(E.fergusonii)、赫氏埃希氏菌(E.hermannii)或者傷口埃希氏 菌(E.vulneris),更加優(yōu)選地，可以使用蟑螂埃希氏菌、腸埃希氏菌或者費(fèi)格森埃希氏菌，最優(yōu)選地，可以使用腸埃希氏菌。上述腸埃希氏菌可以利用一般的腸埃希氏菌，優(yōu)選地，利用以大量生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的方式進(jìn)行基因操作的腸埃希氏國(guó)。在上述乳桿菌屬微生物，優(yōu)選地，可以使用耐酸乳桿菌(L.acetotolerans)、酸粉乳桿菌(L.acidifarinae)、馬里乳桿菌(L.acidipiscis)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、能動(dòng)乳桿菌(L.agilis)、阿氏乳桿菌(L.algidus)、消化乳桿菌(L.alimentarius)、降解淀粉類(lèi)乳桿菌(L.amylolyticus)、嗜淀粉乳桿菌(L.amylophilus)、復(fù)合乳桿菌(L.composti)、面包乳桿菌(L.crustorum)、糊精乳桿菌(L.dextrinicus)、迪氏乳桿菌(L.diolivorans)、額氏乳桿菌(L.equigenerosi )、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、雞乳桿菌(L.gal I inarum)、甘氏乳桿菌(L.ghanensis)、希氏乳桿菌(L.hi lgardi i)、惰性乳桿菌(L.1ners)、約氏乳桿菌(L.johnsonii)、萊士曼氏乳酸桿菌(L.1eichmannii)、納氏乳桿菌(L.nagelii)、瑞士乳酸菌(L.helveticus)、短乳桿菌(L.brevis)、布氏乳桿菌(L.buchneri)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus Iactis)、干酷乳桿菌(L.casei)、辣白菜乳桿菌(L.kimchii)、胚芽乳桿菌(L.plantarum)、羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)、舊金山乳桿菌(L.sanfranciscensis)或者清酒乳桿菌(L.sakei )，更加優(yōu)選地，可以使用短乳桿菌、布氏乳桿菌、乳酸乳桿菌或者干酪乳桿菌，最優(yōu)選地，可以使用乳酸乳桿菌。在上述乳球菌屬微生物，可以使用格氏乳球菌(L.garvieae)、乳酸乳球菌(L.lactis)、魚(yú)乳球菌(L.piscium)、植物乳球菌(L.plantarum)或者棉子糖乳球菌(L.raffinolactis),更加優(yōu)選地,可以使用乳酸乳球菌或者魚(yú)乳球菌,最優(yōu)選地,可以使用乳酸乳球菌。在上述李斯特菌屬微生物，可以使用格氏李斯特菌(L.grayi)、無(wú)害李斯特菌(L.1nnocua)、伊氏李斯特菌(L.1vanovii)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、墨氏李斯特菌(L.muttayi)或者威氏李斯特菌(L.welshimeri),更加優(yōu)選地,可以使用伊氏李斯特菌或者單核細(xì)胞增生李斯特菌,最優(yōu)選地，可以使用單核細(xì)胞增生李斯特菌。微生物的選擇透性(selective permeability)是指受到對(duì)于形成微生物的細(xì)胞膜的脂雙層(Lipid bilayer)的水溶性基質(zhì)的環(huán)境因素的影響的細(xì)胞內(nèi)外部間的輸送，細(xì)胞膜是不滲透分子較大的水溶性物質(zhì)的半透性膜，但脂溶性物質(zhì)被細(xì)胞膜的脂質(zhì)部分溶解而滲透，從而具有與分子的大小無(wú)關(guān)的，越是對(duì)脂質(zhì)的溶解度大的物質(zhì)，越容易滲透的性質(zhì)。在細(xì)胞膜與疏水性有機(jī)溶劑進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，半透性膜會(huì)被破壞，而喪失細(xì)胞的選擇透性。在本發(fā)明中重要的是，與微生物進(jìn)行反應(yīng)的疏水性有機(jī)溶劑的種類(lèi)及濃度破壞微生物的選擇透性，來(lái)提高2-氨基丁酸(2-aminobutyl acid)的含量，并且可以再利用全細(xì)胞催化劑。作為與上述微生物進(jìn)行反應(yīng)來(lái)破壞選擇透性的有機(jī)溶劑，優(yōu)選地可以使用疏水性有機(jī)溶劑，更加優(yōu)選地，可以使用戊烷(Pentanes)、己烷(Hexane)、癸烷(Decane)、環(huán)己燒(Cyclohexane)、環(huán)戍燒(Cyclopentane)、1- 丁烯(l_Butylene)、2_ 丁烯(2-Butylene)、1-戍烯(l_Pentene)、2-戍烯(2-Pentene)、異丁烯(Isobutylene)、四氯化碳(Carbon tetrachloride)、1-氯丁燒(1-Chlorobutane)、1-氯戍燒(1-Chloropentane)>2-氯丙燒(2-Chloropropane)、1-氯丙燒(l-Chloropropane)、溴乙燒(Bromoethane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲燒(Dichloromethane)、1-硝基丙燒(l-Nitropropane)、硝基甲燒(Nitromethane)、苯(Benzene)、甲苯(Toluene)、二甲苯(XyIene)、氣苯(Chlorobenzene)、苯胺(Aniline)、二乙醚(Diethyl ether)、二異丙醚(Diisopropyl ether)、四氫呋喃(Tetrahydrofuran)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、乙酸甲酯(Methyl acetate)、二硫化碳(Carbon disulfide)、二乙硫醚(Diethyl sulfide)、二甲基亞諷(Dimethyl sulfoxide)、二乙胺(Diethylamine)、乙腈(AcetonitriIe)、卩比唳(Pyridine),進(jìn)而優(yōu)選地,可以使用甲苯、氯仿、二甲苯、環(huán)己烷，最為優(yōu)選地，可以使用甲苯。在本發(fā)明中，上述有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為0.01%-20% (v/v)，更加優(yōu)選為0.01%_5%(v/v)，進(jìn)而優(yōu)選為0.1%-1% (v/v)，最優(yōu)選為0.2%-0.5% (v/v)。上述‘(v/v)’表示疏水性有機(jī)溶劑的體積/微生物懸浮液的體積，在使用20% (v/v)以上的有機(jī)溶劑時(shí)，存在抑制催化劑活性且難以回收菌體的問(wèn)題，在使用0.01% (v/v)以下的有機(jī)溶劑時(shí)，存在難以破壞細(xì)胞膜的選擇透性的問(wèn)題。攪拌具有上述谷氨酸脫羧酶的微生物和上述疏水性有機(jī)溶劑來(lái)對(duì)微生物進(jìn)行預(yù)處理。在上述攪拌時(shí)，攪拌速度優(yōu)選為100rpm-600rpm,更加優(yōu)選為200rpm-400rpm,最優(yōu)選為 200rpm-300rpm。
在上述攪拌時(shí)，攪拌時(shí)間優(yōu)選為I分鐘-60分鐘，更加優(yōu)選為3分鐘-30分鐘，最優(yōu)選為5分鐘-15分鐘。并且，在上述攪拌時(shí)，攪拌溫度優(yōu)選為4°C _40°C，更加優(yōu)選為15°C _35°C，最優(yōu)選為 25 °C -30 °C。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，通過(guò)上述過(guò)程來(lái)制備全細(xì)胞催化劑之后，還可以包括使上述全細(xì)胞催化劑懸浮于水或者緩沖溶液的步驟。因?yàn)?，谷氨酸脫羧酶具有活性的PH的范圍是3.5-6.0，在脫離上述范圍時(shí)，活性急劇降低，在借助谷氨酸脫羧酶，谷氨酸轉(zhuǎn)換為Y氨基丁酸的過(guò)程中，水溶液的質(zhì)子被消耗的同時(shí)PH上升，因此有必要調(diào)節(jié)pH。更加具體地，著眼于在本發(fā)明中利用的谷氨酸的pKa值為2.2左右，將超過(guò)溶解度的量的谷氨酸添加于全細(xì)胞催化劑水溶液，此時(shí)使用緩沖溶液，以防止初期PH降到3.5以下。利用于本發(fā)明的緩沖溶液的PH優(yōu)選為3.8-8.0，更加優(yōu)選為4.0-8.0，進(jìn)而優(yōu)選為4.0-7.0，尤其優(yōu)選為4.0-6.0。制備pH為4.5的緩沖溶液時(shí)使用醋酸，制備pH為6.0,7.0及8.0的緩沖溶液時(shí)使用磷酸，但并不局限于此。另一方面，在作為基質(zhì)利用谷氨酸時(shí)，利用于本發(fā)明的緩沖溶液的pH優(yōu)選為
4.0-8.0，更加優(yōu)選為4.5-7.0，進(jìn)而優(yōu)選為5.0-6.0，最優(yōu)選為6.0。在下述步驟(b)中作為基質(zhì)利用谷氨酸鈉時(shí)，利用于本發(fā)明的緩沖溶液的PH優(yōu)選為3.8-6.5，更加優(yōu)選為
3.8-6.0，進(jìn)而優(yōu)選為3.8-5.5，尤其優(yōu)選為3.8-5.0，最優(yōu)選為4.0。根據(jù)本發(fā)明，借助全細(xì)胞催化劑，谷氨酸或者谷氨酸鹽(優(yōu)選為谷氨酸鈉)轉(zhuǎn)換為4-氨基丁酸。利用于本發(fā)明的谷氨酸是20種蛋白質(zhì)氨基酸之一，谷氨酸鈉是結(jié)構(gòu)式為HOOC(CH2)2CH (NH2)C0 0Na、分子量為169.11的谷氨酸的鈉鹽。本發(fā)明的最大的特征在于，除了為了制備4-氨基丁酸而使用谷氨酸鈉以外，還可以利用谷氨酸。由于谷氨酸的價(jià)格低于谷氨酸鈉，因此在利用谷氨酸來(lái)制備Y氨基丁酸時(shí)，可以降低產(chǎn)品的成本。全細(xì)胞催化劑的濃度，根據(jù)催化劑具有的谷氨酸脫羧酶的量來(lái)調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，就大腸桿菌而言，未進(jìn)行人為的基因操作的菌株使用濃度優(yōu)選為lg/L_30g/L的菌株，更加優(yōu)選為5g/L-20g/L的菌株，最優(yōu)選為10g/L-15g/L的菌株。并且，為了大量生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶而進(jìn)行基因操作的大腸桿菌菌株使用濃度優(yōu)選為lg/L_30g/L的菌株，更加優(yōu)選為lg/L-10g/L的菌株,最優(yōu)選為lg/L-5g/L的菌株。與上述全細(xì)胞催化劑進(jìn)行反應(yīng)的谷氨酸或者谷氨酸鈉，可通過(guò)生物學(xué)方式從生物物質(zhì)制備而得，可以投入到以粉末形態(tài)或者水溶液狀態(tài)包含全細(xì)胞催化劑的反應(yīng)器。所添加的谷氨酸或者谷氨酸鈉的量，相對(duì)于微生物懸浮液的重量％，優(yōu)選為15重量％_55重量％,更加優(yōu)選為30重量％-50重量％，最優(yōu)選為35重量％-45重量％。如果小于15重量％，由于生成的Y氨基丁酸的濃度低，在濃縮費(fèi)用等方面工業(yè)性價(jià)值降低，如果大于55重量％，會(huì)難以攪拌，存在轉(zhuǎn)換率減少到90%以下的問(wèn)題。所添加的谷氨酸或者谷氨酸鈉能夠以粉末或者懸浮液的形態(tài)注入，無(wú)需全部溶解所有的谷氨酸。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，當(dāng)反應(yīng)全細(xì)胞催化劑與谷氨酸或者谷氨酸鈉進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，還可包含5-磷酸卩比唆醒(PLP, Pyridoxal 5-phosphate)來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。這是因?yàn)?_磷酸批P多醒是在氨基酸的外消旋化(racemization)、轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)、脫羧反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、脫醒反應(yīng)、從絲氨酸(serine)和卩引哚(indole)的色氨酸(tryptophan)的合成反應(yīng)等生物體內(nèi)的各種酶反應(yīng)起作用的輔酶之一，用于執(zhí)行促進(jìn)反應(yīng)的作用。步驟(b):培養(yǎng)基的過(guò)濾利用將谷氨酸或者谷氨酸鹽作為基質(zhì)包含的培養(yǎng)基及全細(xì)胞催化劑來(lái)制備4-氨基丁酸之后，通過(guò)過(guò)濾培養(yǎng)基，從培養(yǎng)基的微生物細(xì)胞及不溶性成分分離4-氨基丁酸。上述過(guò)濾用于從培養(yǎng)基除去微生物細(xì)胞及不溶性成分。上述過(guò)濾可以利用本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域公知的多種方法，例如，可以利用離心分離、壓濾器、過(guò)濾膜或者過(guò)濾紙來(lái)實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，在步驟(a)及步驟(b)之間還包括在上述培養(yǎng)基處理活性炭來(lái)除去培養(yǎng)基的色素的步驟?；钚蕴刻幚砜梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域公知的多種方法來(lái)實(shí)施，大體上有如下兩種方法:將活性炭直接在培養(yǎng)基進(jìn)行處理的方法和利用填滿活性炭的色譜柱的方法?？紤]到生產(chǎn)費(fèi)用及工序方便性，將活性炭直接在培養(yǎng)基進(jìn)行處理的方法更加適合本發(fā)明。根據(jù)將活性炭直接在培養(yǎng)基進(jìn)行處理的方法，相對(duì)于培養(yǎng)基內(nèi)的4-氨基丁酸(4-aminobutyricacid)的重量％,在培養(yǎng)基進(jìn)行處理的活性炭的量為I重量％_10重量％,優(yōu)選為1.5重量％-4.0重量％,更加優(yōu)選為2.0重量％-4.0重量％。如以下實(shí)施例所述,如果活性炭的處理量大于4.0重量％，則培養(yǎng)基內(nèi)的4-氨基丁酸的損失率會(huì)增加，而存在最終制備的2-吡咯烷酮的收獲率減少的問(wèn)題，如果活性炭的處理量小于1.5重量％，則未能充分除去培養(yǎng)基內(nèi)的色素雜質(zhì)，而存在2-吡咯烷`酮的收獲率減少的問(wèn)題。選擇性地，活性炭處理可以利用填滿活性炭的色譜柱來(lái)實(shí)施。例如，在填滿活性炭的色譜柱裝載培養(yǎng)基，從色譜柱獲得洗脫液(eluant)，則可以獲得除去色素的4-氨基丁酸溶液。在利用色譜柱的情況下，可以同時(shí)進(jìn)行色素的除去和培養(yǎng)基的過(guò)濾。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，本發(fā)明中，對(duì)步驟(a)的結(jié)果物進(jìn)行離心分離來(lái)分離菌體，在分離的溶液處理活性炭來(lái)除去色素之后，過(guò)濾結(jié)果物來(lái)獲得4-氨基丁酸。優(yōu)選地，在處理活性炭之前，對(duì)分離出菌體的培養(yǎng)基進(jìn)行加熱處理。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，濃縮包含通過(guò)過(guò)濾而獲得的4-氨基丁酸的溶液來(lái)利用于2-吡咯烷酮合成。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，在步驟(b)之后還包括對(duì)上述全細(xì)胞催化劑進(jìn)行分離且再利用分離的全細(xì)胞催化劑的步驟。由于本發(fā)明中提供的方法不經(jīng)過(guò)微生物的破碎過(guò)程而是使用微生物本身，可以通過(guò)離心分離來(lái)容易回收具有谷氨酸脫羧酶的微生物供重新使用?？梢岳没厥盏奈⑸飦?lái)反復(fù)上述步驟(a)，也可以在開(kāi)始4-氨基丁酸制備反應(yīng)的反應(yīng)器還注入已回收的微生物來(lái)制備4-氨基丁酸。步驟(C):從4-氨基丁酸制備2-吡咯烷酮利用在上述過(guò)程中獲得的4-氨基丁酸來(lái)獲得2-吡咯烷酮。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，在步驟(C)中利用的4-氨基丁酸未進(jìn)行預(yù)提純(pre-purification)。本說(shuō)明書(shū)中的“未進(jìn)行預(yù)提純的4-氨基丁酸”是指除了如上所述的過(guò)濾和/或活性炭處理以外，未進(jìn)行其他提純過(guò)程(例如，結(jié)晶化)的未加工的(crude)4_氨基丁酸。4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換到2-吡咯烷酮的過(guò)程基本上是內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)。就利用4-氨基丁酸來(lái)合成2-吡咯烷酮而言，可以通過(guò)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的公知的多種方法來(lái)實(shí)施。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換到2-吡咯烷酮的過(guò)程是由本發(fā)明人開(kāi)發(fā)的方法，是命名為“DPSP”(大常卩比咯燒酮的合成方案(Daesang Pyrrolidone SynthesisProtocol))的方法。該DPSP方法是既有效、又經(jīng)濟(jì)(cost-effective)的方法。DPSP方法基本上包括以下步驟:步驟(c-1)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的的反應(yīng)組合物；步驟(c-2)，對(duì)上述反應(yīng)組合物進(jìn)行加熱處理來(lái)實(shí)施內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，來(lái)生成2-吡咯烷酮及水；以及步驟(c-3)，分離上述2-吡咯烷酮。更加具體地，DPSP方法包括如下兩種:在如上所述的基本的步驟中，把重點(diǎn)放在溫度調(diào)節(jié)上的DPSP-T方法和把重點(diǎn)放在壓力調(diào)節(jié)上的DPSP-P方法。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，DPSP-T方法包括以下步驟:步驟(a)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物；步驟(b)，在118°C -148°C的溫度下對(duì)上述反應(yīng)組合物進(jìn)行加熱處理來(lái)實(shí)施內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，來(lái)生成2-吡咯烷酮及水；以及步驟(C)，分離上述2-吡咯烷酮。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，DPSP-P方法包括以下步驟:步驟(a)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物；步驟(b)，在減壓條件下對(duì)上述反應(yīng)組合物進(jìn)行加熱處理來(lái)實(shí)施內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，來(lái)生成2-吡咯烷酮及水，并除去上述水；以及步驟(C)，分離上述2-吡咯烷酮。首先，對(duì)DPSP-T方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明如下。根據(jù)DPSP-T方法，首先，為了提供對(duì)于4-氨基丁酸的轉(zhuǎn)換反應(yīng)的適合的環(huán)境，而形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物。在提供4-氨基丁酸的反應(yīng)物和2-吡咯烷酮共存的反應(yīng)組合物的情況下，如以下實(shí)施例中所證明，在低于4-氨基丁酸的熔點(diǎn)(202°C)的溫度，例如在118°C _120°C下，4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮和水。通過(guò)多種方法可提供混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物。第一方式，步驟(a)中，可以在反應(yīng)器攪拌4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮。即，在反應(yīng)器投入4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮并對(duì)此進(jìn)行攪拌，從而形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物。這種反應(yīng)組合物，可以在比較低的溫度，例如，可以在118°C -148°C下進(jìn)行4-氨基丁酸的內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)。在第一方式中，與4-氨基丁酸混合的2-吡咯烷酮的量沒(méi)有特別的限制。但是，如果與4-氨基丁酸混合的2-吡咯烷酮的量過(guò)少，則在為了反應(yīng)進(jìn)行攪拌時(shí)會(huì)存在問(wèn)題，如果過(guò)多，則存在反應(yīng)結(jié)束后對(duì)2-吡咯烷酮進(jìn)行蒸餾的費(fèi)用上漲的問(wèn)題。因此，考慮到順利的工序運(yùn)轉(zhuǎn)和制備費(fèi)用時(shí)，按重量比來(lái)算，4-氨基丁酸和2-吡咯烷酮的混合量之比優(yōu)選為1:0.1-1:10，更加優(yōu)選為1:0.2-1:5，進(jìn)而優(yōu)選為1:0.5-1:2。第二方式，步驟(a)中，可以在反應(yīng)器投入4-氨基丁酸，提高上述反應(yīng)器的溫度來(lái)將4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮及水之后，接著將4-氨基丁 酸追加投入到上述反應(yīng)器。例如，在反應(yīng)器投入4-氨基丁酸，將反應(yīng)器的溫度上升至4-氨基丁酸的熔點(diǎn)(2020C )，來(lái)將4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮及水。接著，自然冷卻反應(yīng)器的同時(shí)，追加地投入4-氨基丁酸并進(jìn)行溶解。在需要的情況下，可以兩次追加投入4-氨基丁酸。 第三方式，步驟(a)中，可以在反應(yīng)器投入4-氨基丁酸，提高上述反應(yīng)器的溫度來(lái)將4-氨基丁酸的一部分轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮及水。與第二個(gè)方式不同之處為，初期開(kāi)始使用要轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮的全部4-氨基丁酸。與在上述三個(gè)方式中采取哪一個(gè)方式無(wú)關(guān)地，通過(guò)這些過(guò)程提供混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物。接著，在118°C _148°C的溫度下，對(duì)上述反應(yīng)組合物進(jìn)行加熱處理來(lái)實(shí)施內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，來(lái)生成2-吡咯烷酮及水。如果在適合的溫度下維持步驟(a)的反應(yīng)組合物，則產(chǎn)生內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮及水。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)(例如，日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2002-121183號(hào)及日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2009-159840號(hào))，在高溫(例如，200°C _300°C或者180°C )下，將4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮。本發(fā)明中，在相當(dāng)?shù)陀诂F(xiàn)有技術(shù)中提出的反應(yīng)溫度的溫度，即，在118°C _148°C的溫度下，利用4 -氨基丁酸和2-吡咯烷酮的混合反應(yīng)組合物來(lái)進(jìn)行內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，來(lái)生成2-吡咯烷酮及水。假如，反應(yīng)溫度小于118°C，幾乎無(wú)法進(jìn)行內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，導(dǎo)致2-吡咯烷酮幾乎未生成，在反應(yīng)溫度大于148°C時(shí)(例如，200°C _300°C或者180°C )，因爆發(fā)性地生成的水(水蒸氣)而存在難以運(yùn)轉(zhuǎn)工序等問(wèn)題，因此不適于2-吡咯烷酮的大量生產(chǎn)。本發(fā)明中提出的118°C -148°C的反應(yīng)溫度是有效進(jìn)行4-氨基丁酸的轉(zhuǎn)換反應(yīng)的同時(shí)，不要求高溫和/或高壓的效益的條件，是適于大量生產(chǎn)的條件。選擇性地，步驟(b)可以在減壓下實(shí)施，可以借助這種減壓來(lái)除去反應(yīng)中生成的水。在本發(fā)明中，減壓條件優(yōu)選為750mmHg以下，更加優(yōu)選為120mmHg以下，進(jìn)而優(yōu)選為10mmHg-120mmHg,尤其優(yōu)選為 10mmHg-60mmHg,最優(yōu)選為 20mmHg-60mmHg。最終，從步驟(b)的反應(yīng)結(jié)果物分離2-吡咯烷酮，以適合的純度及收獲率獲得2-吡咯烷酮?？衫帽景l(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域公知的多種方法分離2-吡咯烷酮。優(yōu)選地，借助減壓蒸餾實(shí)施2-吡咯烷酮的分離。用于分離2-吡咯烷酮的減壓蒸餾條件優(yōu)選為0.lmmHg-250mmHg,更加優(yōu)選為lmmHg-90mmHg,進(jìn)而優(yōu)選為lmmHg-50mmHg,尤其優(yōu)選為lmmHg-20mmHgo通過(guò)本發(fā)明的DPSP-T方法，最終以高收獲率及高純度獲得2-吡咯烷酮。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法呈現(xiàn)出2-吡咯烷酮的最大99%的收獲率及最大99.8%的純度，更加優(yōu)選地，呈現(xiàn)出90%-99%的收獲率、99.0%-99.8%的純度，進(jìn)而優(yōu)選地，呈現(xiàn)出96%_99%的收獲率、99.5%-99.8% 的純度。對(duì)DPSP-P方法進(jìn)行說(shuō)明，如下。根據(jù)DPSP-P方法，首先，為了提供適于4-氨基丁酸的轉(zhuǎn)換反應(yīng)的環(huán)境，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物?？梢詤⒄沼涊d于上述DPSP-T方法的內(nèi)容對(duì)形成反應(yīng)組合物的過(guò)程進(jìn)行說(shuō)明。接著，在減壓條件下，對(duì)上述反應(yīng)組合物進(jìn)行加熱處理來(lái)實(shí)施內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，來(lái)生成2-吡咯烷酮及水，并除去上述水。在適合的溫度及減壓條件下，維持步驟(a)的反應(yīng)組合物，則產(chǎn)生內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮及水，從反應(yīng)結(jié)果物除去水。DPSP-P工序的特征之一是，在4-氨基丁酸的轉(zhuǎn)換反應(yīng)賦予減壓的條件，來(lái)除去反應(yīng)中生成的水。由于這種水的除去不僅使反應(yīng)速度大大增加，而且可以在更加低的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，整體上可以大大改善對(duì)于2-吡咯烷酮的生產(chǎn)率。就本發(fā)明而言，減壓條件優(yōu)選為750mmHg以下，更加優(yōu)選為120mmHg以下，進(jìn)而優(yōu)選為IOmmHg-12OmmHg,尤其優(yōu)選為10mmHg-60mmHg,最優(yōu)選為20mmHg-60mmHg。步驟(b)中的反應(yīng)溫度優(yōu)選為110°C以上(例如，110°C _150°C)，更加優(yōu)選為118°C以上，進(jìn)而優(yōu)選為118°C -150°C。選擇性地，在IlS0C _148°C的溫度范圍內(nèi)，本發(fā)明也呈現(xiàn)2-吡咯烷酮的優(yōu)秀的收獲率及提純率。根據(jù)本發(fā)明，例如，在118°C的低溫下，4-氨基丁酸也可以轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮。在步驟(b)中除去水。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)例，步驟(b)中除去水的過(guò)程在實(shí)施步驟(b)的過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行。即，4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮和水，水在生成的同時(shí)在減壓條件下被除去。優(yōu)選地，這種除去水的過(guò)程以連續(xù)的工序?qū)嵤?。選擇性地，在步驟(b)中的除去水的過(guò)程可以在實(shí)施步驟(b)的過(guò)程當(dāng)中進(jìn)行。選擇性地，在步驟(b)中的除去水的過(guò)程可以在實(shí)施步驟(b)之后進(jìn)行。最終，從步驟(b)的反應(yīng)結(jié)果物分離2-吡咯烷酮，以適合的純度及收獲率獲得
2-吡咯烷酮。可以參照記載于上述DPSP-T方法的內(nèi)容來(lái)對(duì)2-吡咯烷酮的分離進(jìn)行說(shuō)明。通過(guò)DPSP-P工序，最終以高收獲率及高純度獲得2-吡咯烷酮。優(yōu)選地，本發(fā)明的DPSP-P工序呈現(xiàn)出2-吡咯烷酮的最大99%的收獲率及最大99.8%的純度，更加優(yōu)選為90%-99%的收獲率、99.0%-99.8%的純度，進(jìn)而優(yōu)選為96%_99%的收獲率、99.5%-99.8%的純度。發(fā)明效果概括本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)，如下。(a)本發(fā)明提供利用生物物質(zhì)來(lái)從谷氨酸或者谷氨酸鹽制備2-吡咯烷酮的一系列的工序。(b)根據(jù)本發(fā)明，作為全細(xì)胞利用微生物來(lái)制備4-氨基丁酸，優(yōu)選地，直接利用未經(jīng)結(jié)晶化等復(fù)雜的提純過(guò)程的4-氨基丁酸來(lái)以高收獲率經(jīng)濟(jì)地制備2-吡咯烷酮。(C)根據(jù)本發(fā)明，能夠以高收獲率及低生產(chǎn)費(fèi)用大量制備2-吡咯烷酮。(d)根據(jù)本發(fā)明，沒(méi)有高溫/高壓的效益地，能夠以高收獲率及高純度從4-氨基丁酸獲得2-吡咯烷酮。(e)本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)化2-吡咯烷酮的制備工序，適合于工業(yè)性規(guī)模的大量生產(chǎn)。
圖1表示根據(jù)有機(jī)溶劑處理的大腸桿菌及乳酸菌的Y氨基丁酸的生產(chǎn)速度比較結(jié)果。圖2表示根據(jù)有機(jī)溶劑種類(lèi)的微生物的Y氨基丁酸生產(chǎn)活性變化。圖3表示根據(jù)pH的Y氨基丁酸生產(chǎn)速度的變化。在圖4中條形圖表示Y氨基丁酸的生產(chǎn)速度，實(shí)線圖表表示初期pH。圖4表示在使用處理了有機(jī)溶劑的菌體的高濃度Y-氨基丁酸生產(chǎn)中隨著反應(yīng)而發(fā)生的PH的變化。
實(shí)施方式以下，通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。這些實(shí)施例僅僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加具體的說(shuō)明，根據(jù)本發(fā)明的主旨，本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例，這對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
實(shí)施例在本說(shuō)明書(shū)全文中，為了表示特征物質(zhì)的濃度而使用的“％”在未另行提及的情況下，固體/固體為(重量/重量)％，固體/液體為(重量/體積)％，而且液體/液體為(體積/
體積)°/o o實(shí)施例1:從谷氨酸或者谷氨酸鹽生產(chǎn)Y氨基丁酸1-1.從利用處理了有機(jī)溶劑的多種全細(xì)胞催化劑的谷氨酸生產(chǎn)Y氨基丁酸培養(yǎng)具有谷氨酸脫羧酶的菌體、大腸桿菌BL21 (DE3)、大腸桿菌JM101、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)及棒狀乳桿菌(Lactobacillus coryniformis) (KCTC)并回收之后，分為有機(jī)溶劑處理組和對(duì)照組。就有機(jī)溶劑處理組而言，在回收的菌體處理
0.5% (v/v)的甲苯,在30°C、200rpm的條件下攪拌10分鐘,來(lái)破壞微生物的選擇透性之后，將該微生物懸浮于滅菌水。對(duì)照組不進(jìn)行特別的處理過(guò)程，直接懸浮于滅菌水。在上述準(zhǔn)備的各個(gè)微生物懸浮液添加40 ii M的5-磷酸批卩多醒(PLP,Pyridoxal5_phosphate ;西格瑪奧德里奇:Sigma Aldrich),并添加33wt%的谷氨酸(大常株式會(huì)社)來(lái)測(cè)定了、氨基丁酸的生產(chǎn)速度。 為了比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，處理了有機(jī)溶劑的實(shí)驗(yàn)組的生產(chǎn)速度值除以未處理有機(jī)溶劑的實(shí)驗(yàn)組的生產(chǎn)速度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，如圖1所示，就Y氨基丁酸的生產(chǎn)速度而言，處理了作為有機(jī)溶劑的甲苯的組比非處理組提高約1.2倍-5.5倍。1-2.從根據(jù)有機(jī)溶劑的全細(xì)胞催化劑的谷氨酸鹽生產(chǎn)Y氨基丁酸培養(yǎng)具有谷氨酸脫羧酶的菌體(Escherichia coli)并回收之后,使用有機(jī)溶劑來(lái)破壞微生物的選擇透性之后，通過(guò)谷氨酸鈉(西格瑪奧德里奇)分析了 Y氨基丁酸的生產(chǎn)速度。使用的有機(jī)溶劑都作為疏水性有機(jī)溶劑，是甲苯、氯仿、二甲苯及苯。就處理?xiàng)l件而言，在微生物懸浮液處理0.5%(v/v)的各有機(jī)溶劑，在30°C、200rpm的條件下攪拌10分鐘。在上述準(zhǔn)備的各個(gè)微生物懸浮液添加40 ii M的5-磷酸吡哆醛，并添加1% (v/v)的谷氨酸鈉，來(lái)比較Y氨基丁酸的生產(chǎn)速度。其結(jié)果如圖2所示，在處理疏水性有機(jī)溶劑后，y氨基丁酸的生產(chǎn)速度增加了約5倍-8倍。1-3.通過(guò)有機(jī)溶劑處理來(lái)增加菌體的Y氨基丁酸的生產(chǎn)活性培養(yǎng)具有谷氨酸脫羧酶的菌體之后回收了菌體。用蒸餾水清洗一次回收的菌體之后，與有機(jī)溶劑攪拌，來(lái)破壞選擇透性。作為此時(shí)使用的有機(jī)溶劑，使用了在上述實(shí)施例
1-2呈現(xiàn)最快的Y氨基丁酸生產(chǎn)速度的甲苯。分為處理甲苯的實(shí)驗(yàn)組和未處理甲苯的對(duì)照組，就處理甲苯的實(shí)驗(yàn)組而言，在微生物懸浮液添加0.5% (v/v)的甲苯后，在37°C、150rpm下攪拌了 10分鐘。在結(jié)束攪拌之后，用蒸餾水清洗一次菌體。將上述準(zhǔn)備的菌體懸浮于醋酸鹽緩沖溶液(pH4.6、200mM)之后，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛及1% (v/v)的谷氨酸鈉來(lái)測(cè)定了 Y氨基丁酸生產(chǎn)速度。其結(jié)果表明，處理甲苯的菌體的Y氨基丁酸生產(chǎn)活性為5.72 u mo I GABA/mg dcw/min,未處理甲苯的菌體的活性為 0.75 u mol GABA/mg dcw/min。1-4.根據(jù)緩沖溶液的pH得到提高的Y氨基丁酸的生產(chǎn)速度
培養(yǎng)具有谷氨酸脫羧酶的菌體，使用與實(shí)施例3提出的方法相同的方法在培養(yǎng)的菌體處理作為有機(jī)溶劑的甲苯之后，將已處理的菌體懸浮于各個(gè)緩沖溶液和滅菌水。在這里使用的緩沖溶液的濃度均為lOOmM，pH分別是4.5,6.0,7.0及8.0。使用醋酸來(lái)制備pH為4.5的緩沖溶液，使用磷酸來(lái)制備pH為6.0、7.0及8.0的緩沖溶液。在如上準(zhǔn)備的全細(xì)胞催化劑的懸浮溶液添加0.04mM添加量的5-磷酸吡哆醛，在這里添加10wt%的谷氨酸，開(kāi)始進(jìn)行反應(yīng)。隨后，測(cè)定、氨基丁酸的初期生產(chǎn)速度來(lái)分析了隨著PH而發(fā)生的Y氨基丁酸的生產(chǎn)速度的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，使用pH6的緩沖溶液，在初期pH為3.9時(shí)，呈現(xiàn)出最快的反應(yīng)速度，其值為116g GABA/L/h。1-5.使用處理有機(jī)溶劑的菌體來(lái)生產(chǎn)Y氨基丁酸培養(yǎng)具有谷氨酸脫羧酶的菌體來(lái)回收菌體。此時(shí)，回收的干燥菌體的量為3.6g。將菌體懸浮于滅菌水之后，添加0.5% (v/v)的甲苯，在37°C下攪拌了 10分鐘。一旦結(jié)束甲苯處理就進(jìn)行離心分離來(lái)回收菌體，利用蒸餾水來(lái)再清洗一次。將回收的菌體懸浮于2L的磷酸緩沖溶液(pH為6.0UOOmM)之后，投入到反應(yīng)器，在這里添加0.04mM的5-磷酸吡哆醒、Ikg的谷氨酸及50ppm的消泡劑(聚氧化烯乙二醇(Polyoxyalkylene Glycol)),開(kāi)始進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為30°C、200rpm。反應(yīng)開(kāi)始時(shí)pH為4.5，經(jīng)過(guò)8hr，殘留的谷氨酸的濃度減少為小于lwt%，此時(shí)pH為5.8。在此，添加鹽酸溶液來(lái)將pH減少到5.5之后，繼續(xù)反應(yīng)lhr，從而將殘余的谷氨酸都轉(zhuǎn)換為Y氨基丁酸。生成的Y氨基丁酸的總重量為690g，摩爾轉(zhuǎn)化率為98%，消耗時(shí)間總共為9hr。1-6.使用處理有機(jī)溶劑的菌體來(lái)生產(chǎn)高濃度Y氨基丁酸培養(yǎng)具有谷氨酸脫羧酶的菌體之后，在培養(yǎng)基投入0.25%(￥八)的甲苯，在30°〇下攪拌了 10分鐘。攪拌后通過(guò)離心分離回收了微生物，此時(shí)回收的干燥菌體的重量約為50g。將微生物懸浮于緩沖溶液或者蒸餾水之后，投入到反應(yīng)器，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛、8kg的谷氨酸及500ppm的消泡劑(聚氧 化烯乙二醇)，來(lái)開(kāi)始進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為30°C、200rpm,除此之外未對(duì)任何因素進(jìn)行調(diào)節(jié)。反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的pH為4.0，反應(yīng)經(jīng)過(guò)10hr，殘留谷氨酸濃度減少為小于lwt%，此時(shí)pH為5.87。隨后，添加鹽酸溶液，將pH減少至5.6之后，還反應(yīng)2hr，將殘有的谷氨酸都轉(zhuǎn)換為Y氨基丁酸(圖4)。生成的Y氨基丁酸的濃度為34wt%，摩爾轉(zhuǎn)化率為98%，消耗時(shí)間總共為12hr。1-7.利用反應(yīng)結(jié)束后回收的菌體來(lái)生產(chǎn)Y氨基丁酸通過(guò)與上述實(shí)施例1-2相同的方法，在3.6g的微生物處理0.5% (v/v)的甲苯之后，實(shí)施了將0.5kg的谷氨酸作為基質(zhì)的Y氨基丁酸的生成反應(yīng)。在結(jié)束反應(yīng)9小時(shí)后，在4000rpm、IOmin條件下執(zhí)行離心分離來(lái)回收微生物，如同上述實(shí)施例1，利用蒸餾水清洗該微生物，使該微生物懸浮于醋酸鹽緩沖溶液(pH4.6、200mM)之后，添加0.04mM的5-磷酸吡哆醛和1%( v/v)的谷氨酸鈉來(lái)測(cè)定Y氨基丁酸生產(chǎn)活性時(shí)，其值為4.80 iimol GABA/mgdcw/min。分離而回收利用于上述Y氨基丁酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)的菌體之后，將2g的回收菌體投入到具有新準(zhǔn)備的菌體的反應(yīng)器之后，重新進(jìn)行與實(shí)施例1-2相同的反應(yīng)時(shí)，轉(zhuǎn)換率與上述第一次反應(yīng)幾乎相同，總反應(yīng)時(shí)間縮短到6hr。實(shí)施例2:從培養(yǎng)基獲得Y氨基丁酸除去上述實(shí)施例1的培養(yǎng)液的菌體，進(jìn)行加熱處理后執(zhí)行脫色過(guò)程。通過(guò)離心分離來(lái)分離菌體之后，利用攪拌機(jī)，并用活性炭對(duì)分離后加熱處理的培養(yǎng)液進(jìn)行脫色處理。就脫色而言，在培養(yǎng)液添加了 1.0%_15.0% (活性炭重量/Y氨基丁酸重量)的活性炭。對(duì)加熱處理后生成的改性蛋白質(zhì)，與活性炭一起進(jìn)行了過(guò)濾分離，并進(jìn)行濃縮來(lái)使用于2-吡咯烷酮合成。其結(jié)果可見(jiàn)，如果活性炭量增加，則呈現(xiàn)出培養(yǎng)液的色也隨之徐徐透明的傾向，表I表示，在初期濃度30.0% ( y氨基丁酸重量/培養(yǎng)液體積)的培養(yǎng)液，利用活性炭來(lái)進(jìn)行脫色的情況下，隨著所使用的活性炭的濃度而不同的吡咯烷酮合成回收獲率，所使用的活性炭的濃度越增加，Y氨基丁酸的損失率也隨之增加，從而導(dǎo)致回收獲率減少，在活性炭不足時(shí)，由于未能充分除去色素雜質(zhì)，因而導(dǎo)致合成回收獲率減少。吡咯烷酮合成根據(jù)以下實(shí)施例3-1記載的方法來(lái)實(shí)施。表I
權(quán)利要求
1.一種2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為全細(xì)胞催化劑具有谷氨酸脫羧酶的微生物來(lái)制備4-氨基丁酸； 步驟(b)，通過(guò)過(guò)濾從上述培養(yǎng)基獲得上述4-氨基丁酸；以及 步驟(C)，將上述4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述微生物是由疏水性有機(jī)溶劑進(jìn)行預(yù)處理的微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述步驟(a)中的具有谷氨酸脫羧酶的微生物是大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述有機(jī)溶劑選自包含甲苯、氯仿、二甲苯、苯及環(huán)己烷的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制 備方法，其特征在于，上述步驟(a)在緩沖區(qū)pH3.0-pH8.0的范圍內(nèi)實(shí)施。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，在上述步驟(a)及步驟(b)之間還包括在上述培養(yǎng)基處理活性炭來(lái)除去培養(yǎng)基的色素的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，相對(duì)于上述培養(yǎng)基內(nèi)的4-氨基丁酸的重量％，添加1.5重量％ 4.0重量％的上述活性炭。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述步驟(b)之后還包括分離上述全細(xì)胞催化劑，并且再利用已分離的全細(xì)胞催化劑的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，在上述步驟(c)中利用的4-氨基丁酸未進(jìn)行預(yù)提純。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述步驟(c)包括以下小步驟: 步驟(c-1)，形成混合有4-氨基丁酸及2-吡咯烷酮的反應(yīng)組合物； 步驟(c-2)，對(duì)上述反應(yīng)組合物進(jìn)行加熱處理來(lái)實(shí)施內(nèi)酰胺環(huán)化反應(yīng)，來(lái)生成2-吡咯烷酮及水；以及 步驟(c-3)，分離上述2-吡咯烷酮。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述步驟(c-2)在減壓條件下實(shí)施。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述減壓條件為IOOmmHg 以下。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述減壓條件為IOmmHg 50mmHgo
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述步驟(c-2)在IlO0C _150°C的溫度條件下實(shí)施。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述步驟(c-2)在118 0C -148 °C的溫度條件下實(shí)施。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的2-吡咯烷酮的制備方法，其特征在于，上述步驟(c)通過(guò)減壓蒸餾來(lái)實(shí)施。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2-吡咯烷酮的制備方法，上述2-吡咯烷酮的制備方法呈現(xiàn)出2-吡咯烷酮 的最大99%的收獲率及最大99.8%的純度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用生物物質(zhì)的2-吡咯烷酮的制備方法，上述利用生物物質(zhì)的2-吡咯烷酮的制備方法包括以下步驟步驟(a)，在包含谷氨酸或者谷氨酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為全細(xì)胞催化劑具有谷氨酸脫羧酶的微生物來(lái)制備4-氨基丁酸；步驟(b)，通過(guò)過(guò)濾從上述培養(yǎng)基獲得上述4-氨基丁酸；以及步驟(c)，將上述4-氨基丁酸轉(zhuǎn)換為2-吡咯烷酮。本發(fā)明提供利用生物物質(zhì)來(lái)從谷氨酸或者谷氨酸鹽制備2-吡咯烷酮的一系列的工序。根據(jù)本發(fā)明，作為全細(xì)胞利用微生物來(lái)制備4-氨基丁酸，優(yōu)選地，能夠直接利用未經(jīng)如結(jié)晶化等復(fù)雜的提純過(guò)程的4-氨基丁酸來(lái)以高收獲率經(jīng)濟(jì)地制備2-吡咯烷酮。根據(jù)本發(fā)明，能夠以高收獲率及低生產(chǎn)費(fèi)用大量制備2-吡咯烷酮。本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)化2-吡咯烷酮的制備工序，適合于工業(yè)性規(guī)模的大量生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103189520SQ201180047545
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者樸東喆, 康基權(quán), 樸賢貞, 金瑞亨, 吳載榮 申請(qǐng)人:大象株式會(huì)社