專利名稱：一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的菌株hd924和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制造領(lǐng)域，具體涉及到用一種好氧微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的菌株HD9M和利用該菌株發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法。
背景技術(shù)：
二羥基丙酮，又稱1，3-二羥基丙酮，英文名為1，3-dihydroxyacetone或 dihydroxyacetone,簡(jiǎn)寫為DHA，分子式為C3H6O3,分子量為90. 08，是最簡(jiǎn)單的三碳酮糖， 外觀是白色或類白色粉末狀結(jié)晶，具有甜、涼的味道，易吸濕并分解。一般狀態(tài)下是二聚體 (1，4-Dioxane)的結(jié)晶，經(jīng)溶解或加熱后變?yōu)閱误w。二羥基丙酮是一種天然存在、水溶性的最簡(jiǎn)單的酮糖，具有生物可降解性，可食用且對(duì)人體和環(huán)境無毒害；其分子中帶有幾個(gè)活潑集團(tuán)，可催化多種反應(yīng)。其衍生物是有機(jī)化學(xué)合成中非常重要的一類中間體。因此作為一種重要的化工原料、醫(yī)藥中間體和功能添加劑在國(guó)外已經(jīng)得到了廣泛的實(shí)際應(yīng)用。因?yàn)槎u基丙酮分子中含有三種官能團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)活潑，廣泛參與諸如聚合、縮合等化學(xué)反應(yīng)，是一種重要的化學(xué)合成中間體。在工業(yè)上，DHA 可有效還原丁二烯一苯乙烯復(fù)合物；能有效催化甲醛到羥醛、羥酮的縮合反應(yīng)；可合成雜環(huán)化合物、、甘油三酯、酮位取代化合物；還可用于合成無毒可降解的生物材料產(chǎn)品。此外， 二羥基丙酮還可作為一種良好的活性著色成份被廣泛應(yīng)用到化妝品中。DHA最大特點(diǎn)之一就是具有極強(qiáng)的防曬性，可與皮膚表層自由氨基結(jié)合在皮膚表面形成一細(xì)密的薄膜，反射太陽(yáng)光，屏蔽紫外線，阻止皮膚水分過度蒸發(fā)，起到很好的保濕及防曬作用。目前，DHA作為藥物已經(jīng)應(yīng)用在低血糖與糖尿病的治療及某些病毒性皮膚病(如對(duì)白斑和白癜風(fēng)就具有顯著療效)的治療上。作為醫(yī)藥中間體，DHA能合成一些治療心血管疾病的藥物。同時(shí)它還可直接作為一種抗病毒試劑，如在雞蛋胚胎培養(yǎng)中，使用DHA能大大抑制雞瘟病毒的感染，殺死5廣100%的雞瘟病毒。另外以DHA作為中間體合成相應(yīng)的衍生物，可具有抗艾滋病病毒的作用。在農(nóng)業(yè)及食品方面，二羥基丙酮可用作飼料添加劑，在豬飼料中加入一定量的二羥基丙酮和丙酮酸鹽的混合物，能減少豬肉的脂肪含量增加瘦肉率。在膳食中添加二羥基丙酮可提高有氧耐力，也可以改變機(jī)體代謝率和底物利用血脂的變化等方面。二羥基丙酮的工業(yè)化生產(chǎn)主要是利用含有甘油脫氫酶微生物以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)。目前報(bào)道最多的能產(chǎn)甘油脫氫酶的微生物為葡萄糖酸桿菌屬如Cter)和醋桿菌屬(A^to如cter)，能產(chǎn)生二羥基丙酮的主要微生物資源如下Bacillus xylinum、 Acinetobacter sp. strain JCl DSM 3803, Acetobacter xylinum A-9, Gluconobacter melanogenus IFO 3293、Gluconobacter melanogenus IFO 3294、Hansenula polymorpha CBS 4732、Candida boidinii 2201、Klebsiella aerogenes.、Escherichia coli (strain ECFS)、 Gluconobacter oxydans ATCC 621, Pichia membranifaciens、 Bacillus licheniformis B-05571、Acetonionassp等。國(guó)內(nèi)外關(guān)于高產(chǎn)二羥基丙酮的微生物資源報(bào)道較少。因此，自主創(chuàng)新地篩選出能夠耐受高濃度甘油的微生物菌株，并且研究出一種能夠生產(chǎn)高濃度二羥基丙酮的方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種對(duì)高濃度甘油有一定耐受性的菌株HD924，該菌株可用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮。本發(fā)明還給出了利用該菌株HD9M發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，該方法以廉價(jià)的甘油為原料，甘油轉(zhuǎn)化率較高。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的菌株HD924，其分類屬醋酸桿菌科 (.Acetobacteraceae)葡萄糖酸桿菌屬(Mluconobacter)弗托氏葡萄糖酸桿菌 (.Gluconobacter frateurii),該菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為=CGMCC No. 5397，保藏日期2011年10月觀日，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。利用所述菌株HD9M發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，具體為將菌株HD9M按 1 10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在好氧條件下于觀 30°C發(fā)酵培養(yǎng)48 72h ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為甘油50 350g/L，氮源5 20g/L，碳酸鈣0. 1 15g/L，用水配制，培養(yǎng) SpH 4 7。較好的，也可以將菌株HD9M先按1 10%的接種量接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中，于 28 30°C好氧培養(yǎng)4 M h ；然后將培養(yǎng)好的一級(jí)種子按1 10%的接種量接入二級(jí)種子培養(yǎng)基中，8 10 h后將培養(yǎng)好的二級(jí)種子按1 10%的接種量再接入發(fā)酵培養(yǎng)基；其中， 所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為甘油30 50g/L，酵母粉5 15g/L，KH2PO4 0. 1 0. 5g/L， 用水配制，PH自然；所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為甘油30 50g/L，酵母粉5 15g/L， CaCO3 0. 1 0. 5g/L，用水配制，pH 4. 0 7. 0。具體的，所述甘油優(yōu)選為食品級(jí)甘油、工業(yè)級(jí)甘油或皂化粗甘油等。所述氮源選自酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、尿素或無機(jī)銨鹽等?？赏ㄟ^本領(lǐng)域的常規(guī)方法來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值，如添加鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉等無機(jī)酸堿鹽。其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基、一級(jí)種子培養(yǎng)基及二級(jí)種子培養(yǎng)基的滅菌條件為 115 121°C，15 25min。在本發(fā)明中，建立了一個(gè)篩選高產(chǎn)二羥基丙酮的模型。由于具有甘油脫氫酶的微生物能利用甘油做為碳源生長(zhǎng)，并產(chǎn)生二羥基丙酮，因此設(shè)計(jì)出以甘油為唯一碳源的選擇性平板，篩選出能夠利用甘油的菌株。在平板上挑出較大的菌落至搖瓶發(fā)酵篩選。本發(fā)明的特點(diǎn)是從腐爛的水果中分離得到能有效產(chǎn)生二羥基丙酮的弗托氏葡萄糖酸桿菌 iGluconobacter /ratearii) HD924，其在好氧條件下能顯著地積累二羥基丙酮(40 — 170 g/L)，最高達(dá)到170 g/L，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明方法的突出優(yōu)點(diǎn)是利用廉價(jià)的甘油為原料來發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮，該方法可持續(xù)生產(chǎn)，且對(duì)環(huán)境友好。


圖1為弗托氏葡萄糖酸桿菌HD924的平板菌落照片(XlO)； 圖2為弗托氏葡萄糖酸桿菌HD924的掃描電鏡照片(X 10000)； 圖3為弗托氏葡萄糖酸桿菌HD924的16S rDNA全序列測(cè)序結(jié)果； 圖4為基于BLAST結(jié)果構(gòu)建的進(jìn)化樹。
具體實(shí)施例方式(一)弗托氏葡萄糖酸桿菌力acierfrateurii) HD924的篩選 1、初篩
從腐爛的水果中取樣，粉碎后，取IOg加入90mL無菌生理鹽水，振蕩1 h，取上清液，稀釋成一系列濃度梯度。取10_5、10_6、1(Τ三個(gè)梯度0. 2 mL涂布于平板培養(yǎng)基(平板培養(yǎng)基組成為甘油30g/L，酵母粉15g/L，瓊脂粉15g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然培養(yǎng)；Γ4 d，獲得單菌落。選取菌落均勻的平板，從其上挑取10 - 20個(gè)較大菌落分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基 (每株菌株做一個(gè)搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為甘油100 g/L，酵母粉10g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然發(fā)酵培養(yǎng)48h。然后取1. 5mL發(fā)酵液12000轉(zhuǎn)/分離心5 min,取0. 5 mL上清液，加入4. 5mL 二苯胺溶液(二苯胺溶液按下述方法配制將0.6g 二苯胺與M mL無水乙酸混勻，再緩緩加入 6mL濃硫酸，混勻即得)，沸水浴15min后測(cè)定0D_，并依此計(jì)算出二羥基丙酮含量(具體的測(cè)定方法可參見劉宇鵬，李華等，發(fā)酵液中1，3— 二羥基丙酮的分光光度法測(cè)定，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42 (11)，834 — 837)。選取產(chǎn)二羥基丙酮較高的百余株菌株，于4°C條件下保存其相應(yīng)斜面(斜面培養(yǎng)基組成為甘油30g/L，酵母粉15g/L，瓊脂粉15g/L，KH2PO4 3g/L，pH自然，甘油為食品級(jí))。2、復(fù)篩
將初篩保留的菌株轉(zhuǎn)接于裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中(每株菌株做三個(gè)搖瓶平行樣，發(fā)酵培養(yǎng)基組成與初篩中的發(fā)酵培養(yǎng)基相同)，200轉(zhuǎn)/分，28°C好氧培養(yǎng)48h。取1. 5mL發(fā)酵液12000轉(zhuǎn)/分離心5min，取上清液，稀釋后用HPLC法測(cè)定二羥基丙酮含量。HPLC條件如下色譜柱Aminex HPX-87H柱(7. 8 mmX300 mm, 9 μπι);流動(dòng)相 8 mmol/L硫酸；檢測(cè)器RI檢測(cè)器，UV檢測(cè)器(檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm)；柱溫50°C ；流速0. 5 ml/ min ；進(jìn)樣量20 μ 1。多數(shù)菌株二羥基丙酮含量較低，僅有3-8-4號(hào)菌株(實(shí)驗(yàn)室該菌株編號(hào)為HD924) 產(chǎn)二羥基丙酮顯著，為45. 7 g/L。表1中給出了產(chǎn)二羥基丙酮效果較好的數(shù)十余株菌株。
表1部分試驗(yàn)菌襪的產(chǎn)二羥基丙酮情況
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的菌株HD924，其分類屬醋酸桿菌科 (.Acetobacteraceae)葡萄糖酸桿菌屬(Mluconobacter)弗托氏葡萄糖酸桿菌 (.Gluconobacter frateurii),該菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No. 5397。
2.利用權(quán)利要求1所述菌株HD9M發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，其特征在于包括如下步驟將菌株HD9M按1 10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在好氧條件下于觀 30°C發(fā)酵培養(yǎng)48 72 h ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為甘油50 350g/L，氮源5 20g/L，碳酸鈣0. 1 15g/L，培養(yǎng)基pH 4 7。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，其特征在于，將菌株HD9M先按1 10%的接種量接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中，于觀 30°C好氧培養(yǎng)4 M h ；然后將培養(yǎng)好的一級(jí)種子按1 10%的接種量接入二級(jí)種子培養(yǎng)基中，8 10 h后將培養(yǎng)好的二級(jí)種子按1 10%的接種量再接入發(fā)酵培養(yǎng)基；其中，所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為甘油 30 50g/L，酵母粉5 15g/L，KH2PO4 0. 1 0. 5g/L，pH自然；所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為甘油 30 50g/L，酵母粉 5 15g/L, CaCO3 0. 1 0. 5g/L, pH 4. 0 7. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，其特征在于，所述甘油選自食品級(jí)甘油、工業(yè)級(jí)甘油或皂化粗甘油。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，其特征在于，所述氮源選自酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、尿素或無機(jī)銨鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的菌株HD924，其分類屬醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)葡萄糖酸桿菌屬(Gluconobacter)弗托氏葡萄糖酸桿菌(Gluconobacterfrateurii)，該菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.5397。本發(fā)明還給出了利用該菌株發(fā)酵甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的方法，其在好氧條件下能顯著地積累二羥基丙酮，最高達(dá)到170g/L，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102391976SQ201110388519
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者劉宇鵬, 孫楊, 李華, 王磊, 陳萬河 申請(qǐng)人:河南大學(xué)