專利名稱：制備富集文庫(kù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備包含允許鑒定至少一種結(jié)合至少一種靶標(biāo)的結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息的富集文庫(kù)(enriched library)的方法,其中所述特異結(jié)合實(shí)體已經(jīng)存在于體外展示文庫(kù)中。背景已經(jīng)開(kāi)發(fā)了展示技術(shù)以整合核酸的信息存儲(chǔ)和擴(kuò)增能力與其他化合物的功能活性。展示技術(shù)依賴于功能結(jié)合實(shí)體(即表型)和提供關(guān)于功能實(shí)體結(jié)構(gòu)信息的核酸序列(基因型)之間的關(guān)聯(lián)。注:雖然由于表型和基因型包含于同一分子(DNA或RNA)，核酸適體(nucleic acid aptamer)技術(shù)被認(rèn)為是一種展示技術(shù)。此類方法的優(yōu)點(diǎn)是可以構(gòu)建非常大型的文庫(kù)，并就功能實(shí)體的所需活性進(jìn)行探查。然后，具有所需活性的文庫(kù)成員可以與不具有所需活性的文庫(kù)成員分開(kāi)，從而形成富集文庫(kù)，其具有更大部分的具有所需活性的成員。這種方法被稱為選擇或富集。一些展示技術(shù)允許多輪選擇，這種情況下，一輪富集文庫(kù)被擴(kuò)增并用于準(zhǔn)備新的富集展示文庫(kù)和用于下一輪選擇，等等。隨后，富集文庫(kù)中的文庫(kù)成員的結(jié)構(gòu)可以通過(guò)其同族(cognate)核酸序列進(jìn)行鑒定，從而甚至允許從微量的材料進(jìn)行鑒定。本發(fā)明相關(guān)文庫(kù)可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)稱為“體外展示文庫(kù)”。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“體外展示文庫(kù)”應(yīng)當(dāng)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)來(lái)理解一即作為包含大量不同結(jié)合實(shí)體的文庫(kù)，其中每個(gè)結(jié)合實(shí)體附加到核酸分子，所述核酸分子包含允許鑒定所述結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息——即一旦人們知曉所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知曉附加到所述核酸分子的所述特定結(jié)合實(shí)體的結(jié)構(gòu)一附加到所述核酸分子(基因型)的所述結(jié)合實(shí)體(即表型)的結(jié)構(gòu)在本發(fā)明中被稱為B-結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)描述了大量制備這種體外展示文庫(kù)的不同的方法一本發(fā)明合適的實(shí)施例包括例如 EP1809743B1 (Vipergen),EP1402024B1 (Nuevolution),EP1423400B1 (DavidLiu)、Nature Chem.Biol.(2009), 5:647-654 (Clark)、W000/23458 (Harbury)、NatureMethods (2006),3 (7),561-570,2006 (Miller), Nat.Biotechnol.2004 ；22,568-574(Melkko),Nature.(1990)；346 (6287)，818-822 (Ellington)或 Proc Natl Acad Sci USA(1997).94 (23):12297-302 (Roberts)、TO06053571A2 (Rasmussen)。例如上述提到的現(xiàn)有技術(shù)所描述的一今天人們可以制備包含非常多(例如IO15種)特定結(jié)合實(shí)體(例如不同的化合物)的體外展示文庫(kù)。鑒于此——很明顯，能夠改進(jìn)這些文庫(kù)的選擇/富集步驟來(lái)制備富集文庫(kù)將是非常有趣的一例如更有效地能夠鑒定結(jié)合到感興趣的靶標(biāo)(例如醫(yī)學(xué)上重要的受體分子)的特定結(jié)合實(shí)體(例如化合物)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明附圖3顯示EP1809743Bl(Vipergen)所述的體外展示技術(shù)的一個(gè)實(shí)例-
如附圖3所示一該實(shí)例的選擇步驟通過(guò)固定靶標(biāo)(例如受體)于固相表面(例如珠或玻璃盤(pán))來(lái)進(jìn)行。不限于理論一就我們所知，本發(fā)明附圖3的實(shí)例可看做本發(fā)明相關(guān)體外展示技術(shù)現(xiàn)有技術(shù)(例如上述現(xiàn)有技術(shù))的實(shí)例——即就我們所知，在現(xiàn)有技術(shù)中存在于體外展示文庫(kù)的合適的結(jié)合實(shí)體的選擇通常在展示文庫(kù)結(jié)合事件之前或之后通過(guò)固定靶標(biāo)(例如受體)于固相載體(例如玻璃盤(pán)、柱、珠、硝酸纖維素膜、小室等)來(lái)實(shí)施。未結(jié)合物和低親和性結(jié)合物通常被洗脫下來(lái)，而富集結(jié)合物群體從固相載體上回收。在現(xiàn)有技術(shù)中已被描述的體外區(qū)室化(in vitro compartmentalization，IVC)用于查詢文庫(kù)中表型和基因型聯(lián)系的技術(shù)。這些現(xiàn)有技術(shù)可分成兩組:a) IVC用于促進(jìn)建立正確的表型和基因型聯(lián)系，其允許之后(區(qū)室破壞后)的功能選擇(例如特定靶標(biāo)結(jié)合)，和b) IVC用于促進(jìn)基于區(qū)室里表型的活性建立正確的表型和基因型聯(lián)系，即在區(qū)室里基因被轉(zhuǎn)錄和翻譯并且區(qū)室里所得蛋白的功能直接或間接用于分選、生存或擴(kuò)增。換句話說(shuō)，本發(fā)明相關(guān)所謂IVC現(xiàn)有技術(shù)——可描述為:組a)——其中表型活性在區(qū)室化步驟之后查詢；或組b)——其中表型活性在區(qū)室化步驟之中查詢?，F(xiàn)有技術(shù)屬于組a)的IVC實(shí)例:Bertschinger 等人，(2007) Protein Engineering, Design & Selectionvol.20n0.2pp.57 - 68;Miller OJj Bernath Kj Agresti JJ，Amitai Gj Kelly BTj MastrobattistaEj Taly V，Magdassi Sj Tawfik DS，Griffiths AD.Directed evolution by in vitrocompartmentalization.Nat Methods.2006Jul;3 (7):561_70;DoijN.和 Yanagawa，H.(1999) FEBS Lett.，457，227 - 230;和Yonezawaj M. ，Doij N.，Kawahashij Y.，Higashinakagawaj T.和 Yanagawa，H.(2003) Nucleic Acids Res.，31，ell8?，F(xiàn)有技術(shù)屬于組b)的IVC實(shí)例:Tawfikj D.S.和 Griffiths，A.D.(1998)Man-made cell-like compartments formolecular evolution.Nat.Biotechnol.，16，652—656;Ghadessy，F(xiàn).J.，Ong，J.L.和 Holliger，P.( 2001) Proc.Natl Acad.Sc1.USA, 98,4552 - 4557;Tay Y，Ho Cj Droge P，Ghadessy FJ.Selection of bacteriophagelambda integrases with altered recombination specificity by in vitrocompartmentalization.Nucleic Acids Res.2010Mar;38 (4):e25.Epub2009Dec4;Zheng Y，Roberts RJ.Selection of restriction endonucleases usingartificial cells.Nucleic Acids Res.2007;35 (11):e83.Epub2007;Mastrobattista E，Taly V，Chanudet Ej Treacy P，Kelly BTj GriffithsAD.High-throughput screening of enzyme libraries:1n vitro evolution of abeta-galactosidase by fluorescence-activated sorting of double emulsions.ChemBiol.2005Dec;12 (12):1291-300;Levy Mj Griswold KEj Ellington AD.Direct selection of trans-acting ligaseribozymes by in vitro compartmentalization.RNA.2005 Oct;11 (10): 1555-62.Epub2005 Aug30;Sepp A，Choo Y.Cell-free selection of zinc finger DNA-binding proteinsusing in vitro compartmentalization.J Mol Biol.2005 Nov25;354 (2):212-9.Epub2005 0ct3;Bernath K, Magdassi S, Tawfik DS.Directed evolution of protein inhibitorsof DNA-nucleases by in vitro compartmentalization (IVC) and nano-dropletdelivery.J Mol Biol.2005Feb4;345 (5): 1015-26.Epub2004Dec7?，F(xiàn)有技術(shù)進(jìn)一步的IVC實(shí)例可發(fā)現(xiàn)于:Bertschinger 等人，(2004) Protein Engineering, Design & Selectionvol.20n0.2pp.699 - 707;Chen Yu 等人，(November2008) Nucleic Acid Research, Vol.36, Nr.19, Pages:Article N0.E128;Hansen 等人.J.Am.Chem.Soc., 2009, 131 (3) , ppl322 - 1327。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題可以視為是提供改進(jìn)的基于體外展示的方法來(lái)制備富集文庫(kù)，其包含至少一種結(jié)合到感興趣的靶標(biāo)(例如藥學(xué)上相關(guān)的受體)的結(jié)合實(shí)體(例如化合物)。在許多情況下，治療學(xué)發(fā)展中最顯著的是，結(jié)合實(shí)體(藥物)的兩個(gè)參數(shù)是特別重要的，即效力(親和性)和解離速率(藥物:靶標(biāo)復(fù)合物的解離半衰期)。本發(fā)明為在這兩個(gè)重要的結(jié)合參數(shù)上富集的體外展示方法提供改進(jìn)的解決辦法。在其他情況下，對(duì)于結(jié)合特性的結(jié)合速率屬性是需要的。本發(fā)明為在對(duì)于結(jié)合特性的結(jié)合速率屬性上富集的體外 展示方法提供改進(jìn)的解決辦法。可以看出，解決辦法基于:(i):制備附加到核酸分子(基因型)的結(jié)合實(shí)體(即表型)的體外展示文庫(kù)一該步驟可按照制備這樣的體外展示文庫(kù)的已知現(xiàn)有技術(shù)制備；(ii):制備包含附加到核酸分子(基因型)的靶標(biāo)(即表型)的結(jié)構(gòu)一該步驟可按照制備這樣的結(jié)構(gòu)的已知現(xiàn)有技術(shù)制備；和其中，本發(fā)明所述的方法可以視為特征在于:(iii):結(jié)合步驟在溶液(例如在含水條件下)中進(jìn)行；(iv):使用合適的體外區(qū)室化系統(tǒng)(例如油包水乳液系統(tǒng))產(chǎn)生比靶標(biāo)分子更多的單獨(dú)的區(qū)室；(V):融合共區(qū)室化的靶標(biāo)和結(jié)合實(shí)體基因型；(vi):去區(qū)室化；獲得融合的基因型的富集體(體外展示文庫(kù)中的陽(yáng)性結(jié)合物比未結(jié)合物具備更高的融合傾向)；和(vii):可選地，例如純化和/或優(yōu)選擴(kuò)增融合的基因型?；诒景l(fā)明的詳細(xì)描述和公知常識(shí)——本領(lǐng)域技術(shù)人員可以多種不同的方式執(zhí)行步驟(iii)至步驟(vi )。步驟(vii)是可選步驟一如本發(fā)明所述人們一旦獲得步驟(Vi)的富集文庫(kù)即可按照現(xiàn)有技術(shù)以不同方式使用該文庫(kù)一例如富集文庫(kù)可被看做富集體外展示文庫(kù)，例如可用于第二輪的選擇/富集或人們可以直接從步驟(vi)的富集文庫(kù)鑒定感興趣的特定結(jié)合實(shí)體的結(jié)構(gòu)。正如上面所討論的一本發(fā)明相關(guān)所謂的IVC現(xiàn)有技術(shù)一可描述為:組a)—其中表型活性在區(qū)室化步驟之后查詢；或組b)——其中表型活性在區(qū)室化步驟之中查詢。顯而易見(jiàn)的，從上述和如本發(fā)明進(jìn)一步討論的一本發(fā)明所述的方法從概念上與這樣所謂的IVC現(xiàn)有技術(shù)不同一例如基于第一方面的步驟(iii)被查詢的表型活性，其在第一方面的區(qū)室化步驟(iv)之前。一種簡(jiǎn)單的方式來(lái)解釋本發(fā)明所述新方法的原理是，展示文庫(kù)的未結(jié)合物隨機(jī)分布于區(qū)室并因此以隨機(jī)的方式與靶標(biāo)共區(qū)室化，其頻率基于區(qū)室的數(shù)量和靶標(biāo)分子的數(shù)量的比例。相反，基于結(jié)合活性，結(jié)合物會(huì)與靶標(biāo)分子共區(qū)室化——獨(dú)立于區(qū)室的數(shù)量和靶標(biāo)分子的數(shù)量的比例。因此，當(dāng)區(qū)室的數(shù)量和靶標(biāo)分子的數(shù)量的比例大于I時(shí)結(jié)合物的富集得以實(shí)現(xiàn)——比例越高富集得越高。本發(fā)明的附圖1和2提供本發(fā)明所述新方法的示例性實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例1和2提供本發(fā)明相關(guān)的例如結(jié)合實(shí)體和感興趣的靶標(biāo)的數(shù)量的實(shí)例——可以從實(shí)施例1和2的結(jié)論看出——人們可以通過(guò)本發(fā)明所述的方法從文庫(kù)中獲得例如1000倍富集的結(jié)合物。因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種方法，一種制備富集文庫(kù)的方法，所述富集文庫(kù)包含允許鑒定至少一種結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息，所述結(jié)合實(shí)體結(jié)合至少一種靶標(biāo)，其中所述特定結(jié)合實(shí)體已存在于體外展示文庫(kù)并且其中所述方法包括下述步驟:(i):制備至少100種不同結(jié)合`實(shí)體(Bn (n=100或更多)的體外展示文庫(kù)，其中每個(gè)結(jié)合實(shí)體附加到核酸分子，所述核酸分子包括允許鑒定結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息——即人們一旦知曉所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知曉附加到所述核酸分子的所述特定結(jié)合實(shí)體的結(jié)構(gòu)一附加到所述核酸分子(基因型)的所述結(jié)合實(shí)體(即表型)的所述結(jié)構(gòu)本發(fā)明稱為B-結(jié)構(gòu)。(ii):制備具有附加到核酸分子的至少一種靶標(biāo)Tn (n=l或更多)的核酸分子，所述核酸分子包括允許鑒定所述特定靶標(biāo)的特定核酸序列信息，其中所述靶標(biāo)能夠結(jié)合存在于步驟(i)的文庫(kù)的至少一種結(jié)合實(shí)體一附加到所述核酸分子(基因型)的靶標(biāo)(即表型)的結(jié)構(gòu)本文中稱為T(mén)-結(jié)構(gòu)；并且其中所述方法特征在于:(iii):在結(jié)合條件下，將包括X (X是大于IO4的數(shù))個(gè)步驟(i)的文庫(kù)的B-結(jié)構(gòu)的溶液與包括Y (Y是大于IO2的數(shù))個(gè)步驟(ii)的T-結(jié)構(gòu)的溶液混合，所述條件是含有能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)與含有不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比更有效地結(jié)合相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)，并且其中人們得到至少一種結(jié)合實(shí)體與至少一種靶標(biāo)的結(jié)合，從而生成包含B-結(jié)構(gòu)結(jié)合到T-結(jié)構(gòu)的復(fù)合物(本文中稱為Bgg5T-結(jié)構(gòu))；(iv):應(yīng)用體外區(qū)室化系統(tǒng)——在結(jié)合條件下，所述條件是含有能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)與包括不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比更有效地結(jié)合相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)——其中，在B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和Bgg5T-結(jié)構(gòu)隨機(jī)進(jìn)入單獨(dú)的區(qū)室的條件下，所述區(qū)室化系統(tǒng)包括的單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少2倍；和
(V):融合同時(shí)存在于相同單獨(dú)的區(qū)室里的B-結(jié)構(gòu)和T-結(jié)構(gòu)的核酸分子一即融合所述B-結(jié)構(gòu)的核酸分子至所述T-結(jié)構(gòu)的核酸分子——這個(gè)結(jié)構(gòu)本文中稱為BT8^-結(jié)構(gòu)，所述BT融合-結(jié)構(gòu)包括允許鑒定步驟(i )所述結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息和允許鑒定步驟(ii)所述特定靶標(biāo)的特定核酸序列信息；和(vi):組合步驟(V)的所述單獨(dú)的區(qū)室的內(nèi)容物，以得到BTa合-結(jié)構(gòu)文庫(kù)，該步驟在以下條件下進(jìn)行:其中沒(méi)有B-結(jié)構(gòu)和T-結(jié)構(gòu)的核酸分子的融合——即在步驟(V)中沒(méi)有生成任何新的BT8^-結(jié)構(gòu)，其中所述文庫(kù)是與源自靶標(biāo)與結(jié)合實(shí)體的未結(jié)合對(duì)的BTa
結(jié)構(gòu)相比，為源自靶標(biāo)與結(jié)合實(shí)體的結(jié)合對(duì)的BT8^-結(jié)構(gòu)種類的富集文庫(kù)。本發(fā)明所述的第一方面的所述方法可稱為通過(guò)共區(qū)室化的富集(ECC)。本發(fā)明所述的ECC方法的優(yōu)點(diǎn)在于重要結(jié)合特征的富集可為分離而優(yōu)化一因?yàn)?br> ECC是同質(zhì)性測(cè)試(homogenous assay)-祀標(biāo)沒(méi)有固定于固相載體?，F(xiàn)有技術(shù)方法是
異質(zhì)性的——依賴于靶標(biāo)固定于固相載體(例如珠、柱、小室、塑料、濾器等)。與同質(zhì)性測(cè)試相比，異質(zhì)性測(cè)試是極其難于控制的，因?yàn)槔缬H和力效應(yīng)、涂層密度和固相載體本身對(duì)測(cè)試的干擾。正如上面所討論的，在本發(fā)明相關(guān)體外展示技術(shù)的現(xiàn)有技術(shù)(例如上述提到的現(xiàn)有技術(shù))里一在體外展示文庫(kù)里選擇存在的合適的結(jié)合實(shí)體在現(xiàn)有技術(shù)中通常在所述展示結(jié)合事件之前或之后通過(guò)固定靶標(biāo)(例如受體)于固相載體(例如玻璃盤(pán)、柱、珠、硝酸纖維素濾器、小室等)來(lái)進(jìn)行。未結(jié)合物和低親和力結(jié)合物通常被洗脫掉，而富集的結(jié)合物群體從固相載體上回收。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，當(dāng)本發(fā)明上述相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)方法“依賴于靶標(biāo)固定于固相載體”可被本領(lǐng)域技術(shù)人員以下述方式所理解，選擇合適的結(jié)合實(shí)體依賴于這種固定靶標(biāo)于固相載體作為獲得選擇合適的結(jié)合實(shí)體的要素。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，第一方面所述的方法不是依賴于靶標(biāo)固定于固相載體的這樣的現(xiàn)有技術(shù)方法，因?yàn)樗鼋Y(jié)合實(shí)體的選擇是基于第一方面的步驟(iv)所要求的所述Bgg5T-結(jié)構(gòu)分離進(jìn)入所述單獨(dú)的區(qū)室的?；谏鲜鲇懻摵妥鳛楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所理解的一在第一方面的所述方法中人們可以從理論上想象一種情形，其中所述靶標(biāo)步驟(ii)的T-結(jié)構(gòu)是例如包含珠的。理論上可以是T-結(jié)構(gòu)，其中靶標(biāo)結(jié)合至珠并且包含允許鑒定步驟(ii)的所述T-結(jié)構(gòu)的特定靶標(biāo)的所述特定核酸序列信息的所述特定核酸分子然后也結(jié)合至珠。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是——這種包含珠的特別的T-結(jié)構(gòu)將不會(huì)改變第一方面的所述方法不是一種方法的事實(shí)，其中選擇合適結(jié)合實(shí)體這種祀標(biāo)固定于固相載體。基于上述討論和在上下文中為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，所述第一方面的所述方法可被看做一種方法，其意味著所述B T-結(jié)構(gòu)(即所述靶標(biāo)結(jié)合實(shí)體復(fù)合物)在所述第一方面的步驟(iv)的所述單獨(dú)的/分離的區(qū)室里保持懸浮于溶液中。ECC允許在分離狀態(tài)中優(yōu)化結(jié)合實(shí)體結(jié) 合靶標(biāo)的主要結(jié)合特征。例如效力(親和性)、關(guān)聯(lián)速率(結(jié)合速率)或結(jié)合實(shí)體和靶標(biāo)的解離半衰期(解離速率)?；谟H和力的選擇通過(guò)使用平衡條件實(shí)現(xiàn)并由所述混合步驟(結(jié)合步驟)中的所述靶標(biāo)濃度控制，即所述展示文庫(kù)中Kd比所述靶標(biāo)濃度小10倍的的結(jié)合實(shí)體的90%的分子是靶標(biāo)結(jié)合的，而Kd與所述靶標(biāo)濃度相同的結(jié)合實(shí)體的50%的分子是靶標(biāo)結(jié)合的，以及Kd比所述靶標(biāo)濃度小10倍的結(jié)合實(shí)體的10%的分子是靶標(biāo)結(jié)合的。因此，親和富集很容易通過(guò)所述混合步驟的所述靶標(biāo)濃度進(jìn)行控制。本發(fā)明一個(gè)單獨(dú)的方面涉及所述第一方面的步驟(vi)的富集文庫(kù)并且其可通過(guò)所述第一方面的所述方法或本發(fā)明所述第一方面的相關(guān)實(shí)施方案獲得。本發(fā)明的實(shí)施方案描述如下，僅通過(guò)實(shí)施例的方式。


凰1:本發(fā)明所述方法的原理的原理的示例性實(shí)施例。Ml:本發(fā)明所述方法的原理的原理的示例性實(shí)施例——它是一個(gè)示例性實(shí)施例其中乳狀液PCR用于所述第一方面的所述融合步驟(V )。此處顯示的是描述于EP1809743B1 (Vipergen)中的體外展示技術(shù)的實(shí)施例——可從圖3中看出——這個(gè)實(shí)施例的所述選擇步驟是通過(guò)固定靶標(biāo)(例如受體)于固體表面(例如珠或玻璃盤(pán))實(shí)施的。圖4-7:這些圖是本發(fā)明實(shí)施例中進(jìn)一步討論的。發(fā)明詳述體外展示文庫(kù)——第一方面的步驟(i )術(shù)語(yǔ)“體外展示文庫(kù)”應(yīng)當(dāng)按照現(xiàn)有技術(shù)理解一即作為包括大量不同結(jié)合實(shí)體的文庫(kù)，其中每個(gè)結(jié)合實(shí)體附加到核酸分子并且所述核酸分子包括允許鑒定所述結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息一即人們一旦知曉所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知曉附加到所述核酸分子的所述特定結(jié)合實(shí)體的結(jié)構(gòu)一附加到所述核酸分子(基因型)的所述結(jié)合實(shí)體(即表型)的所述結(jié)構(gòu)本發(fā)明稱為B-結(jié)構(gòu)。如本發(fā)明所討論的一現(xiàn)有技術(shù)描述了大量制備這種體外展示文庫(kù)的不同方法——即步驟(i)的體外展示文庫(kù)。換句話說(shuō)，今天正確制備附加到所述核酸分子(基因型)的所述結(jié)合實(shí)體(即表型)的結(jié)構(gòu)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)工作——即所述結(jié)構(gòu)本發(fā)明稱為“B-結(jié)構(gòu)”。正如本領(lǐng)域已知的——結(jié)合實(shí)體(即表型)可通過(guò)例如共價(jià)結(jié)合或例如高親和性非共價(jià)結(jié)合被附加到所述核酸分子(基因型)。本發(fā)明優(yōu)選的是所述結(jié)合實(shí)體(即表型)通過(guò)共價(jià)結(jié)合被附加到所述核酸分子(基因型)。步驟(i )的體外展示文庫(kù)包括大量不同的B-結(jié)構(gòu)一即上述的制備步驟(i )的體外展示文庫(kù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)工作。本發(fā)明中合適的實(shí)例包括例如EP1809743B1 (Vipergen)，EP1402024B1(Nuevolution),EP1423400B1 (David Liu), Nature Chem.Biol.(2009)，5:647-654(Clark),W000/23458 (Harb ury),Nature Methods (2006),3 (7)，561-570，2006(Miller) , Nat.Biotechnol.2004; 22, 568 - 574 (Melkko)，Nature.( 1990) ; 346(6287)，818-822 (Ellington)或 Proc Natl Acad Sci USA (1997).94 (23): 12297 - 302(Roberts)。換句話說(shuō)，第一方面的步驟(i)的所述體外展示文庫(kù)可通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)所述的大量方式制備得到。不限于理論一本發(fā)明合適的體外展示文庫(kù)技術(shù)的實(shí)例包括DNA編碼化學(xué)文庫(kù)技術(shù)、適體(Aptamer)技術(shù)、RNA/DNA展示技術(shù)例如CIS展示、核糖體展示、mRNA展示或珠展示系統(tǒng)(使用核酸用于編碼)。如現(xiàn)有技術(shù)所述(參見(jiàn)例如EP1809743B1 (Vipergen))——所述B-結(jié)構(gòu)的所述核酸分子可以是例如PNA、LNA、RNA、DNA或它們的組合。優(yōu)選地，所述B-結(jié)構(gòu)的所述核酸分子是DNA。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)可為雙鏈核酸分子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)可為至少0%雙鏈(即單鏈)，可為至少10%雙鏈、至少20%雙鏈、至少30%雙鏈、至少40%雙鏈、至少50%雙鏈、至少60%雙鏈、至少70%雙鏈、至少80%雙鏈、至少90%雙鏈或100%雙鏈。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含一個(gè) PCR引發(fā)位點(diǎn)或其一部分。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含兩個(gè)PCR引發(fā)位點(diǎn)或其一部分。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含至少三個(gè)PCR引發(fā)位點(diǎn)或其一部分。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，PCR引發(fā)位點(diǎn)的部分包括至少5個(gè)核酸、至少6個(gè)核苷酸、至少7個(gè)核苷酸、至少8個(gè)核苷酸、至少9個(gè)核苷酸、至少10個(gè)核苷酸、至少11個(gè)核苷酸、至少12個(gè)核苷酸、至少13個(gè)核苷酸、至少14個(gè)核苷酸、至少15個(gè)核苷酸、至少16個(gè)核苷酸、至少17個(gè)核苷酸、至少18個(gè)核苷酸、至少19個(gè)核苷酸或至少20個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含與所述B結(jié)構(gòu)的所述基因型的單鏈懸反向互補(bǔ)的單鏈懸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含與所述B結(jié)構(gòu)的所述基因型的單鏈懸反向互補(bǔ)的單鏈懸。所述單鏈懸可優(yōu)選為I個(gè)核苷酸、2個(gè)核苷酸、3個(gè)核苷酸、4個(gè)核苷酸、5個(gè)核苷酸、6個(gè)核苷酸、7個(gè)核苷酸、8個(gè)核苷酸、9個(gè)核苷酸或10個(gè)核苷酸長(zhǎng)。結(jié)合實(shí)體所述結(jié)合實(shí)體可為感興趣的任何合適的結(jié)合實(shí)體。第一方面步驟(i)的記載“至少100種不同的結(jié)合實(shí)體(Bn (n=100或更多)”。在實(shí)踐中，在步驟(i)的文庫(kù)中可存在更多倍多種不同結(jié)合實(shí)體——例如至少104、至少IO5或至少IO6種不同結(jié)合實(shí)體——即η=至少ΙΟ4、η=至少IO5或η=至少106。因此，理論上，其中所述文庫(kù)包括確切的IO4種不同結(jié)合實(shí)體一此處可將這個(gè)表達(dá)為 Bn (η=104)*Β104。不限于理論地，可能很難制備有超過(guò)102°種不同結(jié)合實(shí)體的文庫(kù)。合適的實(shí)例可以是其中所述結(jié)合實(shí)體是選自下列組成的組中的至少一種結(jié)合實(shí)體:蛋白質(zhì)、多肽、核酸和化合物(優(yōu)選平均分子量MW低于10000道爾頓的小化合物，更優(yōu)選平均分子量MW低于5000道爾頓，更加優(yōu)選平均分子量MW低于1000道爾頓)。本發(fā)明相關(guān)結(jié)合實(shí)體(例如化合物)的合適的實(shí)例可被發(fā)現(xiàn)于現(xiàn)有技術(shù)一參見(jiàn)例如 EP1809743B1 (Vipergen) , EP1402024B1 (Nuevolution) , EP1423400B1 (DavidLiu), Nature Chem.Biol.(2009),5:647-654 (Clark), W000/23458 (Harbury), NatureMethods (2006),3 (7) , 561-570, 2006 (Miller) , Nat.Biotechnol.2004; 22, 568 - 574(Melkko) ,Nature.(1990) ; 346 (6287) , 818-822 (Ellington)或 Proc Natl Acad SciUSA (1997).94 (23):12297 - 302 (Roberts)?？傊?，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉在上下文中可感興趣的大量不同可能的結(jié)合實(shí)體。第一方面的步驟(ii)如本發(fā)明所述一祀標(biāo)應(yīng)當(dāng)能夠結(jié)合步驟(i)的所述文庫(kù)中存在的至少一種結(jié)合實(shí)體一否則它不是一個(gè)能用于鑒定結(jié)合至少一種靶標(biāo)的特定結(jié)合實(shí)體的合適的靶標(biāo)?；谏鲜鲇懻撘唤裉煺_附加靶標(biāo)(即表型)到核酸分子(基因型)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)工作并從而制備附加到所述核酸分子(基因型)的所述靶標(biāo)(即表型)的結(jié)構(gòu)——即在本發(fā)明中稱為“τ-結(jié)構(gòu)”。換句話說(shuō)，人們可以基于例如上面所討論的制備步驟(i)的所述體外展示文庫(kù)的相同的現(xiàn)有技術(shù)制備本發(fā)明相關(guān)“T-結(jié)構(gòu)”。正如本領(lǐng)域已知的——靶標(biāo)(即表型)可通過(guò)例如共價(jià)結(jié)合或例如高親和性非共價(jià)結(jié)合被附加到所述核酸分子(基因型)。本發(fā)明中可優(yōu)選所述靶標(biāo)(即表型)通過(guò)共價(jià)結(jié)合附加到所述核酸分子(基因型)。

第一方面步驟(i)記載“至少一種靶標(biāo)Tn (n=l或更多)”。如本發(fā)明所述——本發(fā)明所述方法的優(yōu)點(diǎn)是人們可以有效和快速的方式同時(shí)篩選可能結(jié)合例如2種或更多靶標(biāo)的結(jié)合實(shí)體。例如一所述靶標(biāo)可以是2種不同受體分子，然后本發(fā)明所述方法可同時(shí)鑒定結(jié)合受體之一的一種結(jié)合實(shí)體和結(jié)合另一種受體的另一種結(jié)合實(shí)體。在上面的實(shí)施例(2種不同例如受體靶標(biāo))里我們可以有一種情況，其中所述靶標(biāo)Tn (n=2)或可選地表述為T(mén)2。基于上述討論一可能相關(guān)的是在步驟(ii)中有至少2種不同靶標(biāo)(即Tn (n=2或更多)、或在步驟(ii)中有至少3種不同靶標(biāo)(即Tn (n=3或更多)、或在步驟(ii)中有至少10種不同祀標(biāo)(即Tn (n=10或更多)、或在步驟(ii)中有至少100種不同祀標(biāo)(即Tn(n=100或更多)。不限于理論的，很難在步驟(ii)中有多于100.000種不同靶標(biāo)一即超過(guò)100.000種不同T-結(jié)構(gòu)。如現(xiàn)有技術(shù)(參見(jiàn)例如EP1809743B1 (Vipergen))所述——所述T-結(jié)構(gòu)的所述核酸分子可以是例如PNA、LNA、RNA、DNA或它們的組合。優(yōu)選地，所述T-結(jié)構(gòu)的所述核酸分子是DNA。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可為至少5個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少30個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少40個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少60個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少70個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少80個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少90個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少200個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少300個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少400個(gè)核苷酸長(zhǎng)或至少500個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可為雙鏈核酸分子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可為至少5個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少10個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少20個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少30個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少40個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少50個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少60個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少70個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少80個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少90個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少100個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少200個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少300個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)、至少400個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)或至少500個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可為至少0%雙鏈(即單鏈)，可為至少10%雙鏈、至少20%雙鏈、至少30%雙鏈、至少40%雙鏈、至少50%雙鏈、至少60%雙鏈、至少70%雙鏈、至少80%雙鏈、至少90%雙鏈或100%雙鏈。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含一個(gè)PCR引發(fā)位點(diǎn)或其一部分。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含兩個(gè)PCR引發(fā)位點(diǎn)或其一部分。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含至少三個(gè)PCR引發(fā)位點(diǎn)或其一部分。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,PCR弓丨發(fā)位點(diǎn)包括至少5個(gè)核苷酸、至少6個(gè)核苷酸、至少7個(gè)核苷酸、至少8個(gè)核苷酸、至少9個(gè)核苷酸、至少10個(gè)核苷酸、至少11個(gè)核苷酸、至少12個(gè)核苷酸、至少13個(gè)核苷酸、至少14個(gè)核苷酸、至少15個(gè)核苷酸、至少16個(gè)核苷酸、至少17個(gè)核苷酸、至少 18個(gè)核苷酸、至少19個(gè)核苷酸或至少20個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含與所述T結(jié)構(gòu)的所述基因型的單鏈懸反向互補(bǔ)的單鏈懸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含與所述T結(jié)構(gòu)的所述基因型的單鏈懸反向互補(bǔ)的單鏈懸。所述單鏈懸可優(yōu)選為I個(gè)核苷酸、2個(gè)核苷酸、3個(gè)核苷酸、4個(gè)核苷酸、5個(gè)核苷酸、6個(gè)核苷酸、7個(gè)核苷酸、8個(gè)核苷酸、9個(gè)核苷酸或10個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含對(duì)每個(gè)靶標(biāo)分子特異的獨(dú)特序列(獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)一UMI )。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含對(duì)每種靶標(biāo)分子特異的獨(dú)特序列(獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)一UMI)，其由至少16個(gè)N (N=A, C、G或T)、至少17個(gè)N、至少18個(gè)N、至少19個(gè)N、至少20個(gè)N、至少21個(gè)N、至少22個(gè)N、至少23個(gè)N、至少24個(gè)N、至少25個(gè)N、至少26個(gè)N、至少27個(gè)N、至少28個(gè)N、至少29個(gè)N或至少30個(gè)N組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含對(duì)每種靶標(biāo)分子特異的獨(dú)特序列(獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)一UMI)，其由連續(xù)的序列組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含對(duì)每種靶標(biāo)分子特異的獨(dú)特序列(獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)一UMI)，其由不連續(xù)的序列組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含不同于第二靶標(biāo)的第二基因型序列的第一序列(允許多重PCR(multiplexing))。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)可包含不同于第二靶標(biāo)的第二基因型序列的第一序列(允許多重PCR)，其中所述第一和第二靶標(biāo)基因型包含不同PCR引發(fā)位點(diǎn)。麵所述靶標(biāo)可以是任何感興趣的合適的靶標(biāo)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中——促進(jìn)鑒定所需性質(zhì)的結(jié)合實(shí)體的富集的特定富集方法包括不限于:富集附加靶標(biāo)分子的核酸。這種方法中所述靶標(biāo)分子是例如DNA、RNA、蛋白、碳水化合物、有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。正如現(xiàn)有技術(shù)已知的一合適的靶標(biāo)可以存在于例如人體的例如受體分子并且人們將會(huì)對(duì)鑒定能夠結(jié)合所述受體的結(jié)合實(shí)體(例如化合物)感興趣。按照現(xiàn)有技術(shù)一合適的實(shí)例可為其中所述靶標(biāo)是DNA、RNA、蛋白、碳水化合物、有機(jī)或無(wú)機(jī)分子或其片段。按照現(xiàn)有技術(shù)一合適的實(shí)施例可為其中所述靶標(biāo)是自身抗原、細(xì)菌蛋白、血蛋白、細(xì)胞粘附蛋白、細(xì)胞因子、細(xì)胞骨架蛋白、DNA-結(jié)合蛋白、發(fā)育蛋白、工程蛋白、酶、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、GTP-結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)劑、糖蛋白、生長(zhǎng)因子、熱休克蛋白、脂蛋白、膜蛋白、金屬蛋白、馬達(dá)蛋白、磷蛋白、朊病毒、蛋白質(zhì)復(fù)合物、蛋白結(jié)構(gòu)域、RNA-結(jié)合蛋白、受體、重組蛋白質(zhì)、種子貯藏蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄`共調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、病毒蛋白或其片段。總之，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉在上下文中可感興趣的大量不同可能的靶標(biāo)。第一方面的步驟(iii):在本發(fā)明圖1的所述示例性實(shí)施例中一該步驟(iii)對(duì)應(yīng)于步驟“I結(jié)合”。正如上面所討論的-步驟(iii)記載:“混合包括X (X是大于IO4的數(shù))個(gè)步驟(i)的文庫(kù)的B-結(jié)構(gòu)的溶液”術(shù)語(yǔ)相關(guān)于B-結(jié)構(gòu)的數(shù)量的“X”應(yīng)當(dāng)理解為步驟(i)的文庫(kù)的B-結(jié)構(gòu)的總數(shù)量。例如-如果所述文庫(kù)包括100種不同結(jié)合實(shí)體(Bn (n=100))并且每種所述100
種不同B-結(jié)構(gòu)有100個(gè)拷貝，那么數(shù)量“X”等于100X 100=104。在實(shí)踐中，數(shù)量X可以高很多倍一例如，如果所述文庫(kù)包括IO6種不同結(jié)合實(shí)體[Bn Cn=IO6)]并且每種所述IO6種不同B-結(jié)構(gòu)有IO4個(gè)拷貝，那么數(shù)量“X”等于IO6XIO4=IOi0o正如上面所討論的-步驟(iii)記載:“包括Y (Y是大于IO2的數(shù))個(gè)步驟(ii)的T-結(jié)構(gòu)的溶液”術(shù)語(yǔ)相關(guān)于T-結(jié)構(gòu)的數(shù)量的“Y”應(yīng)當(dāng)理解為步驟(ii)的文庫(kù)的T-結(jié)構(gòu)的總數(shù)量。例如一如果步驟(ii)僅有I種靶標(biāo)[Tn (n=l)]并且每種所述T-結(jié)構(gòu)有IO2個(gè)拷貝，那么數(shù)量“Y”等于I XlO2=IO2t5
正如上面所討論的一人們可以有例如2種不同靶標(biāo)(例如兩種不同受體分子)一在這種情況下步驟(ii)可以有兩種靶標(biāo)[Tn (n=2)]并且如果每種所述兩種不同T-結(jié)構(gòu)有IO2個(gè)拷貝，那么數(shù)量“Y”等于2X 102=200。在實(shí)踐中，人們可以有相關(guān)T-結(jié)構(gòu)特別多的拷貝——這種情況的原因是人們可能想要相關(guān)T-結(jié)構(gòu)的大量拷貝以提高T-結(jié)構(gòu)上所述靶標(biāo)結(jié)合B-結(jié)構(gòu)的所述結(jié)合實(shí)體的可能性。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有至少10°、至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少IO15或至少IO16個(gè)感興趣的T-結(jié)構(gòu)拷貝。本發(fā)明所述的ECC方法的優(yōu)點(diǎn)在于重要結(jié)合特征的富集可為分離而優(yōu)化一因?yàn)?br> ECC是同質(zhì)性測(cè)試(homogenous assay)-祀標(biāo)沒(méi)有固定于固相載體。現(xiàn)有技術(shù)方法是
異質(zhì)性的——依賴于靶標(biāo)固定于固相載體(例如珠、柱、小室、塑料、濾器等)。與同質(zhì)性測(cè)試相比，異質(zhì)性測(cè)試是極其難于控制的，因?yàn)槔缬H和力效應(yīng)、涂層密度和固相載體本身對(duì)測(cè)試的干擾。ECC允許在分離狀態(tài)中優(yōu)化結(jié)合實(shí)體結(jié)合靶標(biāo)的主要結(jié)合特征。例如效力(親和性)、關(guān)聯(lián)速率(結(jié)合速率)或結(jié)合實(shí)體和靶標(biāo)的解離半衰期(解離速率)?；谟H和力的選擇通過(guò)使用平衡條件實(shí)現(xiàn)并由所述混合步驟(結(jié)合步驟)中的所述靶標(biāo)濃度控制，即所述展示文庫(kù)中Kd比所述靶標(biāo)濃度小10倍的結(jié)合實(shí)體的90%的分子是靶標(biāo)結(jié)合的，而與所述靶標(biāo)濃度相同Kd的結(jié)合實(shí)體的50%的分子是靶標(biāo)結(jié)合的，以及Kd比所述靶標(biāo)濃度小10倍的結(jié)合實(shí)體的10%的分子是靶標(biāo)結(jié)合的。因此，親和富集很容易通過(guò)所述混合步驟的所述靶標(biāo)濃度進(jìn)行控制。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中——在所述“混合步驟(iii)”中T-結(jié)構(gòu)的濃度為至少1(Γ15Μ、至少1(Γ14Μ、至少1(Γ13Μ、至少1(Γ12Μ、至少1(ΓηΜ、至少ΙΟ,Μ、至少1(Γ9Μ、至少1(Γ8Μ、至少1(Γ7Μ、至少1(Γ6Μ、至少1(Γ5Μ、至少1(Γ4Μ或至少1(Γ3Μ。另外，基于關(guān)聯(lián)速率的選擇通過(guò)控制混合步驟(iii)允許的時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)一因此，所述“混合步驟”可以比達(dá)到結(jié)合平衡條件所需的時(shí)間更短的時(shí)間周期來(lái)進(jìn)行。步驟(iii)記載:“在結(jié)合條件下，所述條件是含有能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)與含有不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比更有效地結(jié)合相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)，并且其中人們得到至少一種結(jié)合實(shí)體與至少一個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合，從而生成包含B-結(jié)構(gòu)結(jié)合到T-結(jié)構(gòu)的復(fù)合物(本文中稱為Bgg5T-結(jié)構(gòu))”術(shù)語(yǔ)“更有效地結(jié)合”應(yīng)當(dāng)按照普通實(shí)踐理解，例如更高的親和力、更快的結(jié)合速率或更低的解離速率。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的——在上下文中在條件下執(zhí)行步驟(iii)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)工作，其中人們得到這個(gè)“更有效地結(jié)合”的效果。例如一人們可以通過(guò)例如使用在步驟(iii )的所述結(jié)合條件下B和T-結(jié)構(gòu)基因型基本上不結(jié)合(例如通過(guò)堿基對(duì)雜交)很 容易地獲得這種“更有效地結(jié)合”效果——對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是這可例如通過(guò)使用例如沒(méi)有或有非常小的單鏈堿基重疊作為B和T-結(jié)構(gòu)的基因型的雙鏈DNA來(lái)獲得。
優(yōu)化步驟(iii)的所述結(jié)合條件以獲得所需的步驟(iii)的“更有效地結(jié)合”對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)工作。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的——本發(fā)明相關(guān)優(yōu)化參數(shù)可以是例如離子強(qiáng)度、溫度
坐寸ο因此，在任何本發(fā)明相關(guān)實(shí)際情況中一無(wú)論本領(lǐng)域技術(shù)人員(在例如所述結(jié)合條件的適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)調(diào)整之后)在步驟(iii)的結(jié)合條件下工作與否，他將不會(huì)有任何合理的疑問(wèn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(iii)在結(jié)合條件下進(jìn)行，其中包含能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)，比包含不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)的包含結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)可以10倍(更優(yōu)選100倍、更加優(yōu)選1000倍)更有效結(jié)合相應(yīng)T-結(jié)構(gòu)。步驟(iii_b)-稀釋步驟-優(yōu)選實(shí)施方案:在本發(fā)明圖1的所述示例性實(shí)施例中一該可選步驟(ii1-b)對(duì)應(yīng)于所述步驟“2稀釋”。所述混合步驟(iii)可優(yōu)選隨后的稀釋步驟一本發(fā)明術(shù)語(yǔ)稱為步驟(ii1-b)并在所述第一方面的步驟(iv)之前執(zhí)行。因此，在所述第一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包括額外的在所述第一方面的步驟(iv)之前執(zhí)行的步驟(ii1-b),
包括:(ii1-b):在結(jié)合條件下稀釋步驟(iii)的所述溶液至少2倍，所述條件是包含能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)與包含不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比更有效地結(jié)合相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)。引入的所述稀釋溶液和所述稀釋步驟(ii1-b)的所述條件(如溫度)可與所述混合步驟(iii)的所述結(jié)合條件不同一但上述效果應(yīng)當(dāng)在稀釋步驟(ii1-b)中得以保持。步驟(i i 1-b )中可優(yōu)選步驟(iii)的所述溶液被稀釋至少IO2倍、或步驟(i i i )的所述溶液被稀釋至少IO3倍、或步驟(iii)的所述溶液被稀釋至少IO4倍、或步驟(iii)的所述溶液被稀釋至少IO5倍、或步驟(iii)的所述溶液被稀釋至少IO6倍、或步驟(iii)的所述溶液被稀釋至少IO7倍、或步驟(iii)的所述溶液被稀釋至少IO8倍或步驟(iii)的所述溶液被稀釋至少IO9倍。該稀釋步驟的優(yōu)點(diǎn)在于富集可基于所述BT結(jié)構(gòu)的解離半衰期來(lái)執(zhí)行并很容易通過(guò)稀釋度和孵育時(shí)間來(lái)控制。當(dāng)步驟(iii)的所述混合溶液被稀釋時(shí)，結(jié)合實(shí)體和靶標(biāo)的結(jié)合(biding)是不太可能發(fā)生的事情即“未結(jié)合事件”一所述解離速率(所述解離半衰期)獨(dú)立于稀釋。所以，在極稀溶液(T-結(jié)構(gòu)濃度<〈Kd)中基本上只會(huì)發(fā)生解離。因此，所述BT-結(jié)構(gòu)的解離半衰期富集很容易通過(guò)稀釋度和孵育時(shí)間控制。所述解離半衰期與親和力一起對(duì)結(jié)合實(shí)體的可用性非常重要。其中最引人注目的是，對(duì)于有效新藥的開(kāi)發(fā)來(lái)說(shuō)，高親和力和長(zhǎng)解離半衰期是藥理作用的關(guān)鍵參數(shù)(NatureReviews Drug Discovery (2006)5，730-739，(Copeland))。因此，本新發(fā)明的所述方法以前所未有有效的和可控的方式在這兩個(gè)參數(shù)上富集。此外，這兩個(gè)參數(shù)可以彼此獨(dú)立地控制。第一方面的步驟(iv):
查看這個(gè)步驟的簡(jiǎn)單方式是步驟(iii)的結(jié)合實(shí)體與靶標(biāo)的所述結(jié)合“轉(zhuǎn)變”成B-結(jié)構(gòu)和T-結(jié)構(gòu)的共區(qū)室化。該步驟(iv)的所述條件應(yīng)當(dāng)是給出與步驟(iii)的所述效果一致的效果的“結(jié)合條件下”一參見(jiàn)上文。在本發(fā)明圖1的所述示例性實(shí)施例中一該可選步驟(ii1-b)對(duì)應(yīng)于所述步驟“3乳化w/o”。第一方面的步驟(iv)進(jìn)一步記載:“其中區(qū)室化系統(tǒng)包括的單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少2倍”本發(fā)明中這可看做本發(fā)明所述方法的一個(gè)重要步驟一即“單獨(dú)的區(qū)室為步驟
(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少2倍”是重要的。本發(fā)明所述圖1中一所述體外區(qū)室化系統(tǒng)可以是例如油包水乳液系統(tǒng)一如本發(fā)明下面進(jìn)一步討論的， 合適的油包水乳液系統(tǒng)是本領(lǐng)域眾所周知的。在圖1的理論假設(shè)的示例性實(shí)施例中步驟(ii)僅有I種靶標(biāo)[Τη (n=l)]并且每種所述T-結(jié)構(gòu)有3個(gè)拷貝——即數(shù)量“Y”是3。因此，在圖1的理論假設(shè)的示例性實(shí)施例中所述體外區(qū)室化系統(tǒng)里應(yīng)當(dāng)有至少(2X3)=6個(gè)單獨(dú)的區(qū)室(例如油滴)一請(qǐng)注意本發(fā)明圖1中有少于30個(gè)單獨(dú)的區(qū)室(SP圖1僅是本發(fā)明所述方法的一些因素的示例)。正如上面所討論的——在實(shí)踐中可有例如至少IO4個(gè)感興趣的T-結(jié)構(gòu)的拷貝一即在這種情況下Y可為IO4并且在這種情況下所述體外區(qū)室化系統(tǒng)里應(yīng)當(dāng)有至少(2X IO4) =2X IO4個(gè)單獨(dú)的區(qū)室(例如油滴)。這個(gè)“單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少2倍”的優(yōu)點(diǎn)在于所述展示文庫(kù)中未結(jié)合物隨機(jī)分布于所述區(qū)室并因此以隨機(jī)的方式與所述靶標(biāo)共區(qū)室化，其頻率依賴于區(qū)室的數(shù)量和靶標(biāo)分子的數(shù)量的比例(在這種情況下為I比10，而由于其結(jié)合活性，結(jié)合物會(huì)獨(dú)立于區(qū)室的數(shù)量和靶標(biāo)分子的數(shù)量的比例(在這個(gè)理想情況下I比I)與靶標(biāo)分子共區(qū)室化。因此，在這種情況下當(dāng)與未結(jié)合物相比結(jié)合物富集2倍?；谏鲜鲇懻摚藗兛梢哉f(shuō)如果在所述體外區(qū)室化系統(tǒng)中相應(yīng)有更多單獨(dú)的區(qū)室人們可以獲得更好的富集一因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，“單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少10倍”、更優(yōu)選“單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少100倍”、更優(yōu)選“單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少10000倍”、更優(yōu)選“單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少100000倍”、更優(yōu)選“單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少1000000倍”。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述區(qū)室數(shù)量大于步驟(iii)的T-結(jié)構(gòu)的所述 Y 數(shù)量的 2、5、10、50、100、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000 或10000000 倍。第一方面步驟(iv)進(jìn)一步記載:“在其中B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和BT-結(jié)構(gòu)隨機(jī)進(jìn)入單獨(dú)的區(qū)室的條件下”這應(yīng)當(dāng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員理解將在上下文中理解的——其涉及，為了獲得本發(fā)明的有利富集，人們所需的條件，其中所述B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和BT-結(jié)構(gòu)隨機(jī)進(jìn)入單獨(dú)的區(qū)室。換句話說(shuō)——在任何給定的區(qū)室中的被區(qū)室化的任何B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和BT-結(jié)構(gòu)的傾向依賴于所述區(qū)室的體積和總體積。換句話說(shuō)——如果幾乎所有的B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和BT-結(jié)構(gòu)僅進(jìn)入一個(gè)特定的單獨(dú)的區(qū)室人們將顯然不會(huì)得到上述討論的有利富集。如下所討論的一如果人們例如使用合適的油包水乳液系統(tǒng)作為所述體外區(qū)室化系統(tǒng)，人們能夠很容易地確定條件，其中所述B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和BT-結(jié)構(gòu)隨機(jī)進(jìn)入單獨(dú)的區(qū)室(例如單獨(dú)的油滴)一其實(shí)難以確定如下不是隨機(jī)的條件一即其中幾乎所有的B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和BT-結(jié)構(gòu)僅進(jìn)入一個(gè)特定的單獨(dú)的區(qū)室(例如單獨(dú)的油滴)。在步驟(iv)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中一一單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)中的B-結(jié)構(gòu)的所述X數(shù)量的至少10的平方根(3.16)倍。泊松分布用于假定描述所述區(qū)室中B-結(jié)構(gòu)的分布。這意味著所有區(qū)室具有相同的體積。具有n=0、l、2或更多B-結(jié)構(gòu)分子的區(qū)室的概率可通過(guò)下式進(jìn)行計(jì)算:
權(quán)利要求
1.一種制備富集文庫(kù)的方法，所述富集文庫(kù)包含允許鑒定至少一種結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息，所述結(jié)合實(shí)體結(jié)合至少一種靶標(biāo)，其中所述特定結(jié)合實(shí)體已存在于體外展示文庫(kù)，并且其中所述方法包括下述步驟: (i):制備至少100種不同結(jié)合實(shí)體(BnCn=IOO或更多)的體外展示文庫(kù)，其中每個(gè)結(jié)合實(shí)體附加到核酸分子，所述核酸分子包括允許鑒定結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息——即人們一旦知曉所述核酸分子的所述特定核酸序列信息即可直接知曉附加到所述核酸分子的所述特定結(jié)合實(shí)體的結(jié)構(gòu)一附加到所述核酸分子(基因型)的所述結(jié)合實(shí)體(即表型)的所述結(jié)構(gòu)在本文中稱為B-結(jié)構(gòu)。
(ii):制備具有附加到核酸分子的至少一種靶標(biāo)Tn(n=l或更多)的核酸分子，所述核酸分子包括允許鑒定所述特定靶標(biāo)的特定核酸序列信息，其中所述靶標(biāo)能夠結(jié)合存在于步驟(i )的文庫(kù)的至少一種結(jié)合實(shí)體一附加到所述核酸分子(基因型)的靶標(biāo)(即表型)的結(jié)構(gòu)在本文中稱為T(mén)-結(jié)構(gòu)； 并且其中所述方法特征在于: (iii):在結(jié)合條件下，將包括X(X是大于IO4的數(shù))個(gè)步驟(i)的文庫(kù)的B-結(jié)構(gòu)的溶液與包括Y (Y是大于IO2的數(shù))個(gè)步驟(ii)的T-結(jié)構(gòu)的溶液混合，所述條件是含有能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)與含有不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比更有效地結(jié)合相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)，并且其中人們得到至少一種結(jié)合實(shí)體與至少一種靶標(biāo)的結(jié)合，從而生成包含B-結(jié)構(gòu)結(jié)合到T-結(jié)構(gòu)的復(fù)合物(本文中稱為Bgg5T-結(jié)構(gòu))； (iv):應(yīng)用體外區(qū)室化系統(tǒng)——在結(jié)合條件下，所述條件是含有能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)與包括不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比更有效地結(jié)合相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)——其中，在B-結(jié)構(gòu)、T-結(jié)構(gòu)和Bgg5T-結(jié)構(gòu)隨機(jī)進(jìn)入單獨(dú)的區(qū)室的條件下，所述區(qū)室化系統(tǒng)包括的單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)存在的Y個(gè)T-結(jié)構(gòu)的至少2倍；和 (V):融合同時(shí)存在于相同單獨(dú)的區(qū)室里的B-結(jié)構(gòu)和T-結(jié)構(gòu)的核酸分子一即融合所述B-結(jié)構(gòu)的核酸分子至所述T-結(jié)構(gòu)的核酸分子——這個(gè)結(jié)構(gòu)本文中稱為BT8^-結(jié)構(gòu)，所述BT8^-結(jié)構(gòu)包括允許鑒定步驟(i)所述結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息和允許鑒定步驟(ii)所述特定靶標(biāo)的特定核酸序列信息；和 (vi):組合步驟(V)的所述單獨(dú)的區(qū)室的內(nèi)容物，以得到BT8^-結(jié)構(gòu)文庫(kù)，該步驟在以下條件下進(jìn)行:其中沒(méi)有B-結(jié)構(gòu)和T-結(jié)構(gòu)的核酸分子的融合——即在步驟(V)中沒(méi)有生成任何新的BT8^-結(jié)構(gòu)，其中所述文庫(kù)是與源自靶標(biāo)與結(jié)合實(shí)體的未結(jié)合對(duì)的BT8^-結(jié)構(gòu)相比，為源自靶標(biāo)與結(jié)合實(shí)體的結(jié)合對(duì)的BT8^-結(jié)構(gòu)種類的富集文庫(kù)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(i)的結(jié)合實(shí)體(即表型)通過(guò)例如共價(jià)結(jié)合附加到所述核酸分子(基因型)，并且其中步驟(ii)所述靶標(biāo)(即表型)通過(guò)共價(jià)結(jié)合附加到所述核酸分子(基因型)，并且其中所述B-結(jié)構(gòu)的所述核酸分子是DNA，所述T-結(jié)構(gòu)的所述核酸分子是 DNA。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述B-結(jié)構(gòu)中的所述DNA核酸分子(基因型)是雙鏈核酸分子，并且其中所述T-結(jié)構(gòu)中的所述DNA核酸分子(基因型)是雙鏈核酸分子。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方 法，其中所述B-結(jié)構(gòu)中附加到所述結(jié)合實(shí)體(表型)的所述核酸分子(基因型)含有PCR引發(fā)位點(diǎn)，并且其中所述T-結(jié)構(gòu)中附加到所述靶標(biāo)(表型)的所述核酸分子(基因型)含有PCR引發(fā)位點(diǎn)。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(i)的所述體外文庫(kù)包括至少IO5種不同結(jié)合實(shí)體(即Bn (n=105)，并且其中步驟(i)的所述結(jié)合實(shí)體是平均分子量MW低于5000道爾頓的化合物。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(ii)中至少有兩種不同靶標(biāo)[即Tn(n=2或更多]。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中至少一種靶標(biāo)是蛋白質(zhì)。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(iii)中有至少IO5拷貝的感興趣的T-結(jié)構(gòu)一即“Y”是至少105，并且其中所述“混合步驟(iii)”中的T-結(jié)構(gòu)的所述濃度是至少1(Γ9Μ。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(iii)在結(jié)合條件下進(jìn)行，其中含有能夠結(jié)合至靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)，與包含不能夠結(jié)合至相同靶標(biāo)的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比，100倍有效地結(jié)合所述相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中權(quán)利要求1的方法包括在權(quán)利要求1的所述步驟(iv)之前進(jìn)行的額外的步驟(ii1-b),包括: (ii1-b):在結(jié)合條件下稀釋步驟(iii)的所述溶液至少100倍，所述條件是包含能夠結(jié)合靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)與包含不能夠結(jié)合相同靶標(biāo)分子的結(jié)合實(shí)體的B-結(jié)構(gòu)相比更有效地結(jié)合相應(yīng)的T-結(jié)構(gòu)。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的所述方法，其中權(quán)利要求1的步驟(iv)中的單獨(dú)的區(qū)室為存在于步驟(iii)的T-結(jié)構(gòu)的Y數(shù)量的至少100倍，其中權(quán)利要求1的步驟(iv)中的單獨(dú)的區(qū)室為步驟(iii)的B-結(jié)構(gòu) 的X數(shù)量的至少10的平方根(3.16)倍。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(iv)的所述體外區(qū)室化系統(tǒng)是油包水乳液系統(tǒng)，并且其中所述平均區(qū)室體積小于10_12L。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中同時(shí)存在于權(quán)利要求1的步驟(V)的所述相同的單獨(dú)區(qū)室里的B-結(jié)構(gòu)和T-結(jié)構(gòu)的所述核酸分子的所述融合是: (a):通過(guò)DNA連接酶完成，其形成位于3’-OH和5’磷酸基團(tuán)間的磷酸二酯鍵；或 (b):通過(guò)使用DNA聚合酶(例如使用微乳滴PCR)。
14.權(quán)利要求12的方法，其中步驟(iv)的所述體外區(qū)室化系統(tǒng)是油包水乳液，其中步驟(V)的所述單獨(dú)區(qū)室的所述內(nèi)容物通過(guò)一種方法在權(quán)利要求1的步驟(vi)中被組合，其中所述油區(qū)室被破壞。
15.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法,其中存在額外的步驟(vii),其中存在于步驟(vi)的所述富集文庫(kù)的BT8^-結(jié)構(gòu)通過(guò)PCR擴(kuò)增并隨后進(jìn)行DNA測(cè)序以鑒定至少一種結(jié)合至少一種感興趣的靶標(biāo)的單獨(dú)的結(jié)合實(shí)體。
16.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中存在額外的步驟(vii)，包括使用步驟(vi)的所述富集文庫(kù)鑒定至少一種結(jié)合至少一種感興趣的靶標(biāo)的單獨(dú)的結(jié)合實(shí)體。
17.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述Bgg5T-結(jié)構(gòu)在所述第一方面的步驟(iv)的所述單獨(dú)區(qū)室中保持懸浮于溶液中。
18.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述方法不依賴于固相載體上的靶標(biāo)固定化。
全文摘要
一種制備包含允許鑒定至少一種結(jié)合至少一種靶標(biāo)的結(jié)合實(shí)體的特定核酸序列信息的富集文庫(kù)的方法，其中所述特定結(jié)合實(shí)體已經(jīng)存在于體外展示文庫(kù)中。
文檔編號(hào)C12N15/10GK103119165SQ201180046388
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者N·J·V·漢森, A·B·克里斯滕森, L·K·拉森, F·A·斯勒克, L·K·彼得森, J·拉斯穆森-迪特沃斯特, P·布萊克斯克耶爾, T·H·漢森, J·霍爾姆奎斯特 申請(qǐng)人:威泊根私人有限公司