專利名稱：含有保護(hù)賴氨酸的胰島素原及使用其制備胰島素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組胰島素領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及帶有保護(hù)氨基酸的胰島素及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
胰島素，特別是重組胰島素例如人重組胰島素，在醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前， 有兩種路線用于生產(chǎn)重組人胰島素-“連鎖組合”路線和“胰島素原”路線。在“連鎖組合” 路線中，通過生物重組分別合成組成人胰島素的兩條肽鏈-A鏈和B鏈，然后再將A鏈和B 鏈混合，產(chǎn)生二硫鍵生成具有生物活性的人胰島素。然而，在該路線中，通過直接混合兩條肽鏈來產(chǎn)生具有生物活性的人胰島素的效率相對比較低?！耙葝u素原”路線現(xiàn)在更為常用， 在該路線中，首先在表達(dá)載體例如大腸桿菌或者酵母中表達(dá)由人胰島素A鏈、B鏈和C鏈組成的人胰島素原，將其純化后在體外進(jìn)行復(fù)性。將復(fù)性后的人胰島素原用胰蛋白酶和羧肽酶B水解，得到具有天然活性的人胰島素。在該路線中，會(huì)產(chǎn)生消去B鏈30位蘇氨酸的胰島素副產(chǎn)物(DesB30-胰島素)，該副產(chǎn)物對胰島素質(zhì)量有不利影響。為了減少DesB30-胰島素的產(chǎn)生，必須嚴(yán)格控制胰蛋白酶的用量、PH值和反應(yīng)時(shí)間，使反應(yīng)條件得難以控制。盡管進(jìn)行了許多努力，還是不能完全避免DesB30-胰島素，因?yàn)镈esB30-胰島素和胰島素之間僅相差一個(gè)蘇氨酸，將它們進(jìn)行分離非常之困難?，F(xiàn)在，普遍使用大型高效液相色譜分離胰島素和DesB30-胰島素，該分離過程大大加大了重組人胰島素的生產(chǎn)成本，而且會(huì)產(chǎn)生大量的工業(yè)廢物?，F(xiàn)有技術(shù)中需要一種通過表達(dá)胰島素原制備胰島素的方法，避免胰蛋白酶對胰島素原水解后消去B鏈30位蘇氨酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用保護(hù)賴氨酸代替胰島素原中第四位(對應(yīng)于胰島素8鏈四位(B^))上的賴氨酸，得到的帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原在被胰蛋白酶和羧肽酶B水解時(shí)不會(huì)產(chǎn)生消去B鏈30位蘇氨酸的胰島素，這樣的胰島素原經(jīng)復(fù)性、酶解處理后， 得到的在似9帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素，根據(jù)不同的保護(hù)基團(tuán)，在相應(yīng)的條件下去保護(hù)，保護(hù)賴氨酸可轉(zhuǎn)化為賴氨酸，形成具有活性的胰島素。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種在B^帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素。因此，本發(fā)明的帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素或胰島素原比未經(jīng)修飾的胰島素或胰島素原更穩(wěn)定。為了通過生物翻譯體系合成在B^帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素或者在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原，本發(fā)明還提供了編碼上述帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素或胰島素原的基因。對于人胰島素原而言，所述編碼帶有保護(hù)賴氨酸的人胰島素原的基因的序列為SEQ ID NO. 5。
因此，在第二方面中，本發(fā)明提供了一種編碼在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原的基因，所述基因是編碼胰島素原的基因，其中編碼第四位氨基酸的密碼子是UAG。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種編碼在似9帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素的基因，所述基因是編碼胰島素的基因，其中編碼B29的氨基酸的密碼子是UAG。在第三方面中，本發(fā)明還提供了一種制備在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原的方法，包括在存在保護(hù)賴氨酰_tRNA。UA的情況下，使在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子為 UAG的胰島素原基因mRNA在合適的翻譯體系中翻譯。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種制備在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原的方法，包括在存在吡咯賴氨酰基-tRNA合成酶、tRNACUA的情況下，在加有保護(hù)賴氨酸的培養(yǎng)基中，使在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子為UAG的胰島素原基因在細(xì)胞的翻譯體系中翻譯。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種制備在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原的方法，包括在存在編碼吡咯賴氨?；?tRNA合成酶基因和保護(hù)賴氨酸、tRNACUA基因，使在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子為UAG的胰島素原基因在翻譯體系中翻譯。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種制備胰島素的方法，包括(1)將根據(jù)本發(fā)明的方法制備的在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原復(fù)性，使所述復(fù)性后的修飾胰島素原水解成B^帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素；(2)使步驟(1)中得到的帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素上的保護(hù)賴氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸，得到胰島素。在第四方面中，本發(fā)明還提供了在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原或似9帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素用于制備胰島素的用途。在本發(fā)明的第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原或似9帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素及其制備方法和用途中，由于第四位或似9的保護(hù)賴氨酸阻止了酶解時(shí)消去胰島素B鏈30 位蘇氨酸，避免了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而有效的簡化了胰島素原酶解和后續(xù)純化的操作，從而使得到胰島素更純并使生產(chǎn)成本大大降低。


圖1為一些代表性的N ε取代的賴氨酸結(jié)構(gòu)，它們分別是(從上至下、從左至右) N(e)-(叔丁氧碳基)-賴氨酸、N(e)-(芐氧碳基)-賴氨酸、N(e)-(鄰硝基芐氧碳基)_賴氨酸、N(e)-(對硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N(e)-(烯丙氧碳基)-賴氨酸，N(e)-(炔丙氧碳基)_賴氨酸，N(e)_(脯氨?；?_賴氨酸，N(e)_(半胱氨?；?_賴氨酸，N(e)_(環(huán)戊基氧碳基)_賴氨酸和N ε-((1-(6-硝基苯甲酸[d][l，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙氧基)羰基)_賴氨酸。圖2顯示了重組質(zhì)粒pBK-PylRS的結(jié)構(gòu)。圖3顯示了重組質(zhì)粒pET-pylT-胰島素-B^TAG的結(jié)構(gòu)。圖4為15 % SDS-PAGE凝膠電泳分析包涵體內(nèi)的蛋白。
圖5為SDS-PAGE分析經(jīng)過Ni-NTA瓊脂糖凝膠純化的帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的人胰島素原。圖6為SDS-PAGE分析純化后的成熟人胰島素。圖7為帶有N ε _(叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰島素的質(zhì)譜圖。圖8為胰島素原的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式序列表說明SEQ ID NO. 1 人胰島素B鏈的氨基酸；SEQ ID NO. 2 人胰島素原；SEQ ID NO. 3 吡咯賴氨酰-tRNA合成酶基因；SEQ ID NO. 4 吡咯賴氨酸 tRNACUA 基因；SEQ ID NO. 5 在第四位帶有UAG的人胰島素原基因；SEQ ID NO. 6 =PylRS氨基酸(吡咯賴氨酰-tRNA合成酶氨基酸)；SEQ ID NO. 7 Jnsulin-NdeI-F 引物；SEQ ID NO. 8 Jnsulin-SacI-R 引物；SEQ ID N0. 9 在第四位帶有UAA的人胰島素原基因；SEQ ID NO. 10 在第四位帶有UGA的人胰島素原基因；SEQ ID NO. 11 吡咯賴氨酸 IRNAuua 基因；SEQ ID N0. 12 吡咯賴氨酸 tRNAUCA 基因。在本發(fā)明中，除非另外指出，否則提及胰島素和胰島素原，應(yīng)理解為不僅僅是指人胰島素和人胰島素原，而是還指除人胰島素和人胰島素原之外的胰島素和胰島素原。本發(fā)明可以用于使任意來源的胰島素或胰島素原帶有保護(hù)賴氨酸，制備帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素或胰島素原，條件是這些胰島素滿足在人胰島素似9位對應(yīng)的位置為賴氨酸，以及/或者這些胰島素原都滿足在人胰島素原第四位對應(yīng)的位置為賴氨酸。所述胰島素或胰島素原包括來自人或動(dòng)物的天然胰島素/胰島素原和人工改造胰島素/胰島素原，例如重組胰島素/胰島素原。例如，本發(fā)明中的胰島素可以是人重組胰島素。在本發(fā)明中，胰島素還包括天然胰島素和人工改造胰島素的變體或類似物。例如，本發(fā)明的胰島素包括但不限于以下這些天然人胰島素、賴脯胰島素、地特胰島素、門東胰島素和甘精胰島素。在本發(fā)明中，B29位賴氨酸是指相對于人胰島素氨基酸序列而言(人胰島素B鏈序列如SEQ ID NO. 1中所示)，對于其他類型的胰島素，B^位賴氨酸不一定是第四位。所以，對于其他包括在本發(fā)明的胰島素而言，B^位賴氨酸所處的位置在這些胰島素B鏈中可以不是四位。這樣的具體位置可以通過將這些胰島素B鏈序列與SEQ ID NO. 1中所示的人胰島素B鏈的氨基酸序列比對后，確定為人胰島素B鏈四位賴氨酸對應(yīng)的位置。同樣， 胰島素原第四位賴氨酸是指相對于人胰島素原氨基酸序列而言(人胰島素原序列如SEQ ID N0. 2中所示)，對于其他包括在本發(fā)明的胰島素而言，第四位賴氨酸不一定是第四位。 對于其他包括在本發(fā)明的胰島素原而言，第四位賴氨酸所處的位置在這些胰島素原中可以不是第四位。這樣的具體位置可以通過將這些胰島素原序列與SEQ ID N0. 2中所示的人胰島素原的氨基酸序列比對后，確定為人胰島素原第四位賴氨酸對應(yīng)的位置。進(jìn)行序列比對的方法是本領(lǐng)域中已知的。在本發(fā)明中，B29位和第四位指的是同一個(gè)賴氨酸。除非意義不合適，否則提及胰島素似9位賴氨酸，包括胰島素原第四位賴氨酸；同樣，除非意義不合適，否則提及胰島素原第四位賴氨酸，包括胰島素B^位賴氨酸。在本發(fā)明中，胰島素B^位和胰島素原第四位還指編碼本發(fā)明的胰島素或胰島素原的基因序列中編碼相應(yīng)B^位賴氨酸和胰島素原第四位賴氨酸殘基的密碼子。在本發(fā)明中，保護(hù)賴氨酸是指賴氨酸側(cè)鏈氨基的一個(gè)氫原子被任意其它的保護(hù)性化學(xué)官能團(tuán)取代，例如賴氨酸的氨基被保護(hù)試劑引入的化學(xué)官能團(tuán)選擇性保護(hù)。本領(lǐng)域中通常使用的保護(hù)賴氨酸側(cè)鏈氨基的試劑都可用于本發(fā)明。例如，所述保護(hù)試劑引入的化學(xué)官能團(tuán)包括，但不限于叔丁氧碳基、芐氧碳基、鄰硝基芐氧碳基、對硝基芐氧碳基、 烯丙氧碳基、炔丙氧碳基、脯氨酰基、半胱氨?；?、環(huán)戊基氧碳、1-(6-硝基苯甲酸[d] [1,3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙氧基)羰基(1-(6-nitrobenzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl) ethoxy) carbonyl)等。本領(lǐng)域中已知的許多保護(hù)賴氨酸的方法。例如，所述保護(hù)氨基酸是N ε取代的賴氨酸，包括，但不限于Ν ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸、N ε -(芐氧碳基)-賴氨酸、 N ε -(鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(對硝基芐氧碳基)_賴氨酸、N ε -(烯丙氧碳基)_賴氨酸、N ε-(炔丙氧碳基)_賴氨酸、N ε-(脯氨?；?_賴氨酸、N ε-(半胱氨?；?_賴氨酸、 N ε -(環(huán)戊基氧碳基)-賴氨酸、N ε-((1-(6-硝基苯甲酸[d] [1，3] 二氧雜環(huán)戊烯_5_基) 乙氧基)羰基)_賴氨酸。這些非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)如圖1所示。保護(hù)賴氨酸可以通過密碼子UAG、UAA或UGA引入到胰島素的B^位或胰島素原的第四位。將編碼胰島素的基因的B^或胰島素原的第四位密碼子變成UAG、UAA或UGA可以通過多種本領(lǐng)域中的方法實(shí)現(xiàn)，例如通過合成或PCR擴(kuò)增中引入所述突變。在本發(fā)明中，所述胰島素原基因在編碼第四位氨基酸殘基的終止子密碼子可以是琥珀密碼子UAG、赭石密碼子和蛋白石密碼子；所述胰島素基因在編碼B^位氨基酸殘基的終止子密碼子可以是琥珀密碼子UAG、赭石密碼子和蛋白石密碼子。在本發(fā)明中，所述胰島素基因在編碼似9位氨基酸殘基的密碼子是琥珀密碼子 UAG時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰島素原基因序列是SEQ ID NO. 5 ；所述胰島素基因在編碼 B29位氨基酸殘基的密碼子是赭石密碼子UAA時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰島素原基因序列是SEQ ID NO. 9;所述胰島素基因在編碼似9位氨基酸殘基的密碼子是蛋白石密碼子UGA 時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰島素原基因序列是SEQ ID NO. 10。 在存在所述吡咯賴氨酰-tRNA合成酶和吡咯賴氨酸t(yī)RNA的條件下，細(xì)胞翻譯所述在胰島素原第四位氨基酸殘基對應(yīng)的位置帶有終止子突變的胰島素原基因，將上述保護(hù)賴氨酸引入到胰島素原的第四位。保護(hù)賴氨酰-tRNA可以通過吡咯賴氨酰-tRNA合成酶以保護(hù)賴氨酸和吡咯賴氨酸t(yī)RNA為底物合成。吡咯賴氨酰-tRNA合成酶可以在生物體中， 或者在體外翻譯體系中進(jìn)行該合成過程。吡咯賴氨酰-tRNA合成酶可以分離自生物體，或者由其基因體外翻譯而來。在具體實(shí)施例中，吡咯賴氨酰-tRNA合成酶是指序列為SEQ ID N0. 3的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶基因編碼的活性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，吡咯賴氨酸t(yī)RNA是指琥珀密碼子UAG抑制tRNA、赭石密碼子UAA抑制tRNA或蛋白石密碼子UGA抑制tRNA (在本發(fā)明的實(shí)施例中分別對應(yīng)由序列SEQ ID N0. 4、SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12編碼的tRNACUA、tRNAuua和tRNAUCA)，發(fā)明人已經(jīng)證明該吡咯賴氨酸t(yī)RNA和吡咯賴氨酰-tRNA合成酶可以形成正交的合成酶-tRNA配對體，吡咯賴氨酰-tRNA合成酶可以將保護(hù)氨基酸特異性連接到吡咯賴氨酸t(yī)RNA上。在本發(fā)明中，所述胰島素基因在編碼似9位氨基酸殘基的密碼子是琥珀密碼子 UAG時(shí)(例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中，對應(yīng)胰島素原基因序列是SEQ ID NO. 5)，所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是琥珀密碼子UAG抑制tRNA (即tRNAeuA)，其基因序列是SEQ ID NO. 4 ；所述胰島素基因在編碼B^位氨基酸殘基的密碼子是赭石密碼子UAA時(shí)(例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中，對應(yīng)胰島素原基因序列是SEQ ID NO. 9)，所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是赭石密碼子UAA抑制 tRNA(即tRNA·)，其基因序列是SEQ ID NO. 11 ；所述胰島素基因在編碼B^位氨基酸殘基的密碼子是蛋白石密碼子UGA時(shí)(例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中，對應(yīng)胰島素原基因序列是 SEQ ID N0. 10)，所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是蛋白石密碼子UGA抑制tRNA (即tRNAueA)，其基因序列是 SEQ ID N0. 12。在本發(fā)明的制備在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原或似9位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素的方法中，對于在翻譯體系中進(jìn)行翻譯，所述翻譯體系可以是本領(lǐng)域中已知的任何可用于翻譯胰島素原或胰島素的翻譯體系，可以是體外翻譯體系，或者可以是原核生物或真核生物表達(dá)體系。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，這樣的體系中包含合適的緩沖體系以及進(jìn)行蛋白質(zhì)合成相關(guān)的酶。例如，本領(lǐng)域中常用的大腸桿菌或酵母表達(dá)體系可用于本發(fā)明的方法中。例如，可用于表達(dá)本發(fā)明的胰島素原或胰島素的表達(dá)體系包括但不限于大腸桿菌、芽孢枯葉桿菌、面包酵母、巴斯德畢氏酵母、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述在第四位帶有UAG的人胰島素原基因序列如SEQ ID N0. 5所述。在本發(fā)明方法的一些具體實(shí)施方案中，所述編碼吡咯賴氨酰-tRNA合成酶基因、 tRNACUA基因和在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子為UAG的胰島素原基因在一個(gè)或多個(gè)重組質(zhì)粒中。在本發(fā)明的制備在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原或似9位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素的方法中，如果翻譯體系中存在翻譯相關(guān)的酶，例如在原核生物或真核生物表達(dá)體系中，所述吡咯賴氨酰-tRNA合成酶和tRNA。UA還可以是表達(dá)其的基因，或者包含在載體中的這種基因的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述吡咯賴氨酰-tRNA合成酶可以是編碼吡咯賴氨?；?tRNA合成酶的重組質(zhì)粒，例如，所述吡咯賴氨?；?tRNA合成酶基因序列如SEQ ID N0. 3所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述tRNAraA還可以是編碼tRNAraA的重組質(zhì)粒，例如，所述tRNAeuA基因序列如SEQ ID N0. 4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述編碼tRNAeuA基因和在第四位帶有終止子突變的胰島素原基因可以存在于同一重組質(zhì)粒中。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第 29位帶有終止子UAG的胰島素原基因?yàn)樵谠摻K止子的位置引入保護(hù)賴氨酸的人胰島素原基因，其序列如SEQ ID N0. 5所示。在本發(fā)明的制備在第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原或似9位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素的方法中，帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原復(fù)性可以使用本領(lǐng)域中用于復(fù)性胰島素原的方法進(jìn)行。復(fù)性胰島素原的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇的，例如，包括但不限于利用氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽進(jìn)行復(fù)性和利用甲硫醇進(jìn)行復(fù)性。在本發(fā)明的制備B^位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素的方法中，使復(fù)性后的胰島素原轉(zhuǎn)變?yōu)閹в斜Ｗo(hù)賴氨酸的胰島素也可以使用本領(lǐng)域中用于將胰島素原轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素的方法進(jìn)行，例如用胰蛋白酶和羧肽酶B。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇的。在本發(fā)明的制備胰島素的方法中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所用的保護(hù)氨基酸類型，選擇使保護(hù)賴氨酸脫保護(hù)的方法，這些方法可以被選擇用于使似9位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素轉(zhuǎn)變?yōu)锽^位脫去保護(hù)的賴氨酸的胰島素。例如，除N ε -鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸和N ε-((1-(6-硝基苯甲酸[d][l，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙氧基)羰基)_賴氨酸之外，本文提及的Nε取代的賴氨酸可以在酸性條件下將胰島素上的Nε取代的賴氨酸修飾賴氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸，例如使用四三氟乙酸或鹽酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酸性條件是指ρΗ小于3，優(yōu)選ρΗ在1附近，最優(yōu)選ρΗ值等于1。對于N ε -鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸和Νε-((1-(6-硝基苯甲酸[d][l，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙氧基)羰基)_賴氨酸，可以用光照方法以365納米處理30分鐘出去修飾基團(tuán)。在一個(gè)具體的合成重組人胰島素的實(shí)施方案中，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案(1)構(gòu)建編碼吡咯賴氨酰-tRNA合成酶基因的重組質(zhì)粒和tRNACUA基因、在B^位引入N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的人胰島素原基因的重組質(zhì)粒，所述吡咯賴氨酰-tRNA合成酶基因序列如SEQ ID NO. 3所述，所述tRNACUA基因序列如SEQ ID NO. 4所述，所述在B29 位引入N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的人胰島素原基因序列如SEQ ID NO. 5所述；(2)將所述重組質(zhì)粒均轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，在包含N ε _(叔丁氧碳基)_賴氨酸的培養(yǎng)基中，在所述宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)并分離純化得到在B^位引入N ε -(叔丁氧碳基)_賴氨酸的人胰島素原；(3)對所述在似9位引入N ε _(叔丁氧碳基)_賴氨酸的人胰島素原通過透析進(jìn)行復(fù)性，對復(fù)性后的人胰島素原進(jìn)行酶解處理，得到帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的人胰
島素；(4)在酸性條件下，將上述步驟(3)得到的人胰島素上的Νε_(tái)(叔丁氧碳基)_賴氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸，則得到具有活性的重組人胰島素。優(yōu)選地，在上述步驟(1)中，所述在胰島素原第四位帶有終止子UAG的胰島素原基因序列插入重組質(zhì)粒pET-pylT-GFP，得到所述編碼tRNAeuA(又稱pylT)基因、在胰島素原第四位帶有終止子UAG的胰島素原基因的重組質(zhì)粒pET-pylT-insulin-B^TAG。實(shí)現(xiàn)了通過基因編碼表達(dá)出在胰島素原第四位帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的人胰島素原。優(yōu)選地，在上述步驟O)中，通過異丙基硫代半乳糖苷和N ε-(叔丁氧碳基)_賴氨酸誘導(dǎo)所述宿主細(xì)胞中人胰島素原的表達(dá)。優(yōu)選地，在上述步驟( 中，所述在胰島素原第四位帶有N ε-(叔丁氧碳基)_賴氨酸的人胰島素原通過M-NTA瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離純化。更優(yōu)選地，在胰島素原第四位帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的人胰島素原在其氨端帶有六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，這樣能夠通過利用M-NTA瓊脂糖凝膠實(shí)現(xiàn)分離純化。在上述步驟(3)中，酶解處理采用胰蛋白酶和羧肽酶B—步酶解的方法。因?yàn)?N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的側(cè)鏈不帶有正電荷，所以它不被胰蛋白酶識(shí)別和水解。優(yōu)選地，在上述步驟中，所述人胰島素上的Νε_(tái)(叔丁氧碳基)_賴氨酸通過三氟乙酸處理轉(zhuǎn)化為賴氨酸。通過三氟乙酸處理酶解后的人胰島素的簡單操作，即得到具有活性的人胰島素。
實(shí)施例1一、實(shí)驗(yàn)材料用于表達(dá)胰島素原的生物載體-大腸桿菌變株BL21 (DE3)和用于DNA擴(kuò)增的脫氧核酸多聚酶Platinum Pfx從Invitrogen公司購買；用于質(zhì)粒構(gòu)建的脫氧核酸內(nèi)切酶-NdeI和SacI，小牛腸堿性磷酸酶-CIP，脫氧核酸連接酶-T4 DNA ligase，脫氧核酸分子標(biāo)尺，和蛋白質(zhì)分子標(biāo)尺從NEB Biolabs公司購買；LB培養(yǎng)基和N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸從Sigma公司購買；用于質(zhì)粒小量提取的試劑盒從Qiagen公司購買。其他未標(biāo)明來源的試劑來自VWR。二、實(shí)驗(yàn)方法1、質(zhì)粒的構(gòu)建用于在大腸桿菌變株BL21 (DE3)內(nèi)表達(dá)在胰島素原第四位帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的人胰島素原的兩個(gè)質(zhì)粒如圖2和圖3所示(質(zhì)粒的構(gòu)建由ChemDraw軟件進(jìn)行，該軟件可獲自PerkinElmerInformatics公司)。重組質(zhì)粒pBK-PylRS帶有卡那霉素抗性基因和吡咯賴氨?；?tRNA合成酶(PylRQ基因。PylRS的基因序列為SEQ ID NO. 3、氨基酸序列為 SEQ ID NO. 6。重組質(zhì)粒pET-pylT-insulin-B^TAG從質(zhì)粒pET-pylT-GFP轉(zhuǎn)化而來。 此質(zhì)粒帶有氨芐抗性基因、tRNAraA基因(序列為SEQ ID NO. 4)和在胰島素原第四位帶有琥珀終止子UAG的胰島素原基因(又稱insulin-B^TAG)基因(序列為SEQ ID NO. 5)，胰島素原對應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID N0.2，在其氨端帶有六個(gè)組氨酸的標(biāo)簽(6XHis)，并且在胰島素原第四位帶有琥珀密碼子UAG的無意義突變。關(guān)于pBK-PylRS和pET-pylT_GFP的詳情可參見文獻(xiàn)[The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Wang YS, Russell WK, Wang Z, Wan W, Dodd LE, Pai PJ, Russell DH, Liu WR. Mol Biosyst. 2011 Mar 1 ；7 (3) :714-7. Epub 201 IJan 14.]。重組質(zhì)粒pET-pylT-insulin-B^TAG按照標(biāo)準(zhǔn)克隆方法構(gòu)建，該方法使用了 Platinum Pfx脫氧核糖聚合酶。構(gòu)建質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)已經(jīng)過測序確認(rèn)。所有寡核苷酸引物購自 htegrated DNA ^Technologies，Inc. pET-pylT-insulin-B^TAG質(zhì)粒的構(gòu)建過程簡述如下(1)使用 Insulin-NdeI-F(序列為 SEQ ID N0. 7)和 Insulin-SacI-R(SEQ ID NO. 8)作為引物對雙螺旋多聚核苷酸序列為SEQ ID Ν0. 5)進(jìn)行擴(kuò)增，隨后用內(nèi)切酶NdeI和Mel進(jìn)行酶切；(2)在大腸桿菌變株ToplO (來自Invitrogen)內(nèi)擴(kuò)增質(zhì)粒pET-pylT-GFP并用質(zhì)粒小量提取的試劑盒(Qiagen公司)提取，提取后的pET-pylT-GFP用內(nèi)切酶NdeI和McI 進(jìn)行酶切，酶切后的pET-pylT-GFP再用CIP脫去5’端的磷酸；(3)利用脫氧T4核酸連接酶將步驟(1)中得到的酶切產(chǎn)物插入到步驟( 酶切的質(zhì)粒中，所得質(zhì)粒含有Insulin-BWTAG序列，如圖3所示。2、在胰島素原第四位帶有N ε _(叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰島素原的表達(dá)為了表達(dá)在胰島素原第四位帶有N ε-(叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰島素原， 將重組質(zhì)粒pBK-PylRS和pET-pyIT-Insulin-B^TAG電轉(zhuǎn)化大腸桿菌變株BL21(DE3)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化后的BL21(DE3)細(xì)胞首先在37°C進(jìn)行恢復(fù)，然后鋪在帶有50微克/毫升的卡那霉素和100微克/毫升氨芐青霉素的LB瓊脂上進(jìn)行選擇帶有pBK-PylRS和 pET-pyIT-Insul in-B29TAG兩個(gè)質(zhì)粒的菌落。隨后，一個(gè)單菌落被轉(zhuǎn)入到5毫升的LB培養(yǎng)基進(jìn)行過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到含有1升LB培養(yǎng)基的4升震蕩培養(yǎng)瓶中，并在轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘的37攝氏度恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基中加入了 50微克/毫升的卡那霉素和100微克/毫升氨芐青霉素來維持電轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)的兩種質(zhì)粒。當(dāng)細(xì)胞長到培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液在600納米光波的吸光度(0D_)為大約0. 7時(shí)，將1毫摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和1毫摩爾/升的N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸加入到該LB培養(yǎng)液中來誘導(dǎo)胰島素原的表達(dá)。12個(gè)小時(shí)后收集細(xì)胞。同時(shí)，我們在7升的發(fā)酵裝置(New Brunswick BioFlo 310)內(nèi)進(jìn)行了大量制備細(xì)胞。簡言之，我們首先準(zhǔn)備了 121攝氏度30分鐘滅菌的含5升LB培養(yǎng)基的7升發(fā)酵罐、121 攝氏度30分鐘滅菌的250毫升消泡劑(Dow Corning Antifoam 1510)、滅菌的100毫升的 50% (體積/體積)的甘油水溶液和過濾除菌的100毫升的1摩爾/升的N ε _(叔丁氧碳基)-賴氨酸原液。為了促進(jìn)N-(叔丁氧碳基)-賴氨酸的溶解，N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸被溶在一個(gè)當(dāng)量的氫氧化鈉中。100毫克/毫升的氨芐青霉素、50毫克/毫升的卡那霉素和1摩爾/升的IPTG分別通過使用0. 45微米的過濾膜過濾的方法除菌。在發(fā)酵前，我們在 1升的震蕩培養(yǎng)瓶內(nèi)過夜培養(yǎng)了 200毫升的攜帶pBK-PylRS和pET-pyITHnsulin-B^TAG 兩個(gè)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE)細(xì)胞。過夜培養(yǎng)的細(xì)胞然后轉(zhuǎn)入含有5升LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)。隨后加入20毫升的消泡劑原液、5毫升的氨芐青霉素原液和5毫升的卡那霉素原液。 當(dāng)細(xì)胞長到培養(yǎng)液在600納米光波的吸光度(0D_)為1. 0時(shí)，加入5毫升IPTG和5毫升 Νε-(叔丁氧碳基)-賴氨酸到發(fā)酵罐中，誘導(dǎo)胰島素原的表達(dá)。在發(fā)酵過程中，ρΗ值被設(shè)定在7.0士0.1。空氣提供的速度被調(diào)節(jié)在使得溶解氧達(dá)到30%以上的飽和度。發(fā)酵罐內(nèi)轉(zhuǎn)子的速度為400轉(zhuǎn)/分鐘，以保持溶解氧達(dá)到30%的飽和度。誘導(dǎo)6小時(shí)后，我們加入了 100毫升50%甘油提供附加的碳原料，接著在12小時(shí)后收集細(xì)胞。3、從包涵體中純化胰島素原根據(jù)從包涵體內(nèi)提取蛋白的傳統(tǒng)方法提取在胰島素B鏈四位對應(yīng)位置帶有 N ε-(叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰島素原。簡言之，首先將上一步驟收集的細(xì)胞懸浮于裂解液中。裂解液的組成50毫摩爾/升pH8. 0的Tris-HCl緩沖液、100毫摩爾/升的氯化鈉、 5毫摩爾/升的乙二胺四乙酸、0. 的疊氮化鈉和0. 5%的表面活性劑Triton-XlOO。然后，將懸浮在裂解液中的細(xì)胞超聲裂解。將超聲裂解后的混合液在超速離心機(jī)內(nèi)離心沉降 (20分鐘，6000X克作用力，4攝氏度)。將離心沉降后的沉淀再重新懸浮在新的裂解液中并再次進(jìn)行超聲裂解和離心沉降。在重復(fù)三次后，將離心后的沉淀物懸浮在洗滌液(不含 Triton-XlOO的裂解液)進(jìn)行超聲裂解和離心沉降兩次(20分鐘，6000X克作用力，4攝氏度)。然后將包涵體溶解在還原緩沖液中。還原緩沖液的組成10毫摩爾/升ρΗ 8.0的 Tris-HCl緩沖液、100毫摩爾/升的磷酸二氫鈉和8摩爾/升的尿素。將在37攝氏度下不溶于還原緩沖液的雜質(zhì)通過離心沉降的方法除去。離心沉降后的上清液然后和2-3毫升的M-NTA瓊脂糖凝膠在4攝氏度下進(jìn)行攪拌混合。兩個(gè)小時(shí)后將混合液倒入空的聚丙烯柱中，并用20-30毫升的還原緩沖液(ρΗ值6. 2)洗去未與M-NTA瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白。 最后，用洗脫液洗脫與M-NTA瓊脂糖凝膠結(jié)合的胰島素原。洗脫液的組成50毫摩爾/升PH值為4. 5的乙酸緩沖液、100毫摩爾/升的磷酸二氫鈉和8摩爾/升的尿素。將洗脫后的經(jīng)過純化的蛋白質(zhì)收集并濃縮到200微克/毫升，然后用15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進(jìn)行分析，結(jié)果見下文。4、胰島素原的折疊復(fù)性和酶解處理轉(zhuǎn)化成帶有N ε _ (叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰
島素為了使得M-NTA瓊脂糖凝膠純化的胰島素原復(fù)性，我們首先通過透析的方法將胰島素原的緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成為100毫摩爾/升PH值為10. 5的TriS-HCl，100毫摩爾/ 升甘氨酸和8摩爾/升尿素的緩沖液。然后加入5毫摩爾/升的還原性的谷胱甘肽(購自 VffR)和0. 5毫摩爾/升的氧化性的谷胱甘肽并在4度下攪動(dòng)過夜。然后，將胰島素原溶液中變性的胰島素原用逐步透析的方法轉(zhuǎn)化為復(fù)性的胰島素原。整個(gè)透析通過四步完成，每一步透析操作為M個(gè)小時(shí)。每步透析的復(fù)性緩沖液都含有100毫摩爾/升ρΗ值為10. 5 的Tris-HCl、400毫摩爾/升的精氨酸、1毫摩爾/升的乙二胺四乙酸、1毫克/升亮肽素、 0. 2豪摩爾/升的苯甲基磺酰氟和輔以濃度遞減的尿素(4. 0摩爾/升，2. 0摩爾/升，1. 0 摩爾/升，和0.00摩爾/升)。-最后，將復(fù)性的胰島素原的緩沖液透析為消化緩沖液(50 毫摩爾/升的Tris-HCl，pH值為9. 0)。將透析后的復(fù)性胰島素原先濃縮至lmg/ml，然后加入胰蛋白酶和羧肽酶B (購自VWR)在4度下酶解消化。加入的胰蛋白酶和羧肽酶B的量為胰島素原的六百分之一。在5小時(shí)后加入0. 5毫克/升的亮肽素終止消化反應(yīng)。5、帶N ε _(叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰島素的去保護(hù)及質(zhì)譜分析我們采取了簡單的化學(xué)方法除去胰島素B鏈四位的N ε _(叔丁氧碳基)_賴氨酸中的叔丁氧碳基來恢復(fù)賴氨酸并獲得成熟的人胰島素。簡而言之，向上一步中得到的帶有 N ε-(叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰島素溶液中加入2%的三氟乙酸(購自VWR)，2個(gè)小時(shí)后加入碳酸氫銨終止反應(yīng)。終止反應(yīng)后的溶液被直接加入到Superdex 200 10/300GL的凝膠過濾柱(購自GEHealthcare Life Science)中并使用快速蛋白液相色譜(FPLC)進(jìn)行分離。 凝膠過濾柱的緩沖液為50毫摩爾/升ρΗ為7的磷酸鈉和150毫摩爾/升的氯化鈉。最終分離出的胰島素被濃縮到1毫克/毫升，并在-80攝氏度的冰箱內(nèi)保存。將得到的人胰島素在用Wzip-tip處理之后進(jìn)行了基體輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(MALDI-T0F)分析。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、胰島素原從包涵體中的分離提純我們首先對提取的包涵體進(jìn)行了 SDS-PAGE分析，如圖4所示，染色用的是0. 1% 考馬斯亮藍(lán)R-250，第一個(gè)條帶為蛋白分子標(biāo)尺，第二個(gè)和第三個(gè)條帶代表不同量的包涵體，第二個(gè)條帶加入的包涵體的量為3微升，第二個(gè)條帶加入的包涵體的量為4微升。在圖 4中，與胰島素原所對應(yīng)的蛋白帶清晰可見，表明在胰島素原第四位帶有N ε -(叔丁氧碳基)_賴氨酸的胰島素原被成功的表達(dá)。我們在設(shè)計(jì)胰島素原的時(shí)候在它的氨端添加了 6 組氨酸標(biāo)簽(6XHis)，因?yàn)?組氨酸標(biāo)簽和Ni-NTA瓊脂糖凝膠特異的結(jié)合，所以胰島素原的提純可以通過使用M-NTA瓊脂糖凝膠完成。如圖5所示(其中第二到第七個(gè)條帶為同一次提純過程中收集的連續(xù)6個(gè)樣)，經(jīng)過M-NTA瓊脂糖凝膠純化后的胰島素原已經(jīng)相對較純。通過對純化后的胰島素原進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)濃度分析所測得的胰島素原的表達(dá)量為85 毫克/升。2、胰島素原的酶解和去保護(hù)以及質(zhì)譜分析
因?yàn)镹 ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的保護(hù)作用，B^位在胰蛋白酶酶解時(shí)不被識(shí)別成為酶切點(diǎn)?？梢詫⒁鹊鞍酌负汪入拿窧在一步中使用，然后在不需要分離的情況下進(jìn)行 N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的脫保護(hù)。脫保護(hù)后的胰島素可以進(jìn)行一步凝膠過濾柱分離純化。圖6顯示的為最后成熟的胰島素的SDS-PAGE分析，其中第二到第六條帶代表加入不同量的1毫克/毫升的胰島素(從第二到第六0. 5，2，2，4，4微升)。根據(jù)SDS-PAGE分析和后續(xù)的質(zhì)譜分析，最后產(chǎn)生的胰島素的純度達(dá)到98%。表明胰蛋白酶和羧肽酶B有效的切除了胰島素原的C鏈和氨端的六組氨酸標(biāo)簽并且用三氟乙酸成功的消去了N ε-(叔丁氧碳基)_賴氨酸的叔丁氧碳基。成熟的人胰島素的質(zhì)譜分析如圖7所示，顯示了相當(dāng)高的純度。成熟人胰島素的分子量和預(yù)計(jì)值相同，預(yù)計(jì)值為5808Da。胰島素原的質(zhì)譜分析如圖8 所示，分子量也和預(yù)計(jì)值相同，預(yù)計(jì)值為10733Da。通過對成熟人胰島素進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)濃度分析所測得的胰島素原的表達(dá)量為50毫克/升。綜上，通過基因編碼定點(diǎn)引入N ε取代的賴氨酸非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)簡化重組人胰島素的合成，利用吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(PylRQ和吡咯賴氨酸t(yī)RNA(pylT)組成的一組在大腸桿菌內(nèi)形成正交的吡咯賴氨酰-tRNA合成酶(aaRS)-tRNA對，N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸被特異的編碼在無意義琥珀密碼子UAG上并被定點(diǎn)加入到胰島素原中原第四位上。利用普通的LB培養(yǎng)基和大規(guī)模發(fā)酵罐來維持中性的ρΗ值，帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的胰島素原在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)量達(dá)到85毫克/升。表達(dá)的帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的胰島素原沉積在大腸桿菌的包涵體中。純化的帶有N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸的胰島素原經(jīng)過傳統(tǒng)的方法折疊復(fù)性后進(jìn)行酶解處理。通過對胰島素原進(jìn)行胰蛋白酶和羧肽酶B的一步酶解處理和三氟乙酸處理酶解產(chǎn)物的簡單操作產(chǎn)生具有完全活性的重組人胰島素。利用凝膠層析柱純化的人胰島素最終達(dá)到50毫克/升的表達(dá)量。實(shí)施例2在本實(shí)施例中，以相同操作重復(fù)實(shí)施例1的步驟，不同之處是用赭石密碼子UAA 代替實(shí)施例實(shí)施例1中的琥珀密碼子UAG ；用tRNAUUA代替實(shí)施例1中的tRNAeuA ；用N ε -(芐氧碳基)-賴氨酸代替實(shí)施例1中的N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸；以SEQ ID NO. 9代替SEQ ID NO. 5;以SEQ ID NO. 11代替SEQ ID NO. 4 ；并且從胰島素上脫去N ε-(芐氧碳基)-賴氨酸的步驟如下在表達(dá)中得到的帶有N ε -(芐氧碳基)-賴氨酸的胰島素溶液中加入0. IM 的溴酸(購自VWR)，2個(gè)小時(shí)后加入碳酸氫銨終止反應(yīng)。該實(shí)施例的結(jié)果與實(shí)施例1的結(jié)果類似。根據(jù)SDS-PAGE分析和后續(xù)的質(zhì)譜分析， 最后產(chǎn)生的胰島素的純度達(dá)到97%。通過對成熟人胰島素進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)濃度分析所測得的胰島素原的表達(dá)量為48毫克/升。實(shí)施例3在本實(shí)施例中，以相同操作重復(fù)實(shí)施例1的步驟，不同之處是用蛋白石密碼子 UGA代替實(shí)施例實(shí)施例1中的琥珀密碼子UAG ；用tRNAUCA代替實(shí)施例1中的tRNAeuA ；并且用N ε -(鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸代替實(shí)施例1中的N-(叔丁氧碳基)-賴氨酸；以SEQ ID NO. 10代替SEQ ID N0. 5 ；以SEQ ID N0. 12代替SEQ ID N0. 4 ；并且從胰島素上脫去N ε -鄰硝基芐氧碳基的步驟如下將表達(dá)得到的帶有N ε -(鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸的胰島素溶液用365納米的紫外光照射30分鐘去掉修飾基團(tuán)。該實(shí)施例的結(jié)果與實(shí)施例1的結(jié)果類似。根據(jù)SDS-PAGE分析和后續(xù)的質(zhì)譜分析，最后產(chǎn)生的胰島素的純度達(dá)到98%。通過對成熟人胰島素進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)濃度分析所測得的胰島素原的表達(dá)量為45毫克/升。 通過上述實(shí)施例1-3表明，我們驗(yàn)證了通過引入N ε取代的賴氨酸可以實(shí)現(xiàn)天然人胰島素的合成?？梢岳斫獾氖?，利用相同的方法一個(gè)側(cè)鏈氨基被保護(hù)的賴氨酸可以被引入到胰島素類似物的前體來簡化胰島素類似物比如門冬胰島素和甘精胰島素的合成。同時(shí)，因?yàn)樵贐^位的N ε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸阻止了胰蛋白酶酶解副產(chǎn)物的產(chǎn)生，本發(fā)明有效的簡化了胰島素原酶解和后續(xù)純化的操作，從而使得生產(chǎn)胰島素的成本大大的降低。
權(quán)利要求
1.第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素原，所述胰島素原是重組人胰島素原、天然人胰島素原、賴脯胰島素原、地特胰島素原、門東胰島素原或甘精胰島素原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的胰島素原，所述保護(hù)賴氨酸是側(cè)鏈氨基的一個(gè)氫原子被保護(hù)性化學(xué)官能團(tuán)取代的賴氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3的胰島素原，所述保護(hù)賴氨酸是Nε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸、 N ε -(芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(對硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(烯丙氧碳基)-賴氨酸、N ε -(炔丙氧碳基)-賴氨酸、N ε -(脯氨?；?-賴氨酸、N ε -(半胱氨?；?-賴氨酸、N ε -(環(huán)戊基氧碳基)-賴氨酸或N ε - ((1_ (6_硝基苯甲酸[d][l，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙氧基)羰基)_賴氨酸。
5.編碼權(quán)利要求1的胰島素原的胰島素原基因，所述胰島素原基因在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子是終止子，所述終止子是琥珀密碼子UAG、赭石密碼子UAA和蛋白石密碼子 UGA。
6.權(quán)利要求5的胰島素原基因，所述胰島素原基因序列是SEQID NO. 5、SEQ ID NO. 9 或 SEQ ID NO. 10。
7.B鏈第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的胰島素，所述胰島素是重組人胰島素、天然人胰島素、賴脯胰島素、地特胰島素、門東胰島素或甘精胰島素。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的胰島素，所述保護(hù)賴氨酸是側(cè)鏈氨基的一個(gè)氫原子被保護(hù)性化學(xué)官能團(tuán)取代的賴氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或9的胰島素，所述保護(hù)賴氨酸是Nε -(叔丁氧碳基)-賴氨酸、 N ε -(芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(對硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(烯丙氧碳基)-賴氨酸、N ε -(炔丙氧碳基)-賴氨酸、N ε -(脯氨酰基)-賴氨酸、N ε -(半胱氨酰基)-賴氨酸、N ε -(環(huán)戊基氧碳基)-賴氨酸或N ε - ((1_ (6_硝基苯甲酸[d][l，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙氧基)羰基)_賴氨酸。
11.編碼權(quán)利要求7的胰島素的基因，所述基因在編碼B鏈第四位氨基酸殘基的密碼子是終止子，所述終止子是琥珀密碼子UAG、赭石密碼子UAA和蛋白石密碼子UGA。
12.—種制備權(quán)利要求1的胰島素原的方法，包括在存在保護(hù)賴氨酰-tRNA的情況下，使在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子為終止子的胰島素原基因mRNA在合適的翻譯體系中翻譯，其中所述tRNA是tRNA。UA時(shí)所述終止子是琥珀密碼子UAG，所述tRNA是tRNA-時(shí)所述終止子是赭石密碼子UAA，所述tRNA是tRNAueA時(shí)所述終止子是蛋白石密碼子UGA0
13.—種制備權(quán)利要求1的胰島素原的方法，包括在存在吡咯賴氨?；?tRNA合成酶、吡咯賴氨酸t(yī)RNA的情況下，在加有保護(hù)賴氨酸的培養(yǎng)基中，使在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子為終止子的胰島素原基因在細(xì)胞的翻譯體系中翻譯，其中所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNA。UA時(shí)所述終止子是琥珀密碼子UAG,所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNAUUA時(shí)所述終止子是赭石密碼子UAA，所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNAueA 時(shí)所述終止子是蛋白石密碼子UGA。
14.一種制備權(quán)利要求1的胰島素原的方法，包括在存在編碼吡咯賴氨?；?tRNA合成酶基因和保護(hù)賴氨酸、吡咯賴氨酸t(yī)RNA基因，使在編碼第四位氨基酸殘基的密碼子為終止子的胰島素原基因在翻譯體系中翻譯，其中所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNA。UA時(shí)所述終止子是琥珀密碼子UAG,所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是 tRNA-時(shí)所述終止子是赭石密碼子UAA，所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNAuffl時(shí)所述終止子是蛋白石密碼子UGA。
15.一種制備胰島素的方法，包括(1)將權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的胰島素原或者權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的方法制備的胰島素原復(fù)性，使所述復(fù)性后的胰島素原水解成B鏈第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素；(2)使步驟(1)中得到的帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素上的保護(hù)賴氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸，得到胰島素。
16.一種制備胰島素的方法，包括權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的胰島素上的保護(hù)賴氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸，得到胰島素。
17.一種制備胰島素的方法，包括(1)在存在吡咯賴氨?；?tRNA合成酶和吡咯賴氨酸t(yī)RNA的情況下，在包含保護(hù)賴氨酸的培養(yǎng)基中，使在胰島素B鏈第四位氨基酸殘基對應(yīng)的位置帶有終止子突變的胰島素原基因在翻譯體系中翻譯成B鏈第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素原，其中所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNA。UA時(shí)所述終止子是琥珀密碼子UAG,所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNAUUA時(shí)所述終止子是赭石密碼子UAA，所述吡咯賴氨酸t(yī)RNA是tRNAua時(shí)所述終止子是蛋白石密碼子 UGA ；(2)分離在胰島素B鏈第四位對應(yīng)的位置似9位引入保護(hù)賴氨酸的胰島素原，并將所述在胰島素B鏈第四位對應(yīng)的位置引入保護(hù)賴氨酸的B^位引入修飾賴氨酸的胰島素原復(fù)性，使復(fù)性后的胰島素原轉(zhuǎn)變?yōu)锽鏈第四位帶有保護(hù)賴氨酸的胰島素；(3)將上述步驟( 得到的胰島素上的保護(hù)賴氨酸轉(zhuǎn)化為賴氨酸，得到胰島素。
18.根據(jù)權(quán)利要求13、14和17任一項(xiàng)的方法，所述吡咯賴氨?；?tRNA合成酶的基因序列是 SEQ ID NO. 3。
19.根據(jù)權(quán)利要求12-15和17的方法，其中所述胰島素原是天然胰島素原、重組胰島素原或胰島素原類似物，例如重組人胰島素原、天然人胰島素原、賴脯胰島素原、地特胰島素原、門東胰島素原或甘精胰島素原。
20.根據(jù)權(quán)利要求12-15和17的方法，所述保護(hù)賴氨酸是Nε-(叔丁氧碳基)_賴氨酸、 N ε -(芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(鄰硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(對硝基芐氧碳基)-賴氨酸、N ε -(烯丙氧碳基)-賴氨酸、N ε -(炔丙氧碳基)-賴氨酸、N ε -(脯氨?；?-賴氨酸、N ε -(半胱氨?；?-賴氨酸、N ε -(環(huán)戊基氧碳基)-賴氨酸、N ε-((1-(6-硝基苯甲酸 [d][l，3] 二氧雜環(huán)戊烯-5-基)乙氧基)羰基)_賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及在29位帶有保護(hù)氨基酸的胰島素原和在B29位帶有保護(hù)氨基酸的胰島素，以及所述胰島素原和胰島素的基因。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的在29位帶有保護(hù)氨基酸的胰島素原和在B29位帶有保護(hù)氨基酸的胰島素的制備方法和用途。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102504022SQ20111038862
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者萬為, 劉文設(shè) 申請人:蘇州元基生物技術(shù)有限公司