專利名稱：Hiv重組融合抗原及其表達基因和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體是涉及一種HIV重組融合抗原及其表達基因和制備方法。
背景技術(shù)：
艾滋病(獲得性免疫系統(tǒng)缺陷癥，AIDS)是當今世界矚目的嚴重危害人類健康的病毒性疾病。引起艾滋病的主要病原是人I型和II型免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)。HIV 感染者因免疫缺陷程度加深，從無癥狀攜帶者發(fā)展至嚴重免疫功能衰竭，導致多種致死性疾病的發(fā)展而死亡。根據(jù)WHO 2007年全球健康報告顯示，截止到2007年底全球HIV感染者估計為3320萬例，僅2007年全球新HIV感染者達270萬例。在發(fā)展中國家，由于經(jīng)濟、 文化和教育等多方面的原因，HIV的流行越演越烈，部分國家已失去對疾病流行的控制，而我國也趨于爆發(fā)性流行的前期階段。HIV基因全長約9. 81Λ，含有g(shù)ag、pol、env3個結(jié)構(gòu)基因、2個調(diào)節(jié)基因(tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表達調(diào)節(jié)子)和4個輔助基因(nef負調(diào)控因子、vpr病毒r蛋白、 vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)。HIV是一種變異性很強的病毒，各基因的變異程度不同，env基因變異率最高。根據(jù)HIV基因差異，分為HIV-I型和HIV-2型。在HIV-1和HIV-2 二型之間，其核苷酸序列只有40-60%的同源性。在HIV-I型內(nèi)，各亞型之間的基因離散率是20% -35%, 同一亞型內(nèi)的基因離散率是7% -20%。目前全球流行的主要是HIV-I，根據(jù)編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag 基因序列的同源性，HIV-I型又進一步分為3個組，M亞型組(main即主要組)、0亞型組 (outline即外圍組)和N亞型組(new，or non-M, non-0新組或非M非0組)，其中M組有 A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，J，K11個亞型。此外，近年來發(fā)現(xiàn)多個流行重組型。0組是1990年從喀麥隆和加蓬分離到的，與M組其他亞型的氨基酸序列只有50%的同源性。N組是最近才從兩名喀麥隆病人分離到的，在系統(tǒng)樹上，既不屬于M組，也不屬于0組的一組新病毒，故稱N組。HIV-2的生物學特性與HIV-I相似，但其傳染性較低，引起的艾滋病臨床進展較慢，癥狀較輕。HIV-2型至少有A，B, C，D，E，F(xiàn)，G7個亞型。我國以HIV-I為主要流行株，已發(fā)現(xiàn)的有A、B (歐美B)、B，(泰國B)、C、D、E、F和 G8個亞型，還有不同流行重組型。1999年起在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)并證實我國有少數(shù)HIV-2型感染者。及時發(fā)現(xiàn)并鑒定HIV各種亞型對于追蹤流行趨勢、及時做出診斷、開發(fā)新的診斷試劑和新藥研制、疫苗開發(fā)均具有重要意義。HIV感染的實驗室檢測在HIV感染的診斷、疾病進展的監(jiān)測、抗病毒療效觀察和耐藥性監(jiān)測中至關(guān)重要，對疾病流行的控制也有重大意義。HIV的診斷分篩查階段和確認試驗，各種診斷試劑主要是用免疫方法檢測血清或體液中的HIV特異的抗體如gp41或gp36 抗體和HIV-I的PM抗原。
現(xiàn)在對HIV的檢測方法主要是使用血清學方法，用酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA檢測病人血清中的HIV抗體進行初篩，再用免疫印跡實驗進行確認，核酸檢測作為一種補充，在診斷HIV陽性母親所生嬰兒和處于HIV抗體窗口期的感染者發(fā)揮重要作用，但由于HIV的高度變異性，各亞型的抗原決定簇部位刺激機體產(chǎn)生特異性抗體可有一定差異，可以產(chǎn)生不同的抗原抗體反應，有報道表明，0組的HIV感染者血清與現(xiàn)有的HIV診斷試劑反應很弱出現(xiàn)很多假陰性結(jié)果，法國巴斯德研究所L. Montagnier也報道他們的一例1990年感染 1992年死亡的0組HIV引起的艾滋病病例，正是由于用常規(guī)試劑難于檢出而造成。雖然0 亞型在最近幾年通過向抗體檢測初篩試劑和確認試劑中加入合成肽，HIV-I的0組可被檢測出來，但其敏感性仍有待進一步的觀察，因為HIV任何變異所造成的抗原結(jié)構(gòu)細微改變都可能影響其敏感性。同時，由于現(xiàn)有的無論是血清學檢測試劑還是核酸檢測試劑都是以流行于歐美的B亞型病毒株為基礎(chǔ)的，其對非B亞型毒株檢測的敏感性有待進一步證實，有研究報道表明，在抗體陽轉(zhuǎn)期間，應用取自B亞型抗原的抗體檢測初篩試劑盒可發(fā)現(xiàn)在檢測非B亞型時敏感性較低。并且，目前所用的幾種用于檢測核酸的試劑盒，在檢測非B亞型 HIV-I感染者時，或者不能檢測，或者不能正確定量病毒量。對HIV-2型和HIV-I的O組尚不能定量檢測其病毒RNA。因此，提高現(xiàn)有檢測試劑盒檢測各亞型的敏感性和研制能定量檢測HIV-2型和HIV-I型中的0組病毒的試劑盒應是當務之急。HIV抗體檢測是HIV感染診斷的主要方法。HIV抗體檢測經(jīng)多年的發(fā)展，現(xiàn)已發(fā)展成多種成熟的檢測系統(tǒng)與技術(shù)如ELSIA HIV抗體檢測技術(shù)及免疫層析技術(shù)等。1990年，第二代ELSIA試劑應運而生，該試劑使用基因工程方法得到重組抗原和合成肽包被反應板， 由于純化抗原的使用，HIV抗體檢測的特異性有了很大的提高。后在此基礎(chǔ)上發(fā)展了第三代、第四代產(chǎn)品。其他HIV抗體檢測方法也迅速發(fā)展。而這些技術(shù)的應用的關(guān)鍵還是HIV 特意性抗原的開發(fā)與研制生產(chǎn)。因此，HIV抗體檢測相關(guān)重組抗原的研發(fā)具有重要的意義。早在二十世紀八十年代末，國外就有不少文獻報道重組HIV抗原的研發(fā)并將其應用于ELISA等技術(shù)檢測HIV抗體。早期的重組HIV抗原經(jīng)過不斷改進，目前在檢測的靈敏度與特異性上都有很大的改進。HIV抗體檢測ELISA第四代試劑于1998年在歐洲注冊使用。 第四代試劑在第三代的基礎(chǔ)上進一步增加了 PM抗原的檢測，把HIV抗原和抗p24的抗體同時包被在反應板，同時檢測血清中的HIV抗體和pM抗原，進一步縮短窗口期。與第三代試劑相比，第四代試劑檢測窗口期大約平均縮短了 4-5天。隨著對感染者和艾滋病患者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的進展，以及對無癥狀HIV感染者提供資源咨詢檢測的迫切需求，HIV檢測試劑，一方面朝著提高靈敏度、高特異性，縮短窗口期的方向發(fā)展，另一方面，朝著簡便快速方向發(fā)展。目前已有PA((明膠顆粒凝集實驗)、Determine、斑點印跡(dot immunoassay) 免疫層析等簡便快速方法。現(xiàn)發(fā)展的艾滋病唾液檢測卡及艾滋尿液抗體檢測，不需要艾滋抗體檢測的抽血步驟，在樣本要求上不再依賴于血清，降低采血過程中交叉污染的可能性， 更加方便家庭HIV抗體的篩查。以唾液為標本測定HIV抗體的EIA、WB試劑已獲得美國FDA 批準，國內(nèi)尚無銷售。1996年美國FDA首次批準HIV-I尿檢EIA試劑，我國也在研制。主要適用于靜脈注射品(IDUs)人群和其他高危人群的大面積流行病學調(diào)查。陽性標本仍需采血做確認試驗才能確認HIV抗體陽性。為順應高靈敏度、高特異性的HIV抗體檢測試劑的發(fā)展，重組HIV抗原生物原材料的研發(fā)也在不斷發(fā)展。研發(fā)應用于HIV抗體檢測的重組抗原有病毒多聚酶蛋白p66、p51 ；病毒顆粒蛋白pl7、pM及病毒包膜蛋白gpl20和gp41。利用重組產(chǎn)生的gp41作為抗原檢測抗HIV抗體的嘗試已被描述。不幸的是，HIV-lgp41和HIV-2gp36在生理緩沖條件下基本上是不溶的。利用特別高或低的PH值是在溶液中保持gp41或gp36的溶解狀態(tài)的一個途徑。重組產(chǎn)生的gp41已知在pH 3.0周圍一下，或在pH 11.0周圍以上是可溶的。一般來說，免疫測試是在生理PH下進行的。這就使得重組HIV gp41抗原應用于抗體檢測的應用特別是特異性與靈敏度受到了一定的限制。由于gp41或gp36高度的疏水性，重組表達的抗原一般都以包涵體形式表達，且包涵體需要PH 11.0周圍以上才具有可溶性，這樣給后續(xù)的純化及復性帶來極大的困難。且對重組抗原應用于免疫抗體檢測也造成了許多的限制。且單獨的gp41或gp36重組抗原只能單獨檢測HIV-I或HIV-2抗體，不能同時檢測HIV-I及HIV-2型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種可以同時檢測HIV-I及HIV-2型的重
組融合抗原。解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種HIV重組融合抗原，其由SEQ ID NO. 1所示氨基酸、連接子以及SEQ IDN0. 3 所示氨基酸順次組合構(gòu)成，所述連接子為6-10個分子量小的、極性且親水的氨基酸構(gòu)成。優(yōu)選地，所示連接子的氨基酸組成如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述HIV重組融合抗原的表達基因。解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下一種編碼上述HIV重組融合抗原的表達基因，包括a 其核苷酸序列由SEQID NO. 4 和編碼連接子的堿基序列和SEQ ID NO. 6所組成；b 與a的核苷酸序列編碼相相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與a的核苷酸序列不同的序列；c 對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述編碼連接子的堿基序列如SEQ ID NO. 5所示。本發(fā)明另一發(fā)明目的是提供上述HIV重組融合抗原的制備方法。實現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下上述HIV重組融合抗原的制備方法，其步驟如下(1)將上述編碼融合抗原的表達基因序列合成，克隆連入PMD18-T simpleVector 載體，得到含目的基因的T載體；(2)T載體經(jīng)BamH I和HindiII雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收，與經(jīng)BamH I和 HindIII酶切過的質(zhì)粒pET-28a連接；(3)熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5a株，涂布于含 34-55 μ g/ml Kan的LB平板，篩選得到陽性質(zhì)粒；(4)重組蛋白表達工程菌株的構(gòu)建與誘導表達采用CaCl2將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，培養(yǎng)；挑取單菌落接種至含34-55 μ g/ml Kan的 5mL LB液體培養(yǎng)基中，370C，震蕩培養(yǎng)過夜；次日，轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，震蕩培養(yǎng)至0D600值約為0. 6時加入IPTG至終濃度1. OmM,誘導培養(yǎng)3_4h，SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達，得到HIV重組融合抗原。
優(yōu)選地，所述制備方法還包括對HIV重組融合抗原的純化將包涵體形式的HIV重組融合抗原在0. 5 % -1 %的中性去垢劑用脲素梯度反復多次洗滌初步純化，變性溶解，利用金屬螯合層析法親和層析。更優(yōu)選地，所述溶解液為PH8.0，20mM Tris, 1% tween-20, 8M脲。本發(fā)明旨在研發(fā)一種重組融合的gp41+gp36蛋白，可同時檢測HIV-1及HIV-2抗體，優(yōu)選出此兩個蛋白的保守免疫優(yōu)勢表位，具有很好的檢測靈敏度，可檢測HIV-I病毒B 亞型及其非B亞型病毒株，同時可以檢測HIV-2型病毒。此外，此融合抗原在設(shè)計上，經(jīng)過對HIV-lgp41蛋白的疏水氨基酸進行改造用以提高抗原的親水性而不損害抗原性，提高此抗原的親水性，同時融合抗原在設(shè)計過程中利用9-12個親水的氨基酸作為鏈接子也極大的提高了此融合抗原的親水性。本發(fā)明制備的重組抗原在PH8.0條件下具有很好的可溶性，從而克服了重組HIV抗原由于溶解性差而在免疫檢測中使用受限的缺點。同時，此發(fā)明了公布了此種重組抗原的制備方法采用化學合成的方法得到設(shè)計抗原的基因片段，且對基因的遺傳密碼進行改造，優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)，合成大腸桿菌偏愛密碼子，然后將合成優(yōu)化的基因片段克隆入pET-28a表達載體中，構(gòu)建表達載體。融合抗原在大腸桿菌中得到高效表達， 表達蛋白在PH8. 0具有很好的可溶性，利用親和層析層析技術(shù)純化，SDS-PAGE檢測純度大于95%，利用分步稀釋的方法進行復性得到活性良好的復性蛋白。制備的融合抗原應用于 HIV-I及HI-I抗體檢測能同時檢測HIV-I及HIV-2抗體，具有很好的檢測靈敏度與特異性， 為開發(fā)優(yōu)良的HIV抗體快速檢測試劑奠定基礎(chǔ)。


圖1 實施例2中重組抗原表達鑒定圖；圖2 實施例2中重組抗原純化電泳鑒定圖；圖3 實施例3中重組抗原表達鑒定圖；圖4 實施例3中重組抗原純化電泳鑒定圖。
具體實施例方式實施例1融合抗原的設(shè)計對眾多的傳染性疾病而言，病原體上的相應抗原表位成為研制特異診斷試劑和疫苗的靶標。HIV感染也不例外，其gp41蛋白即是重要的檢測靶標。gp41是HIV-I的跨膜糖蛋白，直接介導HIV與細胞膜的融合，在HIV感染細胞的過程中發(fā)揮重要的作用。gp41還具有中和表位和免疫優(yōu)勢結(jié)構(gòu)域，可誘發(fā)中和抗體和機體早而強的抗體反應。在本發(fā)明中，通過分析設(shè)計，HIV-lgp41選取HIV標準病毒株HXB2病毒株中的優(yōu)勢表位536aa_68^a，其對應的氨基酸序列為:tltvq arqllsgivq qqnnllraie aqqhllqltv wgikqlqari laverylkdq qllgiwgcsgklicttavpw naswsnksle qiwnhttwme wdreinnyts lihslieesq nqqekneqel leldkwaslwnwfnitnwlw yikl由于此序列疏水性較強，對此序列進行改造，通過生物信息學技術(shù)設(shè)計，改造包括主要將前端四個疏水氨基酸替換為親水的氨基酸包括555aa位(L，T)，566aa位(L，T)， 573aa位(I，E)，580aa (I，T)的置換，突變改造前后對比的氨基酸序列為Altvqarqllsgivq
6qqnnl(T)lraie aqqhll(T)qltv wgi (E)kqlqari(T)laverylkdq qllgiwgcsgklicttavpw naswsnksle qiwnhttwme wdreinnyts lihslieesq nqqekneqelieldkwasIw nwfnitnwlw yikl選取的表位突變后對應的基因序列為ACA CTG ACA GTA CAG GCC CGT CAA TTA TTG TCT GGT ATC GTGCAG CAG CAG AAC AAT ACC CTG CGT GCT ATT GAG GCG CAA CAG CATCTG ACC CAA CTC ACA GTC TGG GGC GAA MG CAG CTC CAG GCACGT ACC CTG GCT GTG GM CGT TAC CTG MG GAT CM CAG CTC CTGGGC ATT TGG GGT TGC TCT GGT AAA CTC ATT TGC ACC ACT GCT GTGCCT TGG AAT GCT AGT TGG AGT MT AAA TCT CTG GAA CAG ATT TGGAAT CAC ACC ACC TGG ATG GAG TGG GAC CGT GAA ATT AAC AATTAC ACA AGT TTA ATC CAC TCC TTA ATT GAA GAA TCG CAA AAC CAGCAA GAA MG AAT GAA CAA GAA TTA TTG GAA TTA GAT AAA TGGGCA AGT TTG TGG MT TGG TTT AAC ATC ACA AAT TGG CTG TGG TATATC AAA TTA0gp36選取優(yōu)HIV-2標準株R0D2的優(yōu)勢表位527aa-679aa，其對應的氨基酸序列為SSAMGAASLTVSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLQDQARLNS WGCAFRQVCHTTVPffVND SLAPDWD匪TWQEWEKQVRYLEANISKSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDIFGNWFDL TSffVKYIQY其基因序列，堿基組成為Agcagcgcgatgggcgcggcgagcctgaccgtgagcgcgcagagccgcaccctgctggcgggcattgt gcagcagcagcagcagctgctggatgtggtgaaacgccagcaggaactgctgcgcctgaccgtgtggggcaccaaa aacctgcaggcgcgcgtgaccgcgattgaaaaatatctgcaggatcaggcgcgcctgaacagctggggctgcgcg tttcgccaggtgtgccataccaccgtgccgtgggtgaacgatagcctggcgccggattgggataacatgacctgg caggaatgggaaaaacaggtgcgctatctggaagcgaacattagcaaaagcctggaacaggcgcagattcagcag gaaaaaaacatgtatgaactgcagaaactgaacagctgggatatttttggcaactggtttgatctgaccagctgg gtgaaatatattcagtat兩個抗原通過鏈接子序列連接子連接，鏈接子由親水的氨基酸殘基構(gòu)成，從而提高重組融合抗原的可溶性，連接子的尺寸便于保守N和C間的天然構(gòu)象。連接子具有整體的親水性，沒有或只有微弱的免疫原性優(yōu)選小的、極性的及親水的殘基，例如GSGGSG， GSGGSGG GSGGSGGG，GGGGSGGG，GGGGSGGGGSGGGG，最優(yōu)選的連接子設(shè)計的氨基酸序列為 GGGGSGGGG,其對應的基因序列為Ggcggcggcggcagcggcggcggcggc。本實施例所構(gòu)建的整個HIV重組融合抗原的氨基酸序列為Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser GlylieValGlnGlnGlnAsn AsnThrLeuArgAlaIleGluAlaGlnGlnHisLeuThrGlnLeuThrValTrpGlyGlu LysGlnLeuGlnAlaArgThrLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeu GlyIleTrpGlyCysSerGlyLysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSer TrpSerAsnLysSerLeuGluGlnIleTrpAsnHisThrThrTrpMETGluTrpAspArg GluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHisSerLeulieGluGluSerGlnAsnGlnGln GluLysAsnGluGlnGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPhe AsnIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIleLysLeu (SEQID NO. l)GlyGlyGlyGlySerGlyGly Gly Gly (SEQ ID NO. 2)Ser Ser Ala MET Gly Ala Ala Ser Leu Thr Val Ser Ala Gln Ser Arg Thr Leu Leu Ala Gly IleVal Gln Gln Gln Gln Gln Leu Leu Asp Val Val Lys Arg Gln Gln Glu Leu Leu Arg LeuThr Val Trp Gly Thr Lys Asn Leu Gln Ala Arg Val Thr Ala lie Glu Lys Tyr Leu GlnAsp Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr ValPro Trp Val Asn Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asp Asn MET Thr Trp Gln Glu Trp GluLys Gln Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn lie Ser Lys Ser Leu Glu Gln Ala Gln lie GlnGln Glu Lys Asn MET Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp lie Phe Gly Asn TrpPhe Asp Leu Thr Ser Trp Val Lys Tyr lie Gln Tyr (SEQ ID NO. 3)對應以上表位且經(jīng)遺傳密碼優(yōu)化的構(gòu)建上述融合抗原的編碼基因序列為Accctgaccgtgcaggcgcgccagctgctgagcggcattgtgcagcagcagaacaacaccctgcgcgcg attgaagcgcagcagcatctgacccagctgaccgtgtggggcgaaaaacagctgcaggcgcgcaccctggcggtgga acgctatctgaaagatcagcagctgctgggcatttggggctgcagcggcaaactgatttgcaccaccgcggtgccgt ggaacgcgagctggagcaacaaaagcctggaacagatttggaaccataccacctggatggaatgggatcgcgaaatt aacaactataccagcctgattcatagcctgattgaagaaagccagaaccagcaggaaaaaaacgaacaggaactgct ggaactggataaatgggcgagcctgtggaactggtttaacattaccaactggctgtggtatattaaactg (SEQ ID NO. 4)Ggcggcggcggcagcggcggcggcggc(SEQ ID NO. 5)Agcagcgcgatgggcgcggcgagcctgaccgtgagcgcgcagagccgcaccctgctggcgggcattgt gcagcagcagcagcagctgctggatgtggtgaaacgccagcaggaactgctgcgcctgaccgtgtggggcaccaaa aacctgcaggcgcgcgtgaccgcgattgaaaaatatctgcaggatcaggcgcgcctgaacagctggggctgcgcg tttcgccaggtgtgccataccaccgtgccgtgggtgaacgatagcctggcgccggattgggataacatgacctgg caggaatgggaaaaacaggtgcgctatctggaagcgaacattagcaaaagcctggaacaggcgcagattcagcag gaaaaaaacatgtatgaactgcagaaactgaacagctgggatatttttggcaactggtttgatctgaccagctgg gtgaaatatattcagtat(SEQ IDNO. 6).以上優(yōu)化的整一條編碼融合抗原的表達基因序列采用化學合成的方法得到，合成的基因序列連入T載體中用于后續(xù)擴增克隆。實施例2重組抗原原核表達載體的構(gòu)建目的基因采用化學合成的方法合成，克隆連入PMD18-T simple Vector載體，得到含目的基因的T載體(invitrogen公司提供)JSBamH I和HindIII 37°C雙酶切4-5小時， 酶切產(chǎn)物純化回收，各取6μ 1與經(jīng)同樣酶酶切過的質(zhì)粒pET48a，22°C連接lh。熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E. coli DH5 α株，涂布于含34 μ g/ml Kan的LB平板，挑取陽性克隆經(jīng)菌落PCR和酶切初步鑒定后送測序，測序結(jié)果證明表達載體構(gòu)建序列與設(shè)計基因序列一致(如SEQ ID NO. 4+SEQID NO. 5+SEQ ID NO. 6所示)。鑒定正確后得到重組表達載體(陽性質(zhì)粒)命名為pET-28a-0LM。1. 2. 3重組蛋白表達工程菌株的構(gòu)建與誘導表達采用CaCl2將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)16h。挑取單菌落接種至含50 μ g/ml Kan的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)過夜。次日，以1 100比例轉(zhuǎn)接于5mL新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)至OD6tltl值約為0. 6時加入IPTG(異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至終濃度1. OmM，誘導培養(yǎng)3-4h，SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達，本發(fā)明中設(shè)計的抗原在大腸桿菌中得到高效表達，表達蛋白兩端帶組氨酸標簽，蛋白分子量約為37KDa，表達形式主要為包涵體形式。篩選高效表達的重組菌株構(gòu)建表達工程菌株。圖1為重組抗原表達鑒定圖，其中，泳道1 表達菌體裂解沉淀；泳道2 表達上清；泳道3 未經(jīng)誘導的表達菌；泳道4 蛋白Marker。從圖上可以看出， 重組蛋白在大腸桿菌中得到很好的表達，主要的表達形式為包涵體形式。1.2. 4抗原的純化表達的包涵體在0. 8% -1% (體積比)的中性去垢劑，如tween-20，TritonX_100， 或NP40等加EDTA和還原劑DTT，B-巰基乙醇等用脲素梯度(4M脲-2M脲-IM脲-OM 脲)反復多次洗滌初步純化之后，由于融合抗原經(jīng)改造，親水性得到極大提高，包涵體在 pH8. 0-pH9. 0范圍含8M脲變性劑條件下可以得到很好的變性溶解。本發(fā)明優(yōu)選包涵體的溶解液為:20mM Tris (PH8. 0),1% tween-20 (體積比)，8M脲。根據(jù)抗原的性質(zhì)，以及設(shè)計時所帶的標簽，首選金屬螯合層析方法，經(jīng)一步親和層析的重組抗原純度達到95%以上。重組抗原優(yōu)選的純化方案為NI柱純化介質(zhì)ni Sepharose 6ff (金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠)bufferA :20mM Tris-Cl, ρΗ8· 0，8Μ 脲素，20mM 咪唑，0. ImM PMSF ；bufferB :20mM Tris-cl, ρΗ8· 0，8Μ 脲素，0· 5Μ 咪唑，0· ImM PMSF平衡 buffer :bufferA洗脫bufferB，純化上樣過程中樣品添加終濃度為20mM咪唑并校正pH至pH8. 0 ；抗原純化鑒定如圖2所示，其中，泳道1 蛋白Marker ；泳道2 初步洗滌純化經(jīng)溶解的包涵體蛋白；泳道3:親和純化流穿樣品；泳道4:純化目的蛋白。1. 2. 5抗原的復性與ELISA活性鑒定純化的抗原采用稀釋復性的方法進行復性，優(yōu)選的抗原復性體系為 20mMTris-Cl, pH8. 0,2mM EDTA，5%蔗糖(質(zhì)量百分比)，0. 1 % tween-20 (體積百分比)， 0. 02% NaN3(質(zhì)量百分比)。優(yōu)選的稀釋復性方案如下A、在4°C條件下，溶解的包涵體抗原用變性液(20mM Tris (PH8. 0),1% tween-20, 8M脲)稀釋至lmg/ml ；B、變性的包涵體以1 10緩慢滴加入復性液QOmM Tris-Cl，pH8. 0， 2mM EDTA，5%蔗糖，0. tween-20，0.02% Na^)中，邊加入包涵體蛋白攪拌攪拌，復性蛋白的終濃度約為100-200ug/ml ；C、4度放置證以上；D、每隔5_1池可重新往復性液中以 1 10比例加入變性蛋白，繼續(xù)4度復性，如此可重復2-3次。復性蛋白用PEG20000濃縮至3mg/ml的濃度。復性濃縮的蛋白用間接ELISA的方法鑒定抗原的活性，活性鑒定結(jié)果如表1
權(quán)利要求
1.一種HIV重組融合抗原，其特征是，其由SEQ ID NO. 1所示氨基酸、連接子以及SEQ ID NO. 3所示氨基酸順次組合構(gòu)成，所述連接子為6-10個分子量小的、極性且親水的氨基酸構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV重組融合抗原，其特征是，所示連接子的氨基酸組成如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.一種編碼權(quán)利要求1所示的HIV重組融合抗原的表達基因，其特征是，包括a 其核苷酸序列由SEQ ID NO. 4和編碼連接子的堿基序列和SEQ ID NO. 6所組成；b 與a的核苷酸序列編碼相同序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與a的核苷酸序列不同的序列； C 對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達基因，其特征是，所述編碼連接子的堿基序列如SEQID NO. 5所示。
5.一種權(quán)利要求1所述HIV重組融合抗原的制備方法，其特征是，其步驟如下(1)將權(quán)利要求3所述編碼融合抗原的表達基因序列合成，克隆連入pMDIS-T simple Vector載體，得到含目的基因的T載體；O) T載體經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物純化回收，與經(jīng)BamH I和HindIII酶切過的質(zhì)粒pET-28a連接；(3)熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5 α株，涂布于含34_55 μ g/ml Kan的LB平板，篩選得到陽性質(zhì)粒；(4)重組蛋白表達工程菌株的構(gòu)建與誘導表達采用CaCl2將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細胞，培養(yǎng)；挑取單菌落接種至含34-55 μ g/ml Kan的5mL LB 液體培養(yǎng)基中，370C，震蕩培養(yǎng)過夜；次日，轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，370C，震蕩培養(yǎng)至0D_ 值約為0. 6時加入IPTG至終濃度1. OmM，誘導培養(yǎng)3_4h，SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達， 得到HIV重組融合抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是，所述制備方法還包括對HIV重組融合抗原的純化將包涵體形式的HIV重組融合抗原在0. 5% -1%的中性去垢劑用脲素梯度反復多次洗滌初步純化，變性溶解，利用金屬螯合層析法親和層析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，所述溶解液為PH8.0，20mMTris, 1% tween-20，8M 脲。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是，對純化后的HIV重組融合抗原進行復性，復性液包括有:20mM Tris-Cl，ρΗ8· 0，2mMEDTA，5%蔗糖，0. 1% tween-20,0. 02% NaN30
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項所述的制備方法，其特征是，所述HIV重組融合抗原的保存液包括有20mM Tris-Cl, pH8. 0,2mM EDTA，5%蔗糖，0· 1% tween-20,0. 02% Na 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種HIV重組融合抗原及其表達基因和制備方法，所述HIV重組融合抗原由SEQ ID NO.1所示氨基酸、連接子以及SEQ ID NO.3所示氨基酸順次組合構(gòu)成，所述連接子為6-10個分子量小的、極性且親水的氨基酸構(gòu)成。所述HIV重組融合抗原由其表達基因在質(zhì)粒中構(gòu)建、誘導表達。所述HIV重組融合融合抗原應用于HIV-1及HI-1抗體檢測，能同時檢測HIV-1及HIV-2抗體，具有很好的檢測靈敏度與特異性。
文檔編號C12R1/93GK102492041SQ201110389340
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者周臘梅, 唐時幸, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)有限公司