專利名稱：抗病原體的植物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和植物病害領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及參與植物病原體抗性的負(fù)調(diào)控的植物基因及其用途。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及具有有缺陷的植物磺肽素(phytosulfokine) (PSK)功能并表現(xiàn)出對(duì)植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)對(duì)各種病害有抗性的改良植物的方法。此外，本發(fā)明涉及具有有缺陷的PSK受體(PSKR)功能的植物，以及篩選和鑒定調(diào)節(jié)PSKR表達(dá)或活性的分子的方法。
背景技術(shù)：
植物病原體代表了對(duì)作物栽培的永久性威脅。具體來(lái)說(shuō)，由于產(chǎn)量損失和植物被毒素污染，細(xì)菌、真菌、卵菌或線蟲(chóng)對(duì)作物的感染可能對(duì)農(nóng)業(yè)具有破壞性影響。大多數(shù)植物病原細(xì)菌屬于下列屬:雷爾氏菌屬(Ralstonia),歐文氏菌屬(Erwinia),果膠桿菌屬(Pectobacterium),泛菌屬(Pantoea), 土壤桿菌屬(Agrobacterium),假單胞菌屬(Pseudomonas),伯克霍爾德菌屬(Burkholderia),食酸菌屬(Acidovor ax),黃單胞菌屬(Xanthomonas),棒形桿菌屬(Clavibacter),鏈霉菌屬(Streptomyces),木桿菌屬(Xylella),螺原體屬(Spiroplasma)和植原體屬(Phytoplasma)0植物病原細(xì)菌引起許多不同種類的癥狀，包括菌癭和增生物、枯萎、葉斑、小斑和凋萎、軟腐病以及瘡痂病和黑腐病。某些植物病原細(xì)菌產(chǎn)生毒素或注入引起宿主細(xì)胞死亡的特殊蛋白質(zhì)，或產(chǎn)生分解植物細(xì)胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組分的酶。一個(gè)實(shí)例是由軟腐細(xì)菌產(chǎn)生的降解果膠層的酶，所述果膠層使植物細(xì)胞結(jié)合在一起。其他植物病原細(xì)菌例如雷爾氏菌屬菌種(Ralstonia spp.)定植于導(dǎo)水的木質(zhì)部導(dǎo)管，引起植物枯萎和死亡。土壤桿菌屬(Agrobacterium)菌種甚至具有遺傳修飾或轉(zhuǎn)化它們的宿主并導(dǎo)致形成被稱為冠癭的癌樣增生物的能力。植物中的細(xì)菌性病害是難以控制的。重點(diǎn)放在防止細(xì)菌的擴(kuò)散而不是治愈植物上。栽培技術(shù)可以消除或減少細(xì)菌污染來(lái)源，例如輪作以減少越冬。然而，最重要的控制方法是通過(guò)遺傳改造宿主抗性以提供有抗性的變種、栽培品種或雜交種來(lái)確保的。線蟲(chóng)是用顯微鏡可見(jiàn)的蠕蟲(chóng)樣生物體。它們最通常以植物根為食，但是某些線蟲(chóng)也侵入葉組織。線蟲(chóng)吸出液體營(yíng)養(yǎng)物并將破壞性物質(zhì)注入植物中。它們損傷植物細(xì)胞或改變植物的正常生長(zhǎng)過(guò)程。線蟲(chóng)的癥狀包括莖或根的腫脹、不規(guī)則分枝、葉片變形、不開(kāi)花和根上的菌癭。線蟲(chóng)可以促進(jìn)病毒和真菌進(jìn)入植物。根結(jié)線蟲(chóng)(根結(jié)線蟲(chóng)屬物種(Meloidogynespp.))和胞囊線蟲(chóng)(球胞囊線蟲(chóng)屬物種(Globodera spp.)和異皮線蟲(chóng)屬物種(Heteroderaspp.))是對(duì)園藝和田間作物最具經(jīng)濟(jì)破壞性的植物寄生性線蟲(chóng)屬。目前，殺線蟲(chóng)劑是控制線蟲(chóng)的最重要手段。然而，大多數(shù)殺線蟲(chóng)劑是非特異性的，具有公知的毒性，并且對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)、地下水和人類健康構(gòu)成威脅。卵菌是對(duì)農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)具有破壞性的真菌樣植物病原體。疫霉屬(Phytophthora)菌種引起諸如梢枯病、馬鈴薯晚疫病、櫟樹(shù)猝死病的病害，并造成嚴(yán)重的作物損失(例如全世界馬鈴薯產(chǎn)量的30%)。腐霉屬(Pythium)菌種是死體營(yíng)養(yǎng)型菌種，其殺死植物并造成作物例如玉米的腐皮病。霜霉病菌例如感染葡萄的葡萄生單軸霉(Plasmoparaviticola)是活體營(yíng)養(yǎng)型病原體，它們保持其宿主存活，但是以嚴(yán)重影響產(chǎn)量的方式使其宿主衰弱。霜霉病菌可以通過(guò)在葉片下表面上出現(xiàn)白色、微褐色或橄欖色的“霉”來(lái)容易地鑒定。來(lái)自于白銹菌屬(Albugo)的卵菌在各種有花植物上引起白銹或白皰病。卵菌在很長(zhǎng)的一段時(shí)間中被認(rèn)為是真菌，因?yàn)樗鼈兪钱愷B(yǎng)、形成菌絲體的生物體。然而，幾種形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征將卵菌與真菌區(qū)別開(kāi)。目前的分類學(xué)將卵菌與光合生物例如褐藻或硅藻類一起分類在原生藻菌(stramenopile)界中。由于它們特殊的生理特征，目前沒(méi)有針對(duì)由這些微生物引起的病害的有效治療方法可用。目前用于對(duì)抗卵菌的殺蟲(chóng)劑依賴于苯基酰胺類的甲霜靈，其抑制RNA聚合酶-1。甲霜靈對(duì)環(huán)境造成影響，并且病原體快速發(fā)展出對(duì)這種殺卵菌劑的抗性，目前這種抗性已成為分別來(lái)自于馬鈴薯和辣椒的病原性致病疫霉(P.1nfestans)和辣椒疫霉(P.capsici)種群的普遍特征。
常見(jiàn)真菌病害包括白粉病、銹病、葉斑病、凋萎病、根腐和頸腐病、猝倒病、黑粉病，炭疽病和維管萎蔫病。目前，通過(guò)例如施用昂貴且有毒的殺真菌劑，使用例如噻菌靈、三環(huán)唑、咯喹酮和苯酞進(jìn)行化學(xué)處理，或通過(guò)燒毀被感染的作物來(lái)控制真菌病害。由于真菌病原體能夠發(fā)展出對(duì)化學(xué)處理的抗性，這些方法僅僅部分成功。為了減少殺蟲(chóng)劑的使用量，植物育種家和遺傳學(xué)家已在嘗試鑒定病害的抗性基因座并利用植物的天然防御機(jī)制對(duì)抗病原體攻擊。植物能夠識(shí)別某些病原體并以抗性響應(yīng)的形式激活防御，所述抗性響應(yīng)可以引起病原體生長(zhǎng)的限制或停止。已經(jīng)鑒定到許多抗性(R)基因，其為各種植物物種提供了對(duì)抗廣范圍病原體的抗性。然而，對(duì)于在植物防御機(jī)制期間開(kāi)關(guān)這些基因的關(guān)鍵因素，仍然了解得很少。此外，病原體可能突變并克服由抗性基因提供的保護(hù)。為了控制晚疫病，經(jīng)常使用顯性抗性基因在易感栽培品種中的基因漸滲來(lái)管控疫霉屬(Phytophthora)抗性。將來(lái)自于野生馬鈴薯物種野生馬鈴薯(Solanum demissum)的11個(gè)R基因引入到現(xiàn)代馬鈴薯栽培品種中。然而，致病疫霉(P.1nfestans)菌種很快避開(kāi)了栽培品種的新的單基因介導(dǎo)的抗性性質(zhì)。因此，R基因的基因漸滲顯示出其用于疫霉屬(Phytophthora)抗性育種的限制，并且必須開(kāi)發(fā)替代的程序來(lái)提供持久的卵菌抗性。植物磺肽素(PSK)是一種分泌的肽，其首先在源自于蘆笑(Asparagusofficinalis L.)葉肉培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中被鑒定到，并被提出是造成“調(diào)理”或“看護(hù)”即促生長(zhǎng)效應(yīng)的主要化學(xué)因子，所述效應(yīng)是由先前用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基或由物理上分離的“飼養(yǎng)”細(xì)胞所觸發(fā)的(Matsubayashi 和 Sakagami, 1996)。PSK肽也分離自源自于水稻(Oryza sativa L.)懸浮培養(yǎng)物的調(diào)理培養(yǎng)基，并被鑒定為以兩種形式存在:硫酸酯化的五肽([H-Tyr (S03H)-1le-Tyr (S03H)-Thr-Gln-OH]，PSK α )及其 C-端截短的四肽([H-Tyr (S03H) -1le-Tyr (S03H) -Thr-OH]，PSK β )(Matsubayashi Y.等，1997)。作者提出，由PSK肽因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與植物細(xì)胞增殖。PSK是由約80個(gè)氨基酸長(zhǎng)的前體肽經(jīng)酪氨酸殘基的翻譯后硫酸酯化和蛋白水解加工而產(chǎn)生的(Yang等，1999)。編碼PSK前體的基因冗余分布在基因組中，并在培養(yǎng)的細(xì)胞和各種組織包括葉、莖、花和根中表達(dá)(Matsubayashi Y.等,2006 ;Kutschmar等,2008)。在不同植物物種中已鑒定到兩種PSKR受體=PSKRl和PSKR2。這些受體是富含亮氨酸重復(fù)序列的受體激酶(LRR-RK)家族的成員。PSK以高度特異性方式與其受體相互作用，具有納摩爾級(jí)的解離常數(shù)。此外，已通過(guò)光親和標(biāo)記鑒定到胡蘿卜PSKRl (DcPSKRl)的PSK結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Shinohara等，2007)。作者發(fā)現(xiàn)，Glu503-Lys517的缺失完全破壞了 DcPSKRl的配體結(jié)合活性。這個(gè)區(qū)域處于兩側(cè)帶有細(xì)胞外LRR的島結(jié)構(gòu)域中，表明該結(jié)構(gòu)域形成了與PSK直接發(fā)生相互作用的配體結(jié)合口袋。已知PSK主要是內(nèi)源性分泌的硫酸酯化的5個(gè)氨基酸的肽，其是調(diào)控細(xì)胞去分化和再分化的關(guān)鍵因子，并通過(guò)與PSK受體(PSKR)結(jié)合來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)潛力。最近，除了促有絲分裂活性之外，Bahyrycz等(2008)還提出了 PSK肽的抗真菌活性。該文獻(xiàn)顯示了PSK α和β肽在體外以劑量依賴性方式抑制Phoma nareissi和郁金香葡萄孢(Botrytistulipae)病原體的菌絲體生長(zhǎng)。Loivamaeki等，2010也提出了 PSK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在植物創(chuàng)傷形成中的作用。冠癭中PSK/PSKR1的轉(zhuǎn)錄激活可能是由致瘤期間發(fā)生的細(xì)胞再分化過(guò)程所造成的。Motose等，Plant Physiol.150, 437-447，2009也已提出作為創(chuàng)傷響應(yīng)的PSK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活。Amano等，2007涉及與植物磺肽素相關(guān)的新型硫酸酯化糖肽PSYl的鑒定及其在發(fā)育過(guò)程中的參與。W002/083901涉及基于GREP (生長(zhǎng)調(diào)控蛋白)多肽或其在水稻中鑒定到的PSK類似物OsPSK的表達(dá)或活性的調(diào)節(jié)來(lái)改變植物的生長(zhǎng)、體系結(jié)構(gòu)和形態(tài)的方法。因此，在本技術(shù)領(lǐng)域中基本上表明PSK是細(xì)胞增殖或分化的調(diào)控物，并具有可能的抗真菌活性。在本技術(shù)領(lǐng)域中沒(méi)有公開(kāi)或提出PSK是植物中病原體抗性的關(guān)鍵調(diào)控物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)對(duì)病原體有抗性的植物的新穎且有效方法。令人吃驚的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有有缺陷的PSK和/或PSK受體(PSKR)基因的突變植物對(duì)植物病害有抗性，而過(guò)表達(dá)PSK或PSKR基因的植物對(duì)植物病害更易感。本發(fā)明人還證實(shí)，這種具有有缺陷的PSK或PSKR基因功·能的植物獲得了對(duì)不同類型的病原體例如卵菌、線蟲(chóng)和細(xì)菌病原體的提高的抗性，顯示出這一發(fā)現(xiàn)的廣泛應(yīng)用。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及包含有缺陷的PSK功能的植物。正如將要討論的，所述植物表現(xiàn)出對(duì)植物病原體的抗性提高或增加。優(yōu)選情況下，所述植物是雙子葉植物，優(yōu)選選自爺科(Solanaceae)植物(例如番爺)、百合科(Liliaceae)植物(例如蘆笑)、傘形科(Apiaceae)植物(例如胡蘿卜)、藜科(Chenopodiaceae)植物(例如甜菜)、葡萄科(Vitaceae)植物(例如葡萄)、豆科(Fabaceae)植物(例如大豆)、葫蘆科(Cucurbitaceae)植物(例如黃瓜)或十字花科(Brassicacea)植物(例如油菜籽、擬南芥(Arabidopsisthaliana)),或者是單子葉植物,優(yōu)選選自禾本科(Poaceae)谷類植物(例如小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米)。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及具有有缺陷的PSK肽和/或PSK受體并表現(xiàn)出對(duì)植物病原體的抗性提高的植物，其中所述PSK受體優(yōu)選為PSKRl受體。本發(fā)明的另一個(gè)特定目的涉及包含有缺陷的PSK基因并表現(xiàn)出對(duì)植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明的另一個(gè)特定目的涉及包含有缺陷的PSKR基因并表現(xiàn)出對(duì)植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及本發(fā)明的植物的種子，或從所述種子長(zhǎng)成的或通過(guò)其他方式衍生的的植物或植物的后代。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于生產(chǎn)對(duì)植物病原體具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟:(a)失活植物細(xì)胞中的PSK和/或PSKR基因；(b)任選地，選擇具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的步驟(a)的植物細(xì)胞；(c)從步驟(a)或(b)的細(xì)胞再生成植物；以及(d)任選地，選擇對(duì)病原體具有提高的抗性的(C)的植物，所述植物具有有缺陷的PSK或PSKR基因。正如將在本申請(qǐng)中進(jìn)一步公開(kāi)的，可以通過(guò)各種技術(shù)例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代、位點(diǎn)特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導(dǎo)基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、敲除技術(shù)或通過(guò)由RNA干擾誘導(dǎo)的基因沉默，來(lái)使PSK功能變成有缺陷的。也可以通過(guò)例如使用特異性抗體或可溶性受體改變PSK肽或受體的活性，來(lái)使PSK功能變成有缺陷的。本發(fā)明還涉及用于使植物具有對(duì)植物病原體的抗性或提高植物對(duì)植物病原體的抗性的方法，所述方法包括通過(guò)例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表達(dá)來(lái)永久或暫時(shí)地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步驟。本發(fā)明還涉及用于保護(hù)植物抵抗病原體的方法，所述方法包括通過(guò)例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表達(dá)來(lái)永久或暫時(shí)地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步驟。本發(fā)明還涉及用于減少植物中的病原體增殖的方法，所述方法包括通過(guò)例如抑制所述植物中PSK基因和/或PSKR基因的表達(dá)來(lái)永久或暫時(shí)地抑制所述植物或其先祖中的PSK功能的步驟。 本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及抑制PSK和/或PSKR基因的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄或翻譯)的抑制性核酸例如RNA1、反義核酸或核酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及這樣的核酸的以下用途:用于提高植物或植物細(xì)胞對(duì)植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細(xì)胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護(hù)植物或植物細(xì)胞抵抗植物病原體。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)PSKR基因表達(dá)的分子的鑒定方法，所述方法包括:(a)提供包含核酸構(gòu)建物的細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建物包含與報(bào)告基因可操作連接的PSKR基因啟動(dòng)子序列；(b)將所述細(xì)胞與候選分子相接觸；(C)通過(guò)監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞中由報(bào)告基因編碼的標(biāo)志物蛋白的表達(dá)來(lái)測(cè)定PSKR啟動(dòng)子的活性；(d)選擇調(diào)節(jié)所述標(biāo)志物蛋白的表達(dá)的分子。優(yōu)選情況下，選擇的分子抑制PSKR的表達(dá)或活性，所述PSKR優(yōu)選為PSKRl。本發(fā)明還涉及按照上述方法選擇的分子的以下用途:用于提高植物對(duì)植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細(xì)胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護(hù)植物或植物細(xì)胞抵抗植物病原體。本發(fā)明還涉及與PSK肽或PSK受體特異性結(jié)合的抗體，或這樣的抗體的具有基本上相同的抗原特異性的片段或衍生物，以及所述抗體或其片段或衍生物的以下用途:用于在植物中提高或產(chǎn)生病原體抗性，和/或用于減少植物或植物細(xì)胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護(hù)植物或植物細(xì)胞抵抗植物病原體。本發(fā)明適用于生產(chǎn)對(duì)病原體具有提高的抗性的豆科植物、蔬菜和谷類植物，并且特別適合于生產(chǎn)有抗性的番茄、馬鈴薯、蘆筍、胡蘿卜、甜菜、油菜籽、葡萄、小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米。


圖1:PSK2基因的組成性表達(dá)。PSK2基因的表達(dá)(轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis)株系PSK2pro:GFP:⑶S)受到發(fā)育性調(diào)控。(Α-E):根系中PSK2的表達(dá)。(A，B)揭示出PSK2啟動(dòng)子激活的GUS活性(A)和GFP (B)可以在根尖(側(cè)根冠)中被檢測(cè)到，但是不能在伸長(zhǎng)區(qū)中被檢測(cè)到。(C，D)在充分分化的根中，PSK2表達(dá)集中在維管柱中。(E)側(cè)根原基中PSK2的表達(dá)；(F-1):芽中PSK2的表達(dá)集中在葉和子葉的維管系統(tǒng)(F)、毛狀體(G)和氣孔(H，I)中。在2周齡幼苗上執(zhí)行所有分析。圖2:線蟲(chóng)和卵菌感染后擬南芥(Arabidopsis thaliana)中PSK基因的表達(dá)模式。(2A)通過(guò)微陣列雜交來(lái)分析PSK基因的表達(dá)情況。在分別用南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.1ncognita)和H.arabidopsidis感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，從分離的菌癭和感染的子葉制備樣品。所顯示的是兩個(gè)生物學(xué)平行樣的感染和未感染組織之間的比率的以2為底的對(duì)數(shù)(Log2)的平均值。nc，不改變。(2B)在線蟲(chóng)接種后(DAI)7天(白色條)、14天(灰色條)和21天(黑色條)時(shí)通過(guò)定量RT-PCR測(cè)定的擬南芥菌癭中與未感染的根相比的PSK轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)本積累量。示出的是代表性實(shí)驗(yàn)，其給出了來(lái)自于3個(gè)技術(shù)平行樣的平均值(±SD)。(2C)在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系PSK2pro:GFP:⑶S的被南方根結(jié)線蟲(chóng)感染的根的菌癭中PSK2的表達(dá)模式。A，B.在發(fā)育中的菌癭的中心，揭示出GUS活性的降低。C.在連續(xù)共聚焦光學(xué)體內(nèi)切面的投影中，在線蟲(chóng)飼養(yǎng)細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到GFP信號(hào)。*，巨細(xì)胞；n，線蟲(chóng)。圖3 =PSKRl基因的發(fā)育調(diào)控的表達(dá)。(A)在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系PSKRlpro = GFPAUS中，揭示出PSKRl啟動(dòng)子激活的GUS活性可以在分化的根組織和根冠中被檢測(cè)到，但是不能在分裂和伸長(zhǎng)區(qū)中被檢測(cè)到。(B)在根細(xì)胞中通過(guò)GFP熒光監(jiān)測(cè)到的組成性PSKRl轉(zhuǎn)錄。(C) PSKRl的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在根和過(guò)渡區(qū)中，但不發(fā)生在下胚軸中。(D-E)子葉表皮中的GFP熒光集中于氣孔。使用2周齡幼苗執(zhí)行所有分析。圖4:卵菌感染后擬南芥中PSKRl基因的表達(dá)模式。(4A)在用水或霜霉病病原體Hyaloperonospora arabidopsidis (Hpa)的40，000個(gè)抱子/ml的分生抱子懸液對(duì)擬南芥(生態(tài)型Ws-O )子葉進(jìn)行噴霧處理后的不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)qRT-PCR分析PSKRl轉(zhuǎn)錄本的豐度。示出了來(lái)自于3個(gè)技術(shù)平行樣的平均值(土SD)，所述值是通過(guò)qBasel.3.5軟件計(jì)算得到的，并對(duì)來(lái)自于2個(gè)參比基因(At5g62050和At5gl0790)的值進(jìn)行了歸一化。使用來(lái)自于兩個(gè)生物學(xué)平行樣的樣品進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)給出了相似的趨勢(shì)。Dp1:接種后天數(shù)。(4B)通過(guò)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系PSKRlpro: GFP: GUS中GUS報(bào)告基因的活性所監(jiān)測(cè)到的對(duì)Hpa感染作出響應(yīng)的PSKRl轉(zhuǎn)錄激活。在接種之前，通過(guò)O時(shí)間點(diǎn)時(shí)子葉中的⑶S活性可觀察到PSKRl的組成性表達(dá)。在接種后，表達(dá)繼續(xù)增加并集中于葉肉的被感染區(qū)域。圖5:線蟲(chóng)感染后擬南芥中PSKRl基因的表達(dá)模式。(5A)在接種后(DAI) 7天(白色條)、14天(灰色 條)和21天(黑色條)時(shí)通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行的PSKRl轉(zhuǎn)錄本分析。進(jìn)行了兩個(gè)生物學(xué)平行實(shí)驗(yàn)。條表示來(lái)自于兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(±SD)。(5B)在用150個(gè)表面除菌的新鮮孵化的南方根結(jié)線蟲(chóng)J2幼蟲(chóng)接種后7天(A)和21天(B)時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系PSKRlpro:GFP AUS的菌癭中在PSKRl啟動(dòng)子控制下的GFP報(bào)告基因的表達(dá)模式，所述表達(dá)模式是由根中的南方根結(jié)線蟲(chóng)誘導(dǎo)的。圖6:psk3敲除突變體對(duì)卵菌感染的易感性降低。(6A)關(guān)于PSK3 (基因座At3g44735)的基因組組織、引物附著位點(diǎn)以及T-DNA在來(lái)自于株系psk3-l(SAIL_378_F03)的基因組DNA中的插入和方向的示意圖。條表示外顯子，線對(duì)應(yīng)于內(nèi)含子(在外顯子之間)和非翻譯序列(在5’末端和3’末端處)。T-DNA的插入集中在第三外顯子內(nèi)。在突變株系中沒(méi)有檢測(cè)到揭示出PSK3轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增子，因此證實(shí)了分子敲除表型。組成性表達(dá)的EFl α基因(Atlg07930)轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增表明，相似量的完整cDNA被用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。(6B) PSK3敲除突變體與H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析。與野生型植物(Col-O)相t:匕，在擬南芥psk3-l突變體的子葉上H.arabidopsidis分離株Noco2的孢子形成減少大于50%。在接種后7天，將小植株收集在Iml水中，渦旋振蕩，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定釋放出的分生孢子的滴度。對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)說(shuō)，為每個(gè)株系和分析制備了 10個(gè)小植株的20個(gè)樣品。條表示平均值(±SD)。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果相近。通過(guò)Student’ s t_檢驗(yàn)來(lái)確定值與野生型相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(***P<0.0001)。圖7:PSK2或PSK4基因的過(guò)表達(dá)提高了對(duì)H.arabidopsidis、南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.1ncognita)和青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)的易感性。(7A)過(guò)量生產(chǎn)PSK2 (擬南芥株系p35S:PSK2)和PSK4(擬南芥株系p35S:PSK2)的轉(zhuǎn)基因株系與H.arabidopsidis的相互作用表型的定量分析。條表示平均值(±SD)。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果相近。通過(guò)Student’st-檢驗(yàn)來(lái)確定值與野生型相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(***P〈0.0001)。(7B)在組成性過(guò)表達(dá)PSK的轉(zhuǎn)基因株系中根結(jié)線蟲(chóng)感染被顯著刺激。在萌芽后14天，用150個(gè)表面除菌的新鮮孵化的南方根結(jié)線蟲(chóng)J2對(duì)擬南芥植物進(jìn)行體外感染。通過(guò)Student’ s t檢驗(yàn)來(lái)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(*P〈0.01,**P<0.001,***P<0.0001)。(7C)在組成性過(guò)表達(dá)PSK的轉(zhuǎn)基因株系中細(xì)菌繁殖被強(qiáng)烈增加。將4周齡植物用含有IO7個(gè)細(xì)菌/ml的致病性細(xì)菌分離株RD15的溶液進(jìn)行根部接種。為了分析細(xì)菌的內(nèi)部生長(zhǎng)，將三個(gè)接種后植物的地上部分稱重，并在添加無(wú)菌水(每克濕重2.0ml)后在 研缽中研磨。然后使用無(wú)菌水進(jìn)行研磨材料的各種不同稀釋，并將3x40 μ I細(xì)菌懸液點(diǎn)樣在含有固體SMSA培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿上(Elphinstone等，1996)，在30°C下生長(zhǎng)。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)每個(gè)擬南芥株系進(jìn)行三份平行測(cè)定。條表示平均值(土SD)。圖8:pskrl敲除突變體對(duì)H.arabidopsidis感染的易感性降低。(8A)AtPSKRl(基因座At2g02220 )的基因組組織、引物附著位點(diǎn)以及T-DNA在基因組DNA中的插入和方向的示意圖。(8B) RT-PCR揭示出野生型擬南芥(Col-N8846、Ws、Col-O和Col_8CS60000)中的PSKRl轉(zhuǎn)錄本。組成性表達(dá)的AtEFla基因(Atlg07930)轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增表明，相似量的完整cDNA被用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。(8C) pskrl等位基因突變體顯示出H.arabidopsidis孢子形成減少。對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來(lái)說(shuō)，為每個(gè)株系和分析制備了 10個(gè)小植株的20個(gè)樣品。條表示平均值(±SD),***指示通過(guò)Student’s t_檢驗(yàn)確定的野生型與突變體株系之間的顯著性差異，其中P〈0.0001。所有實(shí)驗(yàn)被重復(fù)3次并給出相近結(jié)果。1-1、1-2、1-3和1-4分別表不突變體 pskrl-1、pskrl-2、pskrl-3 和 pskrl-4。圖9:pskrl敲除突變體對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)感染的易感性降低。正如在接種后10天(IODpi)所分析的，在pskrl突變體和野生型植物中，線蟲(chóng)以相似程度感染根并引發(fā)菌癭形成。在21Dpi時(shí)，在pskrl突變體中觀察到成熟菌癭的量減少。在卵塊的單性繁殖生產(chǎn)期間，在不存在PSKRl的情況下線蟲(chóng)發(fā)育的抑制變得最為明顯，所述單性繁殖生產(chǎn)在pskrl突變體上在75Dpi時(shí)被強(qiáng)烈減少。數(shù)據(jù)表示來(lái)自于至少兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值(土SD)，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)每種株系的最少50個(gè)幼苗進(jìn)行了線蟲(chóng)感染評(píng)估。***表示通過(guò)Student’s t_檢驗(yàn)確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，其中P〈0.0001。圖10:pskrl敲除突變體對(duì)青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)感染的易感性降低。將具有Ws (A)和Col (B)遺傳背景的植物分別用致病性細(xì)菌分離株RD15和GMI1000進(jìn)行根部接種。從Jiffy盆的底部切出約2cm，并將植物暴露出的根在含有IO7個(gè)細(xì)菌/ml的懸液中浸泡3min。然后將植物轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室，日/夜周期分別為27°C、120-140y E m-ls-28小時(shí)和26°C 16小時(shí)，保持相對(duì)濕度為75%。在接種后3、4、5、6和7天，按照病害指數(shù)(DI)對(duì)接種后植物上的病害癥狀進(jìn)行評(píng)分，所述病害指數(shù)覆蓋DIO (無(wú)枯萎)和分別表示25%、50%、75%和100%葉片枯萎的DI1、DI2、DI3和DI4。顯示了具有相似結(jié)果的數(shù)次平行實(shí)驗(yàn)中的代表性實(shí)驗(yàn)，給出了來(lái)自于至少28株植物/株系的接種的平均值(土SD)。在接種后3至5天之間的細(xì)菌指數(shù)生長(zhǎng)期中，所有pskrl突變體具有顯著降低的易感性，其中P〈0.0001。擬南芥的Col遺傳背景(B)顯示出對(duì)青枯雷爾氏菌總體較高的易感性，并且pskrl突變的效應(yīng)在Ws遺傳背景(A)中在pskrl-2中最為顯著。通過(guò)將功能完整的PSKRl基因?qū)雙skrl-2遺傳背景中(互補(bǔ)擬南芥株系Cppskrl-2,與圖11的圖例說(shuō)明進(jìn)行比較),對(duì)青枯雷爾氏菌的全部易感性得以恢復(fù)。在組成性35S啟動(dòng)子控制下過(guò)表達(dá)PSKRl的株系(過(guò)表達(dá)株系PSKR1-0E，與圖11的圖例說(shuō)明進(jìn)行比較)中，觀察到病害在感染的晚期時(shí)間點(diǎn)加速。圖11:通過(guò)表達(dá)有功能的PSKR基因逆轉(zhuǎn)了 pskr突變體的降低的易感性。PSKR基因的過(guò)表達(dá)提高了對(duì)H.arabidopsidis的易感性。霜霉病易感性與PSKRl的表達(dá)相關(guān)(A)在用H.arabidopsidis感染后在pskrl-2突變體和轉(zhuǎn)基因株系中獲得的分生孢子/mg Fff的水平。在Cppskrl-2株系中，通過(guò)用包含At2g02220的1，771bb的翻譯起始密碼子5’區(qū)、3027bp的整個(gè)編碼 序列和650bp的3’非翻譯區(qū)的5，472bp的基因組片段進(jìn)行互補(bǔ)，pskrl-2 (Ws-O背景)的突變體表型被完全逆轉(zhuǎn)。通過(guò)PCR擴(kuò)增該基因組片段，將其克隆到Gateway目的載體pHGW (Karimi等,2002)中，并通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入pskrl-2中。PSKRl在Ws-O野生型中的過(guò)表達(dá)(株系PSKR1-0E)使霜霉病易感性增加幾乎100%。為了基因的過(guò)表達(dá)，從基因組DNA擴(kuò)增包括起始和終止密碼子的3，060bp的編碼區(qū)，將其克隆到Gateway目的載體pH2GW7 (Karimi等,2002)中，并通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入擬南芥中。如上所述進(jìn)行病原體測(cè)定。條表示平均值(±SD), ***表示通過(guò)Student’ s t_檢驗(yàn)確定的野生型與突變體株系之間的顯著性差異，其中P〈0.0001。所有實(shí)驗(yàn)被重復(fù)3次并給出相似結(jié)果。(B)在用H.arabidopsidis感染后獲得的在不同突變體和轉(zhuǎn)基因株系中的PSKRl表達(dá)水平。通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定擬南芥幼苗(播種后15天)中PSKRl轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)積累量。使用2_(ΔΔα)方法來(lái)計(jì)算表達(dá)比率，將UBP22 (At5gl0790)用于歸一化，并以野生型PSKRl表達(dá)作為參比物。條(土 SD)表示三個(gè)技術(shù)平行樣的平均值。圖12:pskrl突變體的降低的病害易感性不是組成性激活或病原體觸發(fā)的防御響應(yīng)的結(jié)果。擬南芥中水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(JA/乙烯)介導(dǎo)的防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活不依賴于PSKR1。SA、JA和JA/乙烯介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的標(biāo)志物基因分別是 PRla (At2gl4610)、PDFl.2 (At5g44420)和 PR4 (At3g04720)。在野生型(Ws)、突變體(pskrl-2)和轉(zhuǎn)基因PSKRl過(guò)表達(dá)株(PSKRl-OE)植物中，在用水或H.arabidopsidis分離株Emwal的分生孢子懸液(40，000個(gè)孢子/ml)對(duì)子葉進(jìn)行噴霧處理后，通過(guò)定量實(shí)時(shí)RT-PCR分析了這些防御相關(guān)基因的表達(dá)。在O時(shí)間點(diǎn)以及處理開(kāi)始后24、48、72和120小時(shí)，制備用于RNA提取和qRT-PCR的樣品。使用Q-Base軟件，用AtOXAl (At5g62050)和AtUBP22(At5gl0790)對(duì)標(biāo)志物基因轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)量進(jìn)行歸一化。顯示的是來(lái)自于3個(gè)技術(shù)平行樣的平均值(±SD)。兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)給出相似結(jié)果。圖13:PSKR1 的抑制引起青枯雷爾氏菌(R.soIanacearum)>H.arabidopsidis和南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.1ncognita)的增殖降低。(A，B)在pskrl-2突變體中，在不存在PSKRl的情況下細(xì)菌繁殖被強(qiáng)烈地減少。對(duì)于每個(gè)擬南芥株系，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)執(zhí)行三份平行測(cè)定。條表示平均值(土SDXA和B是相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖示，其中細(xì)菌滴度分別作為絕對(duì)值和對(duì)數(shù)值給出。細(xì)菌繁殖在pskrl-2突變體中急劇減少( 1，000倍)，在互補(bǔ)株系Cppskrl-2中恢復(fù)，并在過(guò)表達(dá)株系PSKRl-OE中增加( 2倍)。(C)在pskrl-2突變體中，在不存在PSKRl的情況下葉組織中的卵菌菌絲發(fā)育減少。將植物用40，000個(gè)孢子/ml進(jìn)行噴霧接種，并在接種后5天收集子葉。被感染子葉中菌絲的發(fā)育通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)觀察。在Ws野生型植物中觀察到充分發(fā)育的分枝菌絲網(wǎng)絡(luò)。這種網(wǎng)絡(luò)和菌絲分枝在不存在PSKRl的情況(株系pskrl-2)下被強(qiáng)烈地減少，但是在PSKRl過(guò)表達(dá)(株系PSKR1-0E)后變得異常。顯示的是代表性透射光學(xué)顯微照片。(D)在不存在PSKRl的情況下南方根結(jié)線蟲(chóng)卵塊生產(chǎn)的減少是巨細(xì)胞尺寸減小的結(jié)果。為了進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，在接種后第7、14和21天，將pskrl-2、PSKRl-OE和野生型植物(生態(tài)型Ws)的被線蟲(chóng)感染的根在含2%戊二醛的50mMPipes緩沖液(pH6.9)中固定,然后脫水并按照制造商所述包埋在Technovit7100 (Heraeus Kulzer,Wehrheim,Germany)中。將包 埋的組織切片(3 μ m),在0.05%甲苯胺藍(lán)中染色，固定在Depex(Sigma)中，并使用亮視野光學(xué)部件執(zhí)行顯微術(shù)。使用數(shù)字相機(jī)(Axiocam ;Zeiss)收集圖像。與對(duì)照相比，在接種后7天來(lái)自于pskrl-2和PSKRl-OE的菌癭的組織切片在菌癭和巨細(xì)胞形成方面未顯示出差異。在菌癭發(fā)育的較晚階段(接種后14和21天)，來(lái)自于pskrl-2突變體植物的巨細(xì)胞顯著更小。為了進(jìn)行巨細(xì)胞表面測(cè)量，使用AxioVision 乂4.8.1.0軟件檢查用甲苯胺藍(lán)染色的連續(xù)切片。選擇來(lái)自于每種表型至少50個(gè)菌癭中每個(gè)菌癭的3個(gè)最大的巨細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。在接種后14天，來(lái)自于pskrl-2突變體植物的菌癭與對(duì)照植物相比含有顯著更小的巨細(xì)胞。圖14:TILLING策略后鑒定到的在S1PSKR1中的番茄突變的圖示。在TILLING方法中被靶向的S1PSKR1基因組區(qū)域由箭頭靶I和靶2標(biāo)出。使用TILLING方法鑒定到的6個(gè)突變?nèi)缦?pskrl.1A88T, pskrl.2T119C, pskrl.3G502A, pskrl.4G856A, pskrl.5G2285A和pskrl.6G1978A。圖中還將蛋白結(jié)構(gòu)域表示為底部的箭頭，標(biāo)出了信號(hào)肽(SP)、富含亮氨酸的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(LRR)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和激酶結(jié)構(gòu)域。用大寫(xiě)字母標(biāo)出用于TILLING的引物附著位點(diǎn)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有有缺陷的PSK和/或PSK受體功能并對(duì)病原體具有抗性的植物的新穎且有效的方法?，F(xiàn)在，本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)PSK起到植物對(duì)植物病原體的抗性的負(fù)調(diào)控物的作用，也就是說(shuō)，它們的抑制通過(guò)降低易感性而提高抗性。就我們所知，這是植物中抗性受生長(zhǎng)因子負(fù)調(diào)控的第一個(gè)實(shí)例。因此，PSK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑代表了用于生產(chǎn)對(duì)病原體具有提高的抗性的目標(biāo)植物的新的且高度有價(jià)值的靶點(diǎn)。本發(fā)明人進(jìn)一步證實(shí)，具有有缺陷的PSK和/或PSK受體功能的植物對(duì)不同類型的病原體例如卵菌、線蟲(chóng)和細(xì)菌病原體具有降低的易感性，顯示出本發(fā)明的廣泛應(yīng)用。通過(guò)參考下面的定義，將最好地理解本公開(kāi):定義當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“PSK肽”是指起到植物抗性的負(fù)調(diào)控物作用的硫酸酯化的植物磺肽素肽。這樣的PSK肽優(yōu)選包含氨基酸序列H-Tyr (S03H) -1le-Tyr (S03H) -Thr-OH(SEQ ID NO:1)或氨基酸序列 H-Tyr (S03H)-1le-Tyr (S03H)-Thr-Gln-OH (SEQ ID NO:2),或其任何自然變體(例如在其他植物中存在或來(lái)自于多態(tài)現(xiàn)象的變體)。優(yōu)選情況下，PSK肽含有至少4個(gè)氨基酸。更優(yōu)選情況下，PSK肽含有至少5個(gè)氨基酸。典型情況下，PSK肽含有至少兩個(gè)硫酸酯化的氨基酸殘基，所述氨基酸殘基優(yōu)選為酪氨酸殘基。術(shù)語(yǔ)PSK肽還指稱所述肽的任何前體或未成熟形式，例如包含SEQ ID NO:3、4、5、6或7的氨基酸序列的PSK前體蛋白。PSK前體的具體實(shí)例包括包含選自SEQ ID NO:8_13的序列的三角葉楊(Populustrichocarpa)PSK 前體，包含選自 SEQ ID NO: 14_19、95、97、99、101、103 的序列的水稻(Oryza sativa)PSK前體,包含選自 SEQ ID NO:20_24 的序列的釀酒葡萄(Vitis vinifera)PSK前體，以及包含選自SEQ ID NO:69、71、73或75的序列的番茄(Solanum Iycopersicum)前體。在本發(fā)明的文本中，術(shù)語(yǔ)“PSK基因”是指編碼PSK肽(或其前體)的任何核酸。根據(jù)具體情況，術(shù)語(yǔ)“PSK基因”包括PSK DNA (例如基因組DNA)和PSK RNA (例如mRNA)。具體來(lái)說(shuō)，“PSK基因”包括編碼如上所定義的植物磺肽素肽或這樣的肽的自然變體的任何核酸。PSK 基因的實(shí)例 包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)、番爺(Solanum Iycopersicum(Lycopersicon esculentum))、7jC 稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghumbicolor)、小麥(Triticum aestivum)、蘆笑(Asparagus officinalis)、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)、舌甘菜(Beta vulgaris)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycinemax)、釀酒葡萄(Vitis vinifera)和胡蘿卜(Daucus carota)的 PSK 基因組 DNA 或 RNA。PSK基因的具體實(shí)例包含SEQ ID NO:25-29、86-90的核酸序列(擬南芥)，SEQ ID NO:68、70、72或74的核酸序列(番茄)，SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、105的核酸序列(水稻)。PSK基因或肽的其他實(shí)例如下所列:7k稻(Oryza sativa)GenBank:BAF11381.2，0s03g0232400NCBI 參考序列:ΝΡ_001050886.1，Swiss-Prot:Q9FRF9.1Q9FRF9, PSK3GenBank:AAG46077.1GenBank:BAF12800.1GenBank:EEC75912.1，假設(shè)的蛋白 0sl_12987GENE ID:43337080s03g0675600GenBank:ABF98161.1，推測(cè)的植物磺肽素3前體GenBank:EAZ28113.1，假設(shè)的蛋白 0sJ_12080
玉米(Zea mays)GenBank:ACG49207.1，PSK4GenBank:DAA00297.1, PSKNCBI 參考序列:NP_001105796.1，PSKlGenBank:ACG23972.1, PSKGenBank:ACG41544.1,植物磺肽素前體蛋白GenBank:ACG27399.1，植物磺肽素前體蛋白高梁(Sorghum bicolor) GENE ID:8085257S0RBIDRAFT_01g042120GENE ID:8084300S0RBIDRAFT_02g001950GenBank:EES08686.lS0RBIDRAFT_05g021760小壽(Triticum aestivum)GenBank:DAA00296.1，推測(cè)的植物磺肽素肽前體GenBank:ABG66637.1，植物磺肽素-α 2 前體GenBank:ABG66638.1，植物磺肽素-α 2 前體野牛.蘆算(蘆算(Asparagus officinalis))Swiss-Prot:Q9FS10, PSK GenBank:BAB20706.1，前植物磺肽素原油菜籽(甘藍(lán)型油菜(Brassica napus))GenBank:DAA00277.1，推測(cè)的植物磺肽素肽前體舌甘菜(Beta vulgaris)Swiss-Prot:CAK22422.1，植物磺肽素-α 肽前體番前(Solanum Iycopersicum)GenBank:DAA00287.1，PSK4馬鈴蓄(Solanum tuberosum)GenBank:DAA00294.1，PSKGenBank:DAA00293.1, PSK大豆(Glycine max)GenBank:ACU23402.1，植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00280.1，推測(cè)的植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00283.1，推測(cè)的植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00282.1，推測(cè)的植物磺肽素肽前體GenBank:DAA00279.1，推測(cè)的植物磺肽素肽前體葡萄(酉良酒葡萄(Vitis vinifera))GenBank:CBI38497.3, PSKGenBank:CAN65538.1 和 CBI25131.3，PSKGenBank:CBI 19372.1, PSKGenBank:CBI30250.3，未命名的蛋白質(zhì)產(chǎn)物GenBank:CBI 17083.3
GenBank:CAN62427.1，假設(shè)的蛋白質(zhì)香蕉(Musa acuminata)GenBank:ABF70025.1，植物磺肽素家族蛋白百臼菊(Zinnia violacea)Swiss-Prot:Q8H0B9，前植物磺肽素原木棉(Gossypium arboreum)GenBank:DAA00278.1，推測(cè)的植物磺肽素肽前體白楊(三角葉楊(Populus trichocarpa))NCBI 參考序列:ΧΡ_002320667.1，PSKGenBank:EEE98982.1，PSKNCBI 參考序列:ΧΡ_002320021.1，PSKNCBI 參考序列:ΧΡ_002301142.1，PSKGenBank:EEE87877.1松樹(shù)(火炬松(Pinus taeda))GenBank:DAA00 289.1, PSK花旗松(Pseudotsuga menziesii)GenBank:ACH59688.1GenBank:ACH59689.1GenBank:ACH59690.1GenBank:ACH59691.1GenBank:ACH59692.1GenBank:ACH59693.1GenBank:ACH59694.1GenBank:ACH59695.1GenBank:ACH59696.1GenBank:ACH59697.1GenBank:ACH59698.1GenBank:ACH59699.1GenBank:ACH59701.1GenBank:ACH59702.1GenBank:ACH59703.1GenBank:ACH59704.1GenBank:ACH59705.1GenBank:ACH59706.1GenBank:ACH59707.1GenBank:ACH59708.1GenBank:ACH59709.1當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“PSKR”或“PSK受體”是指PSK肽的受體。典型情況下，PSKR具有與如上定義的PSK肽結(jié)合的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和具有激酶活性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)從包括擬南芥、番茄、胡蘿卜、水稻和釀酒葡萄在內(nèi)的多個(gè)物種分離并克隆了PSKR0 PSKR的示例性序列被提供為SEQ ID NO:30、31 (擬南芥)，SEQ ID NO:32 (胡蘿卜)，SEQ ID NO:33 (釀酒葡萄)，SEQ ID NO:111,113 (三角葉楊)，SEQ ID NO:34、107、109 (水稻)和SEQ ID NO: 35、114 (番茄)。本發(fā)明的優(yōu)選PSKR是PSKRl受體。“PSKR基因”是指編碼PSKR受體的任何核酸。具體來(lái)說(shuō)，視情況而定，“PSKR基因”可以是編碼植物磺肽素肽的受體的任何DNA或RNA。PSKR基因的具體實(shí)例包括包含SEQ IDNO:36或37的序列的核酸，所述序列編碼擬南芥的PSKRl或PSKR2的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“PSKR基因”編碼PSKRl或PSKR2蛋白的任何天然變體或同源物。PSKR基因的實(shí)例包括番茄、胡蘿卜、釀酒葡萄的PSKR基因或RNA。示例性序列被提供為SEQ ID NO:38、39、40、67、91、92、93、108、109、110 或 112。在本發(fā)明的文本中，術(shù)語(yǔ)“病原體”總的來(lái)說(shuō)是指植物的所有病原體。更具體來(lái)說(shuō)，病原體是真菌、卵菌、線蟲(chóng)或細(xì)菌病原體。在特定實(shí)施方案中，真菌病原體是谷類植物的真菌病原體。這樣的病原體的實(shí)例包括但不限于稻痕病菌屬(Magnaporthe)、柄銹菌屬(Puccinia)、曲霉屬(Aspergillus)、黑粉菌屬(UstiIago)、殼針孢屬(Septoria)、白粉菌屬(Erisyphe)、絲核菌屬(Rhizoctonia)和鏈抱霉屬(Fusarium)菌種。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，病原體是活體營(yíng)養(yǎng)或半活體營(yíng)養(yǎng)的選自疫霉屬(Phytophthora)、霜霉屬(Peronospora)、Hyaloperonospora 屬和單軸霉屬(Plasmopara)的卵菌病原體。最優(yōu)選的卵菌病原體是Hyaloperonospora arabidopsidis、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、致病 疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和葡萄單軸霉(Plasmopara viticola)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病原體是線蟲(chóng)病原體。最優(yōu)選的線蟲(chóng)病原體是根結(jié)線蟲(chóng)屬物種(Meloidogyne spp.)(南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.1ncognita)、爪睡根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)、花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.arenaria)、北方根結(jié)線蟲(chóng)(M.hapla)、擬禾本科根結(jié)線蟲(chóng)(M.graminicola))、球胞囊線蟲(chóng)屬物種(Globodera spp.)和異皮線蟲(chóng)屬物種(Heteroderaspp.)o在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，病原體是細(xì)菌病原體。最優(yōu)選的細(xì)菌病原體是青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)?，F(xiàn)在將進(jìn)一步更詳細(xì)地描述本發(fā)明的不同實(shí)施方案。除非另有指明，否則如此定義的每個(gè)實(shí)施方案可以與任何其他實(shí)施方案組合。具體來(lái)說(shuō)，被指明為優(yōu)選或有利的任何特征可以與被指明為優(yōu)選或有利的任何其他特征組合。PSK或PSKR缺陷的棺物如前所述，本發(fā)明是基于PSK和PSKR基因是植物對(duì)植物病原體的抗性的負(fù)調(diào)控物這一發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明人證實(shí)，PSK或PSKR基因的失活提高了植物對(duì)植物病原體的抗性。因此，本發(fā)明涉及基于PSK途徑的調(diào)控來(lái)提高植物中的病原體抗性的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)降低或抑制所述植物中的PSK功能以保護(hù)植物抵抗病原體的方法。本發(fā)明還涉及具有有缺陷的PSK功能的植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及適用于生產(chǎn)這樣的植物和細(xì)胞的構(gòu)建物(例如核酸、載體、細(xì)胞等)，以及用于生產(chǎn)植物抗性調(diào)控物的方法。根據(jù)第一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及包含有缺陷的PSK功能的植物或植物細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“PSK功能”表示在植物細(xì)胞中由PSK肽或受體介導(dǎo)的任何活性。PSK功能可以通過(guò)PSK基因表達(dá)或PSK肽活性以及PSKR基因表達(dá)或PSKR受體活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的文本中，與PSK功能相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“有缺陷的”、“失活的”或“失活”是指細(xì)胞或植物中存在的活性PSK肽或活性PSKR受體的水平降低。與野生型植物相比，這樣的降低典型為約20%，更優(yōu)選30%。降低可以是更加顯著(例如，超過(guò)50%、60%、70%、80%或更高)或完全的(即敲除植物)。PSK或其受體的失活可以通過(guò)在本技術(shù)領(lǐng)域中本身已知的技術(shù)來(lái)執(zhí)行，例如但不限于通過(guò)遺傳學(xué)方法、酶學(xué)技術(shù)、化學(xué)方法或其組合。失活可以在DNA、mRNA或蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行，并且抑制PSK或PSKR的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄或翻譯)或活性。優(yōu)選的失活方法影響表達(dá)，并引起在細(xì)胞內(nèi)不產(chǎn)生有功能的PSK肽和/或PSKR受體。應(yīng)該指出，PSK或PSKR的抑制可以是暫時(shí)或永久的。在第一實(shí)施方案中，通過(guò)在一個(gè)或多個(gè)PSK或PSKR基因中缺失、突變、插入和/或取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)獲得有缺陷的PSK或PSKR。在優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)植物中的所有PSK基因被失活。這可以通過(guò)在本技術(shù)領(lǐng)域中本身已知的技術(shù)來(lái)執(zhí)行，所述技術(shù)例如為位點(diǎn)特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導(dǎo)基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、同源重組、接合等。本發(fā)明的TILLING方法旨在從誘變?nèi)后w中鑒定PSK或PSKR基因中的SNP(單核苷酸多態(tài)性)和/或插入和/或缺失。它能夠提供一系列等位的沉默、錯(cuò)義、無(wú)義和剪接位點(diǎn)突變，以研究基因中各種突變的效應(yīng)。EcoTILLING是TILLING的一種變體，其研究群體中的自然遺傳變異。另一種特定方法是通過(guò)插入外來(lái)序列，例如通過(guò)使用被稱為轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)遺傳元件的轉(zhuǎn)座子誘變來(lái)進(jìn)行基因 失活，所述轉(zhuǎn)座子可以是自然或人造來(lái)源的。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，有缺陷的PSK或PSKR是通過(guò)敲除技術(shù)來(lái)獲得的，例如使基因的全部或一部分缺失，被缺失部分的尺寸足以防止從所述基因表達(dá)有功能的蛋白。被缺失部分優(yōu)選包含基因的至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸。在特定實(shí)施方案中，用插入的外來(lái)核酸代替基因組中被缺失的基因或部分。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，通過(guò)使用RNA干擾、核酶或反義技術(shù)進(jìn)行基因沉默來(lái)獲得有缺陷的PSK或PSKR。在特定實(shí)施方案中，用于基因沉默的抑制性核酸分子包含與數(shù)個(gè)PSK或PSKR基因或RNA共有的序列互補(bǔ)的序列。優(yōu)選情況下，這樣的抑制性核酸分子包含與同一物種的所有PSK基因或RNA或PSKR基因或RNA中存在的序列互補(bǔ)的序列，所述物種例如擬南芥、番爺、水稻、玉米、高粱、小麥、蘆契^甘藍(lán)型油菜、甜菜、馬鈴薯、大豆、釀酒葡萄和/或胡蘿卜。也可以通過(guò)突變或沉默參與PSK或PSKR生物合成途徑的基因，例如PSK酪氨酸殘基的硫酸酯化所需的磺基轉(zhuǎn)移酶(SOT)的編碼基因，來(lái)減少植物中PSK或PSKR的合成。可選地，也可以通過(guò)表達(dá)(過(guò)表達(dá))PSK或PSKR的負(fù)調(diào)控物例如轉(zhuǎn)錄因子或第二信使，來(lái)操縱PSK或PSKR的合成和/或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在植物中表達(dá)(過(guò)表達(dá))參與PSK或PSKR合成的基因的突變的等位基因。也可以例如通過(guò)向植物施加(例如噴灑)外源試劑例如抑制PSK或PSKR活性的分子，來(lái)暫時(shí)地執(zhí)行PSK或PSKR的失活。
優(yōu)選的失活是由破壞PSK或PSKR基因的完整性、例如通過(guò)缺失基因序列的片段(例如至少50個(gè)連續(xù)的bp)和/或插入外來(lái)序列而產(chǎn)生的永久性失活。正如在實(shí)施例中所示的，具有有缺陷的PSK或PSKR基因的psk或pskr敲除植物仍然是活的，不顯示異常發(fā)育表型，并且表現(xiàn)出對(duì)植物病原體的抗性提高。在特定實(shí)施方案中，通過(guò)敲除技術(shù)使一個(gè)以上的PSK或PSKR基因變成有缺陷的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在PSK肽的水平上獲得有缺陷的PSK功能。例如，可以通過(guò)將植物暴露于針對(duì)PSK肽的抗體(例如抗磺基酪氨酸單克隆抗體)或通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)所述抗體，來(lái)失活PSK肽。還可以通過(guò)將植物暴露于含有細(xì)胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域但不含細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的PSKR或通過(guò)過(guò)表達(dá)所述PSKR，來(lái)失活PSK肽。

可選地，通過(guò)改變PSKR受體的活性來(lái)獲得有缺陷的PSK功能。更具體來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)PSKR受體的拮抗劑來(lái)失活PSKR受體。在特定實(shí)施方案中，這樣的拮抗劑結(jié)合于PSKR受體的Glu503-Lys517殘基。因此，可以在PSK 基因組 DNA、PSK mRNA、PSK 肽、PSKR 基因組 DNA、PSKR mRNA 或PSKR受體活性的水平上控制PSK在植物抗性中的功能。在一種變體中，本發(fā)明涉及對(duì)植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述植物包含失活的PSK基因，更具體來(lái)說(shuō)是失活的PSK基因組DNA。有缺陷的PSK基因優(yōu)選選自PSKl、PSK2、PSK3、PSK4和PSK5。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，植物中存在的所有PSK基因都是有缺陷的，例如全部PSK1-5基因。在另一種變體中，本發(fā)明涉及對(duì)植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述植物包含失活的PSK肽。在另一種變體中，本發(fā)明涉及對(duì)植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述提高的抗性是由PSKR基因組DNA的失活造成的。有缺陷的PSKR基因可以是擬南芥PSKRl基因的直向同源基因。在另一種變體中，本發(fā)明涉及對(duì)植物病原體具有提高的抗性的植物，其中所述提高的抗性是由PSK或PSKR mRNA的失活造成的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及已通過(guò)PSK功能的失活被工程化改造成對(duì)植物病原體(更)有抗性的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，改良植物是喪失功能的psk或pskr突變體植物，對(duì)植物病原體具有提高的抗性。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的種子，以及從所述種子長(zhǎng)成的或通過(guò)其他方式衍生的植物或植物的后代，所述植物對(duì)病原體具有提高的抗性。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的植物性材料,例如根、葉、花、愈合組織等。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)對(duì)病原體具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟:(a)失活植物細(xì)胞中的PSK和/或PSKR基因；(b)任選地，選擇具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的步驟(a)的植物細(xì)胞；(c)從步驟(a)或(b)的細(xì)胞再生成植物；以及(d)任選地，選擇對(duì)病原體具有提高的抗性的植物，所述對(duì)病原體具有提高的抗性的植物具有有缺陷的PSK或PSKR基因。
PSK和/或PSKR基因的失活可以如上所公開(kāi)的來(lái)進(jìn)行。PSK或PSKR基因中的遺傳改變，也可以按照例如由Toki等(2006)所描述的方案，使用Ti質(zhì)粒和土壤桿菌感染方法通過(guò)轉(zhuǎn)化來(lái)進(jìn)行。在優(yōu)選方法中，失活是由使用例如敲除技術(shù)進(jìn)行的PSK或PSKR基因破壞所造成的。具有有缺陷的PSK和/或PSKR基因的植物細(xì)胞的選擇，可以通過(guò)技術(shù)人員本身已知的技術(shù)(例如PCR、雜交、使用可選擇標(biāo)志物基因、蛋白定量、western印跡等)來(lái)進(jìn)行?？梢允褂眉夹g(shù)人員本身已知的方法獲得來(lái)自于改良細(xì)胞的植物世代。具體來(lái)說(shuō)，可以從愈合組織培養(yǎng)物或其他未分化的細(xì)胞生物質(zhì)誘導(dǎo)芽和根的形成。可以將由此獲得的小植株移栽出來(lái)并用于栽培。例如Fennell等(1992)Plant Cell Rep.11:567-570, Stoeger等(1995)Plant Cell Rep.14:273-278描述了從細(xì)胞再生成植物的方法。得到的植物可以按照本技術(shù)領(lǐng)域中已知的技術(shù)進(jìn)行育種和雜交。優(yōu)選情況下，應(yīng)該生長(zhǎng)兩代或更多代以便確保基因型或表型是穩(wěn)定并且可遺傳的。對(duì)病原體具有提高的抗性的植物的選擇，可以通過(guò)向植物施加病原體、測(cè)定抗性并與野生型植物進(jìn)行比較來(lái)進(jìn)行。在本發(fā)明的文本中，術(shù)語(yǔ)對(duì)病原體的“提高的抗性”是指抗性優(yōu)于尚未應(yīng)用本發(fā)明的方法的對(duì)照植物例如野生型植物的抗性。“提高的抗性”還表示由病原體引起的病害癥狀的表現(xiàn)減少、減弱或被阻止。病害癥狀優(yōu)選包括直接或間接對(duì)植物品質(zhì)，產(chǎn)量，植物在飼料、播種、生長(zhǎng)、收獲等中的用途造成不利影響的癥狀。這樣的癥狀包括例如植物或其部分(例如不同組織、葉、花、果實(shí)、種子、根、芽)的感染和病變、被感染組織表面上出現(xiàn)色點(diǎn)和孢子床、組織的浸解、真菌毒素的積累、組織壞死、組織的產(chǎn)孢病變、色斑等。優(yōu)選情況下，根據(jù)本發(fā)明，與對(duì)照植物相比，病害癥狀減少至少5%或10%或15%，更優(yōu)選至少20%或30%或40%，特別優(yōu)選50%或60%，最優(yōu)選70%或80%或90%或更高。術(shù)語(yǔ)植物對(duì)病原體的“提高的抗性”還表示植物對(duì)植物病原體感染的易感性降低或缺少這樣的易感性。本發(fā)明人第一次證實(shí)了 PSK或PSKR基因的表達(dá)與對(duì)感染的易感性之間的關(guān)聯(lián)性。正如在實(shí)驗(yàn)部分中所示的，用卵菌病原體感染植物觸發(fā)了 PSK和PSKRl基因的轉(zhuǎn)錄激活。此外，本發(fā)明人顯示，PSK基因和PSKRl的過(guò)表達(dá)促進(jìn)病害，而PSK3和PSKRl的敲除提高抗性。因此，本發(fā)明人提出，PSK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提高了植物對(duì)感染的易感性并有利于病害的發(fā)展。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，PSK或PSKR缺陷的植物對(duì)植物病原體的抗性是由這些植物失去對(duì)病原體的易感性造成的。本發(fā)明的優(yōu)選植物或細(xì)胞對(duì)于PSK或PSKR基因失活來(lái)說(shuō)應(yīng)該是純合的，即兩個(gè)PSK或PSKR等位基因均無(wú)活性。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法被用于產(chǎn)生具有有缺陷的PSK或PSKR基因并對(duì)卵菌、線蟲(chóng)和/或細(xì)菌病原體具有提高的抗性的雙子葉植物或單子葉植物。這樣的植物的實(shí)例以及它們抵抗病原體的能力被公開(kāi)在實(shí)驗(yàn)部分中。本發(fā)明的具體目的涉及茄科(Solanaceae)植物，優(yōu)選為番茄植物，其中所述植物的細(xì)胞缺少全部或一部分PSK或PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對(duì)病原體例如真菌、卵菌、線蟲(chóng)或細(xì)菌病原體表現(xiàn)出 提高的抗性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及番茄植物，其中所述植物的細(xì)胞缺少全部或一部分PSKRl基因。優(yōu)選的植物至少缺少如圖13所公開(kāi)的靶I或靶2中的基因的一部分(即超過(guò)50個(gè)連續(xù)核苷酸)。更優(yōu)選情況下，被缺失部分涵蓋至少一個(gè)下述核苷酸:A88，T119，G502, G856，G2285和G1978。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的涉及茄科植物，優(yōu)選為番茄植物，其中所述植物的細(xì)胞具有突變的PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對(duì)病原體例如真菌、卵菌、線蟲(chóng)或細(xì)菌病原體表現(xiàn)出提高的抗性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，突變存在于如圖13所公開(kāi)的靶I和靶2結(jié)構(gòu)域中。更優(yōu)選情況下，突變選自pskrl.1A88T、pskrl.2T119C、pskrl.3G502A、pskrl.4G856A、pskrl.5G2285A 和 pskrl.6G1978A。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的涉及傘形科(Apiaceae)植物，優(yōu)選為胡蘿卜植物，其中所述植物的細(xì)胞缺少全部或一部分PSK或PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對(duì)病原體例如真菌、卵菌、線蟲(chóng)或細(xì)菌病原體表現(xiàn)出提高的抗性。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的涉及禾本科(Poaceae )植物,優(yōu)選為小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米植物，其中所述植物的細(xì)胞缺少全部或一部分PSK或PSKRl基因并且PSK功能是有缺陷的。這樣的植物對(duì)病原體例如真菌、卵菌、線蟲(chóng)或細(xì)菌病原體表現(xiàn)出提高的抗性。棺物杭件調(diào)節(jié)物的篩詵本發(fā)明還公開(kāi)了選擇或生產(chǎn)植物抗性調(diào)控物的新方法，以及在這樣的方法中使用的工具和構(gòu)建物。在特定方面，本發(fā)明涉及用于篩選或鑒定調(diào)節(jié)植物抗性的分子的方法，所述方法包括測(cè)試候選化合物是否調(diào)節(jié)PSKR基因的表達(dá)或活性。所述測(cè)試可以在含有被克隆在PSKR啟動(dòng)子序列控制下的報(bào)告物DNA構(gòu)建物的細(xì)胞或表達(dá)PSKR或PSKR融合蛋白的細(xì)胞中進(jìn)行。優(yōu)選情況下，這樣的方法包括以下步驟:
-提供包含核酸構(gòu)建物的細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建物包含與報(bào)告基因可操作連接的PSKR基因啟動(dòng)子序列；-將所述細(xì)胞與候選分子相接觸；-通過(guò)監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞中由報(bào)告基因編碼的標(biāo)志物蛋白的表達(dá)來(lái)測(cè)定PSKR啟動(dòng)子的活性；以及-選擇調(diào)節(jié)所述標(biāo)志物蛋白的表達(dá)的分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及用于篩選或鑒定調(diào)節(jié)PSKR活性的分子的方法，所述方法包括以下步驟:-提供細(xì)胞，所述細(xì)胞包含在轉(zhuǎn)錄因子控制下的報(bào)告基因以及包含與所述轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的PSKR蛋白的融合蛋白；-將所述細(xì)胞與另一個(gè)融合蛋白相接觸，所述另一個(gè)融合蛋白包含與所述轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合的候選分子；-通過(guò)監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞中由報(bào)告基因編碼的標(biāo)志物蛋白的表達(dá)來(lái)測(cè)定PSKR的活性，所述標(biāo)志物蛋白只有在兩種融合蛋白相互作用時(shí)才表達(dá)；-選擇誘導(dǎo)所述標(biāo)志物蛋白的表達(dá)的分子。優(yōu)選的調(diào)節(jié)物是PSKR表達(dá)的抑制物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及抑制PSKR表達(dá)或活性的化合物用于提高植物對(duì)植物病原體的抗性的用途。典型地使用上述篩選方法來(lái)鑒定這樣的化合物。這樣的化合物的使用典型地包括通過(guò)例如噴灑或浸泡在與水的混合物中將植物暴露于這樣的化合物，由此引起PSK暫時(shí)失活以及對(duì)病原體的抗性的暫時(shí)提高。就此而言，本發(fā)明還涉及與PSK肽或受體特異性結(jié)合的抗體，或這樣的抗體的具有基本上相同的抗原特異性的片段或衍生物。這樣的抗體可以是多克隆抗體，或者更優(yōu)選是單克隆抗體。抗體片段的實(shí)例包括Fab片段、Fab’片段、CDR結(jié)構(gòu)域。衍生物的實(shí)例包括單鏈抗體、人源化抗體、重組抗體等。這樣的抗體可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域中本身已知的技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，例如免疫和多克隆抗體的分離，或免疫、分離抗體產(chǎn)生細(xì)胞、選擇并將其與例如骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤。可以使用已知技術(shù)來(lái)制備片段及其衍生物。PSK肽或受體的特異性抗體是與這樣的肽或受體結(jié)合的親和性比與其他肽或受體結(jié)合的親和性高的抗體。優(yōu)選的特異性抗體基本上不與其他肽或受體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及與PSKR相互作用、為功能性PSKR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的、并可以作為附加的靶點(diǎn)進(jìn)行失活以提高抗性的蛋白的鑒定方法。這樣的篩選方法優(yōu)選為允許鑒定細(xì)胞質(zhì)與膜結(jié)合蛋白的相互作用對(duì)的Y2H系統(tǒng)，例如分離-泛素(split-ubiquitin)系統(tǒng)(Stagljar等，1998)和基于交配的分離-泛素(mating-basedsplit-ubiquitin)系統(tǒng)(Grefen等，2009)。也可以使用在酵母核中起作用的經(jīng)典GAL4Y2H系統(tǒng)(Fields和Song，1989)來(lái)鑒定與單個(gè)PKSR結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)被提供在下面的實(shí)施例中，提供所述實(shí)施例是出于示例的目的而不是為了限制。
實(shí)施例材料和方法用于植物磺肽素PSK1、PSK2、PSK3、PSK4、PSK5及其受體PSKRl的編碼基因的功能分析的突變體和轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis)株系的產(chǎn)生。本發(fā)明人對(duì)表I中列出的數(shù)種突變體和轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了分析。表1:突變體和轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis)株系
權(quán)利要求
1.用于保護(hù)植物抵抗病原體的方法，所述方法包括永久或暫時(shí)地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素(PSK)功能的步驟。
2.用于提高植物中的病原體抗性的方法，所述方法包括永久或暫時(shí)地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素(PSK)功能的步驟。
3.用于減少植物中的病原體增殖的方法，所述方法包括永久或暫時(shí)地抑制所述植物或其先祖中的植物磺肽素(PSK)功能的步驟。
4.權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)的方法，其中所述植物具有有缺陷的PSK基因、有缺陷的PSK肽、有缺陷的PSK受體(PSKR)基因和/或有缺陷的PSKR受體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代、位點(diǎn)特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導(dǎo)基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、敲除技術(shù)、用核酶或反義核酸失活、或由RNA干擾誘導(dǎo)的基因沉默，所述PSK基因或PSKR基因是有缺陷的。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述PSK基因和/或PSKR基因被完全或部分缺失。
7.權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)的方法，其中當(dāng)所述植物細(xì)胞中存在PSK基因的數(shù)個(gè)拷貝時(shí)，使PSK基因的每個(gè)拷貝變成有缺陷的。
8.權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)的植物，其中在所述植物細(xì)胞中，使PSKRl基因和PSKR2基因變成有缺陷的。
9.權(quán)利要求4的方法，其中通過(guò)將所述植物暴露于針對(duì)PSK肽的抗體或可溶性PSKR受體或者通過(guò)在所述植物中表達(dá)針對(duì)PSK肽的抗體或可溶性PSKR受體，來(lái)失活所述PSK肽。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述植物病原體選自真菌、卵菌、線蟲(chóng)或細(xì)菌。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是雙子葉植物，優(yōu)選自茄科(Solanaceae)植物(例如番爺)、百合科(Liliaceae)植物(例如蘆笑)、傘形科(Apiaceae)植物(例如胡蘿卜)、藜科(Chenopodiaceae)植物(例如甜菜)、葡萄科(Vitaceae)植物(例如葡萄)、豆科(Fabaceae)植物(例如大豆)、葫蘆科(Cucurbitaceae)植物(例如黃瓜)或十字花科(Brassicacea)植物(例如油菜籽、擬南芥(Arabidopsis thaliana)),或者是單子葉植物，優(yōu)選自禾本科(Poaceae )谷類植物(例如小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米)。
12.用于生產(chǎn)對(duì)植物病原體具有提高的抗性的植物的方法，其中所述方法包括以下步驟 (a)失活植物細(xì)胞中的PSK基因和/或PSKR基因； (b)任選地，選擇具有有缺陷的PSK基因和/或PSKR基因的步驟(a)的植物細(xì)胞； (c)從步驟(a)或(b)的細(xì)胞再生成植物；以及 Cd)任選地，選擇對(duì)病原體具有提高的抗性的(c)的植物，所述植物具有有缺陷的PSK基因或PSKR基因。
13.權(quán)利要求12的方法，其中在步驟(a)中，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代、位點(diǎn)特異性誘變、甲磺酸乙酯(EMS)誘變、定向誘導(dǎo)基因組局部突變(TILLING)、EcoTILLING、敲除技術(shù)或通過(guò)由RNA干擾誘導(dǎo)的基因沉默來(lái)失活所述PSK基因或PSKR基因。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述植物是雙子葉植物，優(yōu)選自茄科(Solanaceae)植物(例如番茄)、百合科(LiIiaceae)植物(例如蘆筍)、傘形科(Apiaceae)植物(例如胡蘿卜)、藜科(Chenopodiaceae)植物(例如甜菜)、葡萄科(Vitaceae)植物(例如葡萄)、豆科(Fabaceae)植物(例如大豆)、葫蘆科(Cucurbitaceae)植物(例如黃瓜)或十字花科(Brassicacea)植物(例如油菜籽、擬南芥(Arabidopsis thaliana)),或者是單子葉植物，優(yōu)選自禾本科(Poaceae )谷類植物(例如小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱或玉米)。
15.權(quán)利要求12至14任一項(xiàng)的方法，其中所述植物病原體選自真菌、卵菌、線蟲(chóng)或細(xì)菌。
16.抑制PSK基因或PSKR基因的表達(dá)的RNAi分子的以下用途用于提高植物或植物細(xì)胞對(duì)植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細(xì)胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護(hù)植物或植物細(xì)胞抵抗植物病原體。
17.調(diào)節(jié)PSKR基因表達(dá)的分子的鑒定方法，所述方法包括 Ca)提供包含核酸構(gòu)建物的細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建物包含與報(bào)告基因可操作連接的PSKR基因啟動(dòng)子序列； (b)將所述細(xì)胞與候選分子相接觸； (c)通過(guò)監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞中由報(bào)告基因編碼的標(biāo)志物蛋白的表達(dá)來(lái)測(cè)定PSKR啟動(dòng)子的活性； Cd)選擇調(diào)節(jié)所述標(biāo)志物蛋白的表達(dá)的分子。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述分子抑制PSKR的表達(dá)。
19.按照權(quán)利要求17或18選擇的分子的以下用途用于提高植物對(duì)植物病原體的抗性，和/或用于減少植物或植物細(xì)胞中的植物病原體增殖，和/或用于保護(hù)植物或植物細(xì)胞抵抗植物病原體。
20.與PSK肽或PSK受體特異性結(jié)合的抗體，或這樣的抗體的具有基本上相同的抗原特異性的片段或衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及參與植物病原體抗性的負(fù)調(diào)控的植物基因及其用途。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及具有有缺陷的植物磺肽素(PSK)功能并表現(xiàn)出對(duì)植物病原體的抗性提高的植物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)對(duì)各種病害有抗性的改良植物的方法。此外，本發(fā)明涉及具有有缺陷的PSK受體(PSKR)功能的植物，以及篩選和鑒定調(diào)節(jié)PSKR表達(dá)或活性的分子的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103237893SQ201180046167
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者娜塔莉亞·羅迪克, 伊夫斯·馬可, 布魯諾·法維里, 哈拉爾德·凱勒 申請(qǐng)人:加諾普蘭特-維勒公司