專利名稱：用于pcr檢測(cè)植物病害的內(nèi)參基因的引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種用于PCR檢測(cè)出入境檢驗(yàn)檢疫植物病害中外源基因的內(nèi)參基因的引物及其應(yīng)用。屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)全球一體化的逐步加深，世界各國(guó)及地區(qū)間經(jīng)濟(jì)關(guān)系密不可分，尤其是我國(guó)加入WTO后，國(guó)內(nèi)外農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易量的劇增，農(nóng)作物檢疫性有害生物入侵的速度和防控的難度都在不斷加大，尤其是農(nóng)業(yè)植物病害方面檢疫，面臨著巨大的挑戰(zhàn)。由檢疫性有害生物引起的災(zāi)害，其危害往往比氣象災(zāi)害更為嚴(yán)重，防控不及就有可能造成嚴(yán)重?fù)p失。遵照 SPS協(xié)定科學(xué)性、風(fēng)險(xiǎn)管理、透明度、非歧視、等同性等原則，我國(guó)已相繼對(duì)小麥、馬鈴薯、水果等市場(chǎng)解禁，大量疫麥、疫豆、高風(fēng)險(xiǎn)水果進(jìn)入我國(guó)，加之對(duì)境外引種、邊貿(mào)和走私等，以及在檢疫上存在薄弱環(huán)節(jié)和系統(tǒng)檢疫能力尚不夠強(qiáng)大，致使疫情傳入擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)和疫情防御的難度越來(lái)越大，因此，植物病害檢疫面臨巨大挑戰(zhàn)。截止2007年底，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)檢疫性有害生物46種，20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)1種，80 年代發(fā)現(xiàn)2種，90年代發(fā)現(xiàn)9種，近年新發(fā)現(xiàn)25種，僅2006年就新發(fā)現(xiàn)5種。每年因生物災(zāi)害造成的農(nóng)作物產(chǎn)量損失在10%左右，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)600多億元。2007年3月，受起源于巴拿馬的香蕉鐮刀菌枯萎病的嚴(yán)重威脅，廣東、海南、廣西和福建香蕉產(chǎn)業(yè)遭到重創(chuàng)，2008 年四川省廣元市旺蒼縣發(fā)生的柑橘大實(shí)蠅，在全國(guó)不少地方導(dǎo)致柑橘嚴(yán)重滯銷(xiāo)，給果農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為了防止更為嚴(yán)重的外來(lái)疫害的威脅，國(guó)家對(duì)外來(lái)有害生物侵入以及造成的嚴(yán)重危害更加重視，相繼出臺(tái)了若干相關(guān)的法律法規(guī)，強(qiáng)化對(duì)有害生物的檢疫檢驗(yàn)工作，我國(guó)各出入境口岸及產(chǎn)地植物病害檢疫檢驗(yàn)迫切要求高效、特異、靈敏、快捷簡(jiǎn)便的診斷方法。因此，國(guó)家質(zhì)檢總局連續(xù)頒布了幾十種農(nóng)業(yè)植物病害PCR檢測(cè)方法。比如SN/ T 1135. 4-2006馬鈴薯黑粉病菌檢疫鑒定方法、SN/T 2071-2008亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法、SN/T 1465-2004西瓜細(xì)菌性果斑病菌檢疫鑒定方法、SN/T 1813-2006蝴蝶蘭細(xì)菌性軟腐病菌檢疫鑒定方法、SN/T 1390-2004香蕉細(xì)菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法、SN/T 2614-2010葡萄苦腐病菌檢疫鑒定方法等等。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))由于具有耗時(shí)短、特異強(qiáng)、靈敏高等特點(diǎn)，而成為目前植物病害檢驗(yàn)檢疫最廣泛使用的技術(shù)之一。由于 PCR技術(shù)靈敏度高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性的檢測(cè)結(jié)果，因此，在檢測(cè)過(guò)程中，通常要設(shè)立多種的對(duì)照來(lái)監(jiān)控操作PCR過(guò)程，包括內(nèi)參DNA對(duì)照、陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照、陰性目標(biāo)DNA對(duì)照、PCR抑制對(duì)照、擴(kuò)增試劑對(duì)照、提取空白對(duì)照、陽(yáng)性提取對(duì)照、環(huán)境對(duì)照。從而排除PCR檢測(cè)過(guò)程中可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。其中，內(nèi)參DNA對(duì)照的設(shè)立是為了衡量模板DNA 質(zhì)量，是否適合進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而排除由模板中含有的雜質(zhì)造成的假陰性檢測(cè)結(jié)果(即陰性檢測(cè)結(jié)果并不是因?yàn)闃悠分胁缓型庠碊NA模板，而是因?yàn)镈NA模板中存在抑制PCR擴(kuò)增因子)的一個(gè)強(qiáng)有力依據(jù)。以現(xiàn)有報(bào)道，僅僅發(fā)現(xiàn)水稻的植物病害檢測(cè)一般選擇SPS基因?yàn)閮?nèi)參基因，大豆一般選擇Lectin基因?yàn)閮?nèi)參基因，玉米的檢測(cè)一般選擇IVR基因或者ZSS IIb基因?yàn)閮?nèi)參基因，而其他植物病害檢測(cè)內(nèi)參基因未見(jiàn)報(bào)道。隨著進(jìn)出口植物種類的增多，一種植物病害檢測(cè)對(duì)一種植物內(nèi)參基因選擇的方法越來(lái)越不切實(shí)際，不僅降低了工作效率而且增加檢測(cè)的成本和檢測(cè)的時(shí)間，這對(duì)檢測(cè)任務(wù)重、工作量大檢驗(yàn)檢疫部門(mén)來(lái)講更是增加了不少麻煩。因此，很有必要建立一個(gè)通用的植物內(nèi)參基因檢測(cè)引物，以滿足多種多樣進(jìn)出口植物相關(guān)病害檢測(cè)時(shí)內(nèi)參基因需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于PCR檢測(cè)植物病害的內(nèi)參基因的引物，用于出入境植物寄生病害檢測(cè)過(guò)程中PCR模板的評(píng)價(jià)。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明以NCBI公布的植物上葉綠體比較保守的功能基因核酮糖1，5_ 二磷酸羧化酶/ 加氧酶大亞基基因，根據(jù)已報(bào)道的30余種植物的rbcL基因序列表明，其編碼區(qū)具有高度的保守性。下載已經(jīng)克隆測(cè)序的rbcL基因序列，然后利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)定性PCR檢測(cè)引物。1. 其特征在于所述定性PCR檢測(cè)正向引物序列為 5，-TATCTTGGCAGCATTCCGAGTA-3，，反向引物序列為 5，- ACCCTCTTCAAATAGGTCTAATGG-3，。2.所述引物特異性的擴(kuò)增rbcL基因的228bp的DNA片段，用于出入境植物寄生病害檢測(cè)過(guò)程中PCR模板的評(píng)價(jià)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明首次提出在植物病害定性PCR檢測(cè)中建立通用的內(nèi)參基因；
2.本發(fā)明首次提出將植物葉綠體的rbcL基因作為內(nèi)參基因應(yīng)用于植物病害定性PCR 檢測(cè)；
3.本發(fā)明提出的檢測(cè)引物，克服了針對(duì)一種植物一個(gè)內(nèi)參基因的缺陷，大大的提高了檢測(cè)效率、縮短了檢測(cè)時(shí)間。


圖1為rbcL基因特異性檢測(cè)引物溶解曲線分析；A為rbcL_l引物溶解曲線；B為 rbcL-2引物溶解曲線；
圖2為rbcL-Ι引物退火溫度的優(yōu)化；M為分子標(biāo)量100 bp DNA Ladder Marker，泳道 1-10 分別代表退火溫度為48. 80C>49. 90C>51. 30C>52. 80C>54. 50C>56. 1°C>57. 7"C、 59. O0C >59. 90C >60. 5°C，泳道 11 為空白對(duì)照；
圖3為30種不同植物內(nèi)參基因rbcL特異性擴(kuò)增電泳圖；M為分子標(biāo)量IOObp DNA Ladder,泳道1_30為植物樣品材料編號(hào)；
圖4為引物rbcL-1 PCR擴(kuò)增靈敏度電泳圖；M為分子標(biāo)量IOObp DNA Ladder,泳道 1 2，3 4，5 6，7 8，9 10，11 12，13 14，15 16，17 18，19 20，分別為 20ng/yL、 lOng/μ L,5ng/y LUng/μ L,500fg/y LUOOfg/μ L,50fg/y LUOfg/μ L,5fg/y LUfg/ μ L0
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。實(shí)施例1 rbcL基因特異性PCR檢測(cè)引物溶解曲線分析 1實(shí)驗(yàn)材料
1.1植物材料 DNA,由福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所提供。1.2酶及試劑
Power SYBR Green PCR Master Mix 為 ABI 公司產(chǎn)品；RNase A購(gòu)自 TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司；引物合成和克隆測(cè)序有南京金斯瑞生物科技有限公司完成；其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器
定量PCR儀美國(guó)ABI公司生產(chǎn)7500型；離心機(jī)德國(guó)Eppendorf 5810型；PCR儀德國(guó) Eppendorf 公司 Master Cycler gradient 96 ；核酸蛋白分析儀瑞典 APBiotech 產(chǎn)品； 生物安全柜上海力新有限公司。2實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程
2. 1 DNA提取與PCR引物 DNA提取按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19495. 3-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法。引物由南京金絲瑞生物工程有限公司合成，其核苷酸序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度表1。表1引物序列與產(chǎn)物大小
權(quán)利要求
1.一種用于PCR檢測(cè)植物病害的內(nèi)參基因的引物，其特征在于所述內(nèi)參基因?yàn)閞bcL 基因，所述引物為正向引物序列為5’ TATCTTGGCAGCATTCCGAGTA 3’，反向引物序列為5’ ACCCTCTTCAAATAGGTCTAATGG 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述引物的應(yīng)用，其特征在于所述引物特異性的擴(kuò)增rbcL基因的 228bp的DNA片段，用于出入境植物寄生病害檢測(cè)過(guò)程中PCR模板的評(píng)價(jià)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于PCR檢測(cè)植物病害的內(nèi)參基因的引物及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。所述內(nèi)參基因?yàn)閞bcL基因，所述引物為正向5’TATCTTGGCAGCATTCCGAGTA3’，反向5’ACCCTCTTCAAATAGGTCTAATGG3’，所述引物特異性的擴(kuò)增rbcL基因的228bp的DNA片段，用于出入境植物寄生病害檢測(cè)過(guò)程中PCR模板的評(píng)價(jià)。本發(fā)明首次提出在植物病害定性PCR檢測(cè)中建立通用的內(nèi)參基因；首次提出將植物葉綠體的rbcL基因作為內(nèi)參基因應(yīng)用于植物病害定性PCR檢測(cè)；本發(fā)明提出的檢測(cè)引物，克服了針對(duì)一種植物一個(gè)內(nèi)參基因的缺陷，大大的提高了檢測(cè)效率、縮短了檢測(cè)時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102367485SQ20111038801
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者王恒波, 許莉萍, 郭晉隆, 陳如凱, 陳平華, 黃國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)