專利名稱：地中海貧血實(shí)時熒光定量pcr檢測引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體是涉及地中海貧血實(shí)時熒光定量PCR檢測引物和試齊U盒。
背景技術(shù)：
地中海貧血是一組遺傳性溶血性貧血，其共同特點(diǎn)是由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈合成減少或不能合成，導(dǎo)致血紅蛋白的組成成分改變。這種疾病的臨床癥狀輕重不一，大多表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性溶血性貧血。地中海貧血以地中海沿岸國家和東南亞各國多見，我國長江以南各省均有報(bào)道， 以廣西、廣東、海南、四川、重慶等省區(qū)發(fā)病率較高，在北方較為少見。若夫妻為同型地中海貧血的基因攜帶者，每次懷孕，其子女有1/4的機(jī)會為正常，1/2的機(jī)會為攜帶者，另1/4的機(jī)會為重型地中海貧血患者。因此，在遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷方面，這是非常重要的疾病。通常將地中海貧血分為α、β、δ和δ β等4種類型，其中以α和β地中海貧血較為常見。1. β地中海貧血人類β珠蛋白基因簇位于11ρ15. 5。β地中海貧血(簡稱β地貧)的發(fā)生主要是由于基因的點(diǎn)突變，少數(shù)為基因缺失?；蛉笔Ш陀行c(diǎn)突變可致β鏈的生成完全受抑制，稱為β 0地貧；有些點(diǎn)突變使β鏈的生成部分受抑制，則稱為β +地貧。β地貧基因突變較多，迄今已發(fā)現(xiàn)的突變點(diǎn)達(dá)100多種，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)30多種。其中常見的突變有 8 種，包括 CD41-42-TCCI^41-42M)、IVS-II-654C — T(654M)、 CD17A — T(17M)、-28A — G (-28M)、CD26G — A ( β EM)、CD7 卜 72+A (7 卜 72M)、 CD43G — T (43M)、-29A — G(-29M)的檢測，以及少見的 9 個位點(diǎn)突變 CD14-15+G(14-15M)、 CD27-28+C(27-28M), -32C — A(-32M)、-30T — C (-30M)、IVS-I-1G — T(IVS-I-IM)、 IVS-I-5G — C(IVS-I-5M)、CD31_C(31M)、CAP-40-43-AACC (CAPM)和起始密碼子突變 ATG — AGG(IntM)。重型β地貧是β 0或β +地貧的純合子或β 0與β +地貧雙重雜合子，因β鏈生成完全或幾乎完全受到抑制，以致含有β鏈的HbA合成減少或消失，而多余的α鏈則與 Y鏈結(jié)合而成為HbFb2 Y2)，使HbF明顯增加。由于HbF的氧親合力高，致患者組織缺氧。 過剩的α鏈沉積于幼紅細(xì)胞和紅細(xì)胞中，形成α鏈包涵體附著于紅細(xì)胞膜上而使其變僵硬，在骨髓內(nèi)大多被破壞而導(dǎo)致“無效造血”。部分含有包涵體的紅細(xì)胞雖能成熟并被釋放至外周血，但當(dāng)它們通過微循環(huán)時就容易被破壞；這種包涵體還影響紅細(xì)胞膜的通透性，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞的壽命縮短。由于以上原因，患兒在臨床上呈慢性溶血性貧血。貧血和缺氧刺激紅細(xì)胞生成素的分泌量增加，促使骨髓增加造血，因而引起骨骼的改變。貧血使腸道對鐵的吸收增加，加上在治療過程中的反復(fù)輸血，使鐵在組織中大量貯存，導(dǎo)致含鐵血黃素沉著癥。輕型地貧是β 0或β +地貧的雜合子狀態(tài)，β鏈的合成僅輕度減少，故其病理生理改變極輕微。中間型β地貧是一些β +地貧的雙重雜合子和某些地貧的變異型的純合子，或兩種不同變異型珠蛋白生成障礙性貧血的雙重雜合子狀態(tài)，其病理生理改變介于重型和輕型之間。臨床表現(xiàn)根據(jù)病情輕重的不同，β地中海貧血分為以下3型(1)重型，又稱Cooley貧血。 患兒出生時無癥狀，至3-12個月開始發(fā)病，呈慢性進(jìn)行性貧血，面色蒼白，肝脾大，發(fā)育不良，常有輕度黃疸，癥狀隨年齡增長而日益明顯。本病需持續(xù)輸血或者骨髓移植，如不治療， 多在5歲前死亡；( 輕型?；颊邿o癥狀或輕度貧血，也可不貧血，脾不大或輕度大，病程經(jīng)過良好，能正常存活；(3)中間型。多于幼童期出現(xiàn)癥狀，其臨床表現(xiàn)介于輕型和重型之間， 中度貧血，脾臟輕或中度大，黃疸可有可無，骨骼改變較輕。其中，輕型β地中海貧血為地中海貧血基因突變雜合子，可無臨床癥狀或癥狀較輕，容易漏診。因此可以主要針對輕型β 地中海貧血做篩查，對預(yù)防重型β地貧的產(chǎn)生有一定的意義。根據(jù)臨床特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，輕型地中海貧血的臨床表現(xiàn)和紅細(xì)胞的形態(tài)改變與缺鐵性貧血有相似之處，故易被誤診。2. α地中海貧血人類α珠蛋白基因簇位于16Pter_pl3. 3。每條染色體各有2個α珠蛋白基因， 一對染色體共有4個α珠蛋白基因。大多數(shù)α地中海貧血(簡稱α地貧)是由于α 珠蛋白基因的缺失所致，少數(shù)由基因點(diǎn)突變造成。若僅是一條染色體上的一個α基因缺失或缺陷，則α鏈的合成部分受抑制，稱為α +地貧；若每一條染色體上的2個α基因均缺失或缺陷，稱為αΟ地貧。中國南方地區(qū)常見的缺失型有東南亞缺失(一SEA)、右側(cè)缺失 (_α3_7)、左側(cè)缺失(-α42)，常見的三種突變類型為 Hb WS (Westmead)、Hb QS (Quong Sze) 禾口 Hb CS(constant spring)。重型α地貧是α O地貧的純合子狀態(tài)，其4個α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全無α鏈生成，因而含有α鏈的HbA、HbA2和HbF的合成均減少?；颊咴谔浩诩串a(chǎn)生大量Y鏈合成Y4(Hb Bart' s)。Hb Bart' s對氧的親合力極高，造成組織缺氧而引起胎兒水腫綜合征。中間型α地貧是αΟ和α +地貧的雜合子狀態(tài)，是由3個α珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者僅能合成少量α鏈，其多余的β鏈即合成HbH(β 4)，這種情況臨床稱為血紅蛋白H病。HbH對氧親合力較高，又是一種不穩(wěn)定血紅蛋白，容易在紅細(xì)胞內(nèi)變性沉淀而形成包涵體，造成紅細(xì)胞膜僵硬而使紅細(xì)胞壽命縮短。因血紅蛋白H(HbH)病貧血較輕，還伴有肝脾腫大、黃疸，少數(shù)病例還可有肝功能損害，故易被誤診為黃疸型肝炎或肝硬化。輕型α地貧是α +地貧純合子或α O地貧雜合子狀態(tài)，它僅有2個α珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相當(dāng)數(shù)量的α鏈合成，病理生理改變輕微。靜止型α地貧是α +地貧雜合子狀態(tài)，它僅有一個α基因缺失或缺陷，α鏈的合成略為減少，病理生理改變非常輕微。臨床表現(xiàn)1.靜止型患者無癥狀。紅細(xì)胞形態(tài)正常，出生時臍帶血中Hb Bart' s含量為 2%，但3個月后即消失。2.輕型患者無癥狀。紅細(xì)胞形態(tài)有輕度改變，如大小不等、中央淺染、異形等； 紅細(xì)胞滲透脆性降低；HbA2和HbF含量正常或稍低?；純耗氀狧bBart' s含量為3. 4% 14%,于生后6個月時完全消失。3.中間型又稱血紅蛋白H病。此型臨床表現(xiàn)差異較大，出現(xiàn)貧血的時間和貧血輕重不一。大多在嬰兒期以后逐漸出現(xiàn)貧血、疲乏無力、肝脾大、輕度黃疽；年齡較大患者可出現(xiàn)類似重型β地貧的特殊面容。合并呼吸道感染或服用氧化性藥物、抗瘧藥物等可誘發(fā)急性溶血而加重貧血，甚至發(fā)生溶血危象。也有部分患者臨床表現(xiàn)只有輕度到中度的貧血， 伴有脾大，不用輸血治療。實(shí)驗(yàn)室檢查外周血象和骨髓象的改變類似重型β地貧；紅細(xì)胞滲透脆性減低； 變性珠蛋白小體陽性；HbA2及HbF含量正常。出生時血液中含有約25% Hb Bart' s及少量HbH;隨年齡增長，HbH逐漸取代Hb Bart' s，其含量約為2. 4% 44%。包涵體生成試驗(yàn)陽性。4.重型又稱Hb Bart' s胎兒水腫綜合征。胎兒常于30 40周時流產(chǎn)、死胎或娩出后半小時內(nèi)死亡，胎兒呈重度貧血、黃疽、水腫、肝脾腫大、腹水、胸水。胎盤巨大且質(zhì)脆。實(shí)驗(yàn)室檢查外周血成熟紅細(xì)胞形態(tài)改變?nèi)缰匦挺碌刎殻泻思t細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞明顯增高。血紅蛋白中幾乎全是Hb Bart' s或同時有少量HbH，無HbA、HbA2和HbF。目前對于重型β地貧的治療主要是進(jìn)行輸血維持，但本法容易導(dǎo)致含鐵血黃素沉著癥，故應(yīng)同時給予鐵鰲合劑治療；另一種方法是造血干細(xì)胞移植治療，異基因造血干細(xì)胞移植是目前根治重型β地貧的方法。如有HLA相配的造血干細(xì)胞供者，應(yīng)作為治療重型 β地貧的首選方法。無論是哪一種方法，都對患者家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和心理負(fù)擔(dān)。實(shí)際上大部分家庭負(fù)擔(dān)不起高昂的醫(yī)藥費(fèi)而導(dǎo)致患兒夭折。預(yù)防和減少地貧患兒的出生，是解決問題的根本辦法?；蛟\斷一般來說，如果兩名屬同一類型(α或β)的地中海貧血患者結(jié)合，便有機(jī)會生下重型貧血患者。在華南最常見的便是同屬極輕型(靜止型)和輕型α或β地貧父母生下的α或β重型地貧患者。要想知道個體是否有極輕型或輕型地中海貧血，需抽血進(jìn)行血常規(guī)分析和基因檢測，在輕型的地中海貧血(基因攜帶者)，血常規(guī)常表現(xiàn)為小紅細(xì)胞增多癥，即紅細(xì)胞數(shù)比正常人增多，而紅細(xì)胞的平均體積(MCV)變小，一般小于82fL。對于有生育要求的夫婦，如果血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)小紅細(xì)胞增多癥，就應(yīng)該進(jìn)行基因診斷。若證實(shí)本身和配偶同屬β型極輕型或輕型地貧患者，兒女將有四分之一的機(jī)會完全正常、二分之一的機(jī)會成為輕型貧血患者和四分之一的機(jī)會成為中型或重型貧血患者。由于α型地中海貧血的遺傳基因病變較為復(fù)雜，同屬α型輕型貧血者的配偶需要作詳細(xì)的遺傳基因分析，才能預(yù)測下一代成為中型或重型地中海貧血患者的機(jī)會。地中海貧血是由于球蛋白基因的突變或缺失導(dǎo)致的，在東南亞，包括中國，常見的 α地貧是由于α球蛋白基因的缺失所致，常見的基因缺失種類包括-SEA、-4. 2和-3. 7， 在少數(shù)情況是由于α球蛋白基因突變引起，華南地區(qū)常見的點(diǎn)突變類型包括CS(COnStant spring)、QS (Quong Sze)和WS (Westmead)。常見的β地貧是由于β球蛋白基因的突變所致，中國南方人群有8個常見位點(diǎn)突變的β地中海貧血，包括⑶41-42 (-TCTT) (41-42Μ),IVS-11-654 (C ^ Τ) (654M)、CD17(A — Τ) (17Μ)、TATA 盒 nt-沘(A — G) (28M), CD26 (G ^ A) (β EM), CD71-72 (+A) (71-72M)、CD43 (G — Τ) (43M)、-29 (A — G) (29M)，以及少見的 9 個位點(diǎn)突變，包括 CD14-15 (+G) (14-15M) ,CD27-28 (+C) (27-28M)、-32 (C — A) (32M)、-30 (T — C) (30M)、IVS-I-I (G — T) (IVS-I-IM)、IVS-I-5 (G — C) (IVS-1-5M)、CD31 (-C) (31M)、 CAP-40-43 (-AACC) (CAPM)和起始密碼子突變 ATG — AGG(IntM)。基因診斷的方法一、缺失型α -地中海貧血的基因診斷對于缺失型的α-地中海貧血的診斷，目前的基因診斷方法有1. Southern印跡雜交診斷，Southern雜交是早期使用的方法，由于它耗時、過程繁鎖、不經(jīng)濟(jì)，不可能作為常規(guī)方法使用。2.以PCR為基礎(chǔ)的診斷方法。2. 1缺口 PCR(gap-PCR)，此法是最常用的對缺失型突變的檢測法，其原理之一為， 在缺失區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)一對引物，由于4個α基因完全缺失(Barts’水腫胎)，引物沒有可互補(bǔ)的模板，故不能擴(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，但此法不能識別雜合子攜帶者。現(xiàn)在常用的另一方法是缺口連接PCR，其原理是，設(shè)計(jì)的引物和缺失序列的兩側(cè)翼序列互補(bǔ)，由于缺失兩端相接，使本來在正常DNA序列中相距很遠(yuǎn)的這一對引物之間的距離，因斷端連接而靠近，以至于能擴(kuò)增出特定長度的片段。另外一對引物則設(shè)計(jì)位于缺失區(qū)域，這樣僅在雜合子或完全正常的情況下，其中的正常等位基因才會擴(kuò)增出來。此法可以檢出大片段缺失的雜合子，如我國常見的α地貧1(東南亞型，即SEA型)和-α 37及-α4’2兩種α地貧2。2. 2 多重 PCR(M-PCR)，多重 PCR(multiplex PCR，M-PCR)原理為同時引入幾對引物，使幾個PCR得以在同一反應(yīng)體系中完成?，F(xiàn)已能用于同時診斷以下幾種類型的缺失--SEA、-a37、和-α4’2。目前我國臨床應(yīng)用的診斷缺失型α地貧主要應(yīng)用gap-PCR和這種技術(shù)。如深圳益生堂、深圳亞能公司和廣州達(dá)安公司都提供這種試劑盒。二、非缺失型(突變型)地中海貧血的基因診斷1. IPCR-酶解法如突變產(chǎn)生或取消了一個限制性酶切點(diǎn)，用特異的限制酶切 PCR產(chǎn)物，就能很容易地檢測出某種突變。1. 2錯配酶切法由于很多突變并不產(chǎn)生或取消限制性酶切點(diǎn)，這種方法的關(guān)鍵是在引物的3’端，通過改變一個堿基創(chuàng)造或消除一個限制酶切點(diǎn)。1. 3PCR-AS0 聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合寡核苷酸探針雜交(PCR-ASO)，用ASO探針進(jìn)行各種雜交，已廣泛應(yīng)用于檢測基因突變和多態(tài)性。此法也曾用于點(diǎn)突變α和β-地貧的檢測。1. 4ARMS突變特異性擴(kuò)增(ARMS)，又稱為等位特異性PCR(AS-PCR)。其基本原理是，在一對引物之一的3’端設(shè)計(jì)一個堿基與突變堿基配對，這樣，此引物由于3’端與正常 DNA不配對而在PCR反應(yīng)中不能延伸，突變的DNA則可以延伸。因而可將一段正常DNA與該段突變DNA分開。1. 5DGGE變性梯度凝膠電泳(DGGE)，能夠檢出基因組DNA中是否存在突變，但不能確定突變的位置和性質(zhì)的準(zhǔn)確信息，而這需由測序來完成。1. 6RDB反向點(diǎn)雜交(RDB)，檢測點(diǎn)突變的原理和ASO法相同，但RDB是在膜上固定 ASO探針而非固定靶DNA。這樣，在一個雜交反應(yīng)中便能同時分析一個標(biāo)本中存在的多種點(diǎn)突變。雜交信號的檢測現(xiàn)多采用非同位素方法。該技術(shù)關(guān)鍵是根據(jù)靶序列突變點(diǎn)的堿基結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇和調(diào)整ASO探針組成和長度，使各種固化ASO探針在雜交時具有盡可能一致的解鏈溫度。目前國內(nèi)應(yīng)用于檢測基因突變引起的β地貧和α地貧就采用這種技術(shù)。1. 7PCR-SSCP聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)，其原理為單鏈 DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA的電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個堿基替代、微小插入或缺失的檢測。這種技術(shù)較為復(fù)雜，目前應(yīng)用范圍越來越窄。高分辨熔解曲線(HighResolution Melting, HRM)介紹一、HRM 簡介高分辨熔解曲線(High Resolution Melting,HRM)技術(shù)是近年來國際上興起的一種最新的SNP (Single Nucleotide Polymorphisms，單核苷酸多態(tài)性)及突變研究工具。該技術(shù)是2002年由猶他大學(xué)和愛德華科技公司合作開發(fā)的應(yīng)用于SNP檢測分析的一項(xiàng)新技術(shù)。這種檢測方法因其操作簡便、快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。由于其具有靈敏度高、特異性好、高通量、檢測成本低等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)等大規(guī)模的未知突變/SNP和已知突變的genotyping工作。與RDH(反向斑點(diǎn)雜交)技術(shù)相比，這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限， 在進(jìn)行針對已知位點(diǎn)的基因分型工作時，無需序列特異性探針，只需要合成低成本的非標(biāo)記探針或者直接使用小片段擴(kuò)增的方案，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對樣品的分析。二、HRM 原理高分辨率熔解曲線分析(HRM)是通過實(shí)時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況。單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)因不匹配會使雙鏈DNA在升溫過程中先解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、雜合子與純合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。檢測的樣本是PCR產(chǎn)物，依據(jù)雜合異源雙鏈的原理或者不同樣品DNA雙鏈的Tm值差異的原理。在PCR反應(yīng)前加入LC Green飽和熒光染料(LC Green熒光染料只結(jié)合DNA雙鏈，對PCR不會有任何抑制作用)，然后將PCR產(chǎn)物(96/384孔板)直接在PCR儀中進(jìn)行熔解分析，在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，使DNA雙鏈逐漸解鏈，此時LC Green 熒光染料分子逐漸從DNA雙鏈上脫落，96孔板中的每一個孔里的熒光信號均下降。三、HRM與常規(guī)熔解曲線的區(qū)別HRM的概念早在上世紀(jì)70年代就已經(jīng)提出并應(yīng)用于相關(guān)的研究中。限于當(dāng)時有限的實(shí)驗(yàn)條件，人們通過紫外吸收來繪制熔解曲線，當(dāng)然這種方法在檢測精度上相比現(xiàn)在的研究手段要大打折扣。隨著儀器的改良和定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，人們開始用Sybr Green I熒光染料在定量PCR儀上監(jiān)測熔解曲線的變化，這也是現(xiàn)今使用最多的熔解曲線研究工具。然而限于分辨率的關(guān)系，Sybr Green I熔解曲線一般用于區(qū)分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，例如用于檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在引物二聚體及其它非特異性的擴(kuò)增。如果要用Sybr Green I熔解曲線來區(qū)分SNP，目前看來是無法實(shí)現(xiàn)的，這與該類染料的特性相關(guān)。Sybr Green I這類染料屬于非飽和性染料，由于染料對PCR的抑制作用，在實(shí)驗(yàn)中的使用濃度很低，遠(yuǎn)低于將DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝飽和的濃度，由于使用濃度未達(dá)到飽和，加之染料本身的特性，在DNA雙鏈解鏈的過程中，Sybr Green I分子發(fā)生重排，那些從已經(jīng)解鏈的DNA片段上脫離下來的染料分子又與尚未解鏈的雙鏈DNA結(jié)合，造成結(jié)果失真，無法真實(shí)反映DNA熔解的情況，影響了檢測的分辨率。近幾年來，人們發(fā)現(xiàn)/發(fā)明了一類新型的染料，稱為飽和染料，如LC Green, LC Green Plus, SYTO 9和Eva Green0這類染料有著更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力和很低的抑制作用， 在DNA解鏈過程中不會發(fā)生重排，這使得用這些染料的熔解曲線有了更高的分辨率。在儀器精密度提高的基礎(chǔ)上，配合這類飽和染料就出現(xiàn)了我們現(xiàn)在所說的高分辨率熔解曲線， 即HRM。這樣人們便可以利用熔解曲線分析這種極其簡單的實(shí)驗(yàn)手段來對SNP和突變進(jìn)行研究了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種既能單獨(dú)檢測又能并行檢測的3種α球蛋白基因突變和10多鐘β-球蛋白基因突變的地中海貧血基因檢測試劑盒。一種地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒，包括有以下引物中的一對以上針對 TATA 盒 nt-28 (A — G) (28M) ,-29 (A — G) (29M)和 CAP-40-43 (-AACC) (CAPM)基因型的 SEQ ID NO. 1 及 SEQ ID NO. 2 ；針對 CD14-15 (+G) (14-15M)、CD17 (A — Τ) (17Μ)、起始密碼子突變 ATG —AGGQntM)基因型的 SEQ ID NO. 3 及 SEQ ID NO. 4 ；針對 C擬6 (G — Α) ( β EM)、 CDs27-28+C(27-28M)、IVSl-l(G —Τ) (IVS1-1M)、IVS1-5 (G — C) (IVS1-5M)基因型的 SEQID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6 ；針對 CDs41-42_TCTT (41-42M)、CD43G — T (43M)、41_42M/41_42M 基因型的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ；針對 CD71-72 (+A) (71-72M)基因型的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ；針對 IVS2-654C — T (654M)、654M/654M 基因型的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ；針對基因型為 Constant spring (CS)、Quong Sze(QS), Westmead (WS)的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14。所述α-和β-地中海貧血基因診斷劑盒，針對不同位點(diǎn)突變檢測的反應(yīng)可以在一個或多個反應(yīng)管中進(jìn)行。如在多個反應(yīng)管中進(jìn)行PCR反應(yīng)，理想的狀況是反應(yīng)條件相同， 即具有相同的變性、退火和延伸的溫度，這樣所有的檢測就可以一次完成，不用多次檢測。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測的引物。一組用于地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測的引物，包括有以下引物中的一對以上針對 TATA 盒 nt-28 (A — G) (-28M) ,-29 (A — G) (-29M)和 CAP-40-43 (-AACC) (CAPM) 基因型的 SEQ ID NO. 1 及 SEQ ID Ν0· 2 ；針對 CD14-15 (+G) (14-15M)、CD17 (A — Τ) (17M)、起始密碼子突變ATG — AGG(IntM)基因型的SEQ ID Ν0. 3及SEQ ID N0. 4 ；針對⑶洸(G — A) (βΕΜ)、CDs27-28+C(27-28M)、IVSl-I (G — Τ) (IVSl-IM), IVS1-5 (G — C) (IVS1-5M)基因型的 SEQ ID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6 ；針對 CDs41-42_TCTT (41-42M)、CD43G — T (43M)、 41-42M/41-42M 基因型的 SEQ ID N0. 7 及 SEQ ID N0. 8 ；針對 CD71-72 (+A) (71-72M)基因型的 SEQ ID N0. 9 及 SEQ ID NO. 10 ；針對 IVS2-654 C — T(654M)、654M/654M 基因型的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID N0. 12 ；針對基因型為 constant spring (CS)、Quong Sze(QS),Westmead(WS)的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14。本發(fā)明試劑盒診斷的原理是運(yùn)用雙鏈DNA特異熒光進(jìn)行的實(shí)時熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，結(jié)合高分辨熔解曲線分析(high resolution melting analysis, HRM)進(jìn)行基因診斷的方法，能夠同時檢測α-和β-球蛋白的基因突變，可用于α-和β-地中海貧血的確診、攜帶者的篩查和產(chǎn)前基因診斷。本試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是1.檢測特異性好，效果準(zhǔn)確可靠。2.檢測靈敏度高。3.無PCR產(chǎn)物后處理，省力省時。4.閉管操作，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。5.成本低廉，無需熒光標(biāo)記的探針。6.高通量，能滿足大量標(biāo)本快速檢測的需要。


圖1 應(yīng)用HBOl-F和HBOl-R引物擴(kuò)增的HRM高分辨率熔解曲線示意圖；圖2 應(yīng)用HB02-F和HB02-R引物擴(kuò)增的HRM高分辨率熔解曲線示意圖；圖3 應(yīng)用HB03-F和HB03-R引物擴(kuò)增的HRM高分辨率熔解曲線示意圖；圖4 應(yīng)用HB04-F和HB04-R引物擴(kuò)增的HRM高分辨率熔解曲線示意圖；圖5 應(yīng)用HB05-F和HB05-R引物擴(kuò)增的HRM高分辨率熔解曲線示意圖；圖6 應(yīng)用HB06-F和HB06-R引物擴(kuò)增的HRM高分辨率熔解曲線示意圖；圖7 本發(fā)明所述PCR引物位置和質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜；圖8 :HRM高分辨率熔解曲線示意圖，圖中Ν/Ν表示野生型基因型(正常)，CS和 QS分別表示兩者的熔解曲線；圖9 經(jīng)PCR-HRM鑒定的基因型測序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明應(yīng)用所述地中海貧血基因診斷試劑盒的檢測，在PCR前將適當(dāng)?shù)臒晒馊玖吓c反應(yīng)緩沖液、引物、模版DNA等PCR反應(yīng)液混合，然后將混合液加入96孔板或384孔板， 并直接放入熒光定量PCR儀器中(如Roche LC480)，首先進(jìn)行PCR，然后在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性。在此期間，儀器的光學(xué)檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號變化并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型、雜合突變、純和突變，通過軟件自動分型，從而區(qū)分不同位點(diǎn)發(fā)生的突變。本發(fā)明采用實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的DNA可以來源于人類所有含有核酸的細(xì)胞及組織，如血液、精液、臍帶血、羊水、血液中的游離DNA、絨毛組織、毛囊以及植入前的胚胎等。本發(fā)明所用的質(zhì)粒對照的構(gòu)建按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法，大致如下構(gòu)建過程如下，首先獲得beta-globin的序列信息如下加重為外顯子部分。NCBI Reference Sequence :NG_000007. 3。參見圖 7。材料pUC18 vector、限制性內(nèi)切酶(Kpn I.Hind III)、T4 DNA Ligase 購自 TaKaRa 公司；KOD plus-Mutagenesis Kit 購自 Τ0Υ0Β0 公司。方法以正常人基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出包含β珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前-1 位到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后第586位共714bp的序列(GenBankNG_000007. 3)，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pUC18-NPl。pUC18-NPl 的上游引物為 5 ‘ -AGGGTACCTACGGCTGTCATCACTTAGA-3 ‘，下游引物為5' -CCAAAGCTTACTGTACCCTGTTACTTATC-3'。通過PCR擴(kuò)增出包含β珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)后第1074位到第1813位共740bp的序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18_NP2。pUC18_NP2 的上游引物為 5 ‘ -TTGGTACCGGGCAATAATGATACAATG-3 ‘，下游引物為 5 ‘ -TGAAAGCTTTTCTG AGGGATGAATAAGG-3‘。其中 GGTACC 為 Kpn I 的酶切位點(diǎn)，AAGCTT 為 Hind III 的酶切位。用 Premix PrimeSTAR HS聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為，98°C IOs ；68°C Imin ;30個循環(huán)。 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物用Kpn I和Hind III雙酶切后回收，與經(jīng)同樣酶切回收后的載體pUC18， 通過T4 DNA Ligase在16°C進(jìn)行連接反應(yīng)10h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。以 PUC18-NP1和pUC18-NP2為模板，利用定點(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建12種β地貧突變質(zhì)粒。弓丨物序列見表2。用KOD plus高保真聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C 2min,98°C 10s， 68°C %iin，反應(yīng)7個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，首先用Dpn I處理PCR產(chǎn)物，然后加入Ligation high和T4 Polynucleotide Kinase進(jìn)行連接反應(yīng)，最后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。對陽性克隆進(jìn)行DNA測序鑒定。表1. 12種地貧質(zhì)粒引物序列
權(quán)利要求
1.一種地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征是，包括有以下引物中的一對以上針對 TATA 盒 nt-28 (A — G) (-28M)、-29 (A — G) (-29M)和 CAP-40-43 (-AACC) (CAPM)基因型的 SEQ ID NO. 1 及 SEQ ID NO. 2 ；針對 CD14-15 (+G) (14-15M)、CD17(A — Τ) (17Μ)、起始密碼子突變ATG —AGG(IntM)基因型的SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4 ；針對 CD26 (G — Α) (βΕΜ)、CDs27_28+C (27—28Μ)、IVSl-I (G — Τ) (IVS-I-IM), IVS1-5 (G — C) (IVS-I-5M)基因型的 SEQID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6 ；針對 CDs41-42-TCTT (41-42M), CD43 (G — Τ) (43Μ)、41_42Μ/41_42Μ 基因型的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ；針對 CD71-72(+A) (71-72M)基因型的 SEQ ID NO. 9及SEQ ID NO. 10 ；針對 IVS2-654C —T (654M)、 654M/654M基因型的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID N0. 12 ；針對基因型為 Constant spring (CS), Quong Sze (QS), Westmead (WS)的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征是，還包括有飽和熒光染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征是，所述飽和熒光染料為 LC green、LC Green Plus、SYTO 9、或 Eva Green。
4.一種用于地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測的引物，其特征是，包括有以下引物中的一對以上針對TATA盒nt-觀(A — G) (-28M)、-29 (A — G) (-29M)和 CAP-40-43 (-AACC) (CAPM)基因型的 SEQ ID NO. 1 及 SEQ ID N0. 2 ；針對 CD14-15 (+G) (14-15M)、CD17 (A — Τ) (17M)、起始密碼子突變 ATG — AGG 基因型的 SEQ ID N0. 3 及 SEQ ID N0. 4 ；針對 CD26(G — Α) ( β EM)、CDs2718+C 0718M)、IVSl-I (G — Τ) (IVS-I-IM)、IVS1-5 (G — C) (IVS-I-5M)基因型的 SEQ ID NO. 5 及 SEQ ID NO. 6 ；針對 CDs41-42-TCTT (41-42M), CD43G — T (43M)、41_42M/41_42M 基因型的 SEQ ID NO. 7 及 SEQ ID NO. 8 ；針對 CD71-72(+A) (71-72M)基因型的 SEQ IDN0. 9 及 SEQ ID NO. 10 ；針對 IVS2-654C — T (654M)、654M/654M 基因型的 SEQ IDN0. 11 及 SEQ ID NO. 12 ；針對基因型為 Constant spring (CS)、Quong Sze(QS),Westmead(WS)的 SEQ ID Ν0· 13 及 SEQ ID NO. 14。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種地中海貧血基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒和相關(guān)引物，該試劑盒包括有以下引物中的一對以上針對TATA盒nt-28(A→G)(-28M)、-29(A→G)(-29M)和CAP-40-43(-AACC)(CAPM)基因型的SEQ ID NO.1及SEQ IDNO.2；針對CD14-15(+G)(14-15M)、CD17(A→T)(17M)、起始密碼子突變ATG→AGG(IntM)基因型的SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4；針對CD26(G→A)(βEM)、CDs27-28+C(27-28M)、IVS1-1(G→T)(IVS1-1M)、IVS1-5(G→C)(IVS1-5M)基因型的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6；針對CDs41-42-TCTT(41-42M)、CD43G→T(43M)、41-42M/41-42M基因型的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；針對CD71-72(+A)(71-72M)基因型的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10；針對IVS2-654C→T(654M)、654M/654M基因型的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；針對基因型為constant spring(CS)、Quong Sze(QS)、Westmead(WS)的SEQ ID NO.13及SEQ IDNO.14。所述試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是檢測特異性好，檢測靈敏度高。
文檔編號C12Q1/68GK102409100SQ20111038811
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者吳教仁, 楊立業(yè), 林敏 , 鄭佳坤 申請人:潮州市中心醫(yī)院