專利名稱：基于三種生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及果實(shí)采后病害防治技術(shù)領(lǐng)域，更具體的是一種用于防治柑橘果實(shí)病害的生物防腐保鮮技術(shù)。
背景技術(shù)：
柑橘是產(chǎn)量最大的水果之一，栽培歷史悠久。但柑橘產(chǎn)區(qū)一般均地處亞熱帶地區(qū)， 溫濕度均較適合果實(shí)病原菌的生長，每年由于病理性腐爛導(dǎo)致的采后損失巨大。目前，化學(xué)殺菌劑是控制果實(shí)采后腐爛的主要和最有效方法。但是，隨著國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和消費(fèi)水平的提高，人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，化學(xué)類殺菌劑的使用范圍越來越受限制。 此外由于長期使用殺菌劑，病原菌能進(jìn)化產(chǎn)生了大量抗藥性菌種。因此從可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，開發(fā)新型、高效且安全的有機(jī)、綠色的保鮮劑具有重大的社會意義和廣闊的應(yīng)用前
旦
ο近年來利用安全且有拮抗病原菌活性的酵母防治果實(shí)病害的研究受到了國內(nèi)外廣泛的重視，被認(rèn)為是最有希望的替代化學(xué)殺菌劑的方法之一。但現(xiàn)有生防酵母的對病害的控制效力與化學(xué)殺菌劑相比仍有較大差距，例如即使是美國的已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)品(Aspire，基于酵母Candida oleophila的商業(yè)化產(chǎn)品)也只有在與低劑量殺菌劑 (thiabendazole, TBZ)聯(lián)合使用時(shí)才能達(dá)到對柑橘或葡萄等果實(shí)主要病害的完全控制。酵母菌株 Rhodosporidium ρ aludigenum Fell&Tallman 是一株從海洋中分離得到的新型果實(shí)病害生防酵母。中國發(fā)明授權(quán)專利《一株水果蔬菜的生物保鮮劑及其制備方法》，專利號200610155209. 0，公開了一種基于紅冬孢酵母和尼泊金乙酯鈉或尼泊金丁酯鈉制備水果蔬菜的生物殺菌劑的方法。中國發(fā)明授權(quán)專利《用于果蔬采后病害生物防治的海洋酵母及其制備方法和用途》，專利號ZL 200610155062. 5，公開了一種用海洋酵母菌株 Rhodosporidium ρ aludigenum i^ell&Tallman抑制鏈格孢、灰葡萄孢、擴(kuò)展青霉、指狀青霉、多毛孢等多種果蔬采后主要真菌病害的生物防治方法。中國發(fā)明授權(quán)專利《一種海洋酵母的用途和相應(yīng)微生物燃料電池及制備方法》。授權(quán)公告號CN101552340B，公開了一種利用紅冬孢酵母制備微生物燃料電池的方法。中國發(fā)明申請專利《一種防治果蔬病害的生物保鮮劑及其制備方法》，申請?zhí)?00910095643. 8，公開了一種基于紅冬孢酵母和羧甲基纖維素鈉等物質(zhì)防治果蔬病害的生物保鮮方法。中國發(fā)明申請專利《海洋酵母Miodosporidum paludigenum Fell&Tallman的專用甘蔗糖蜜培養(yǎng)基》，申請?zhí)?010101485270，公開了一種海洋酵母I^hodosporidum paludigenum i^ell&Tallman液體培養(yǎng)的方法。中國發(fā)明申請專利《海洋酵母I^hodosporidum paludigenum Fell&Tallman的真空冷凍干燥制》，申請?zhí)?2010101400817，公開了一種紅冬孢酵母活性干粉制備的方法。中國發(fā)明申請專利《一種誘導(dǎo)提高海洋紅冬孢酵母對果實(shí)病害防治效力的方法》，申請?zhí)?010105517M. 8，公開了一種利用幾丁質(zhì)物質(zhì)誘導(dǎo)提高紅冬孢酵母生防效力的方法。羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)是國內(nèi)外較廣泛研究的采后生物防治酵母菌株。中國發(fā)明授權(quán)專利《一種酵母拮抗菌的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基》，專利號ZL200510090063. 1，公開了一種羅倫隱球酵母的培養(yǎng)基配方；中國發(fā)明授權(quán)專利《酵母拮抗菌C. Iaurentii的真空冷凍干燥制品及其制備方法》，專利號ZL200510090065. 0，公開了一種羅倫隱球酵母冷凍干燥制品的制備方法；中國發(fā)明申請專利《一種生物拮抗菌及其應(yīng)用》，申請?zhí)?00310115336. 4，公開了一種利用羅倫隱球酵母和殺菌劑及氯化鈣等防治甜櫻桃、冬棗及蘋果果實(shí)病害的方法；中國發(fā)明申請專利《一種生物活性果蔬保鮮膜》， 申請?zhí)?00810128441. 4，公開了一種利用羅倫隱球酵母和海藻酸鈉等保鮮蘋果和圣女果等果實(shí)的方法；中國發(fā)明申請專利《葡萄果實(shí)采后病害或果粒脫落的防治方法及其專用防治劑》，申請?zhí)?00910078858. 9，公開一種利用羅倫隱球酵母和硼酸鹽等防治葡萄果實(shí)病害或脫粒的方法；中國發(fā)明申請專利《一種隱球酵母屬菌膠囊劑及其制備方法》，申請?zhí)?200910079774. 7，公開了一種制備羅倫隱球酵母常溫保存的膠囊劑制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種在不使用化學(xué)殺菌劑前提下能有效控制柑橘果實(shí)采后病害的生物防腐保鮮劑。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于三種生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，該保鮮劑由羅倫隱球酵母懸浮液、粘紅酵母懸浮液、紅冬孢酵母懸浮液和水組成，每IL保鮮劑中含有1 X 101° 1 X IO11個(gè)羅倫隱球酵母細(xì)胞、1 X 101° 1 X IO11個(gè)粘紅酵母細(xì)胞、IXIOltl IXlO12個(gè)紅冬孢酵母細(xì)胞1，其余為水；羅倫隱球酵母為保藏號為CGMCC NO. 3590的羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10 ；紅冬孢酵母是保藏號為IMI 394084的海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell&TalIman ；粘紅酵母參椐的生物材料為ZJU 11，分類命名為粘紅酵母Iihodotorula glutinis，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年1月20日，保藏號CGMCCN0. 3589。本發(fā)明所選用的羅倫隱球酵母的保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii) ZJU 10，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2010年1月20日，保藏號CGMCC NO. 3590。保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所。該羅倫隱球酵母在申請?zhí)枮?01010152108. 4的專利中有明確告知。本發(fā)明所選用的海洋酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Felieallman)被保藏于英國國際真菌研究所國際農(nóng)業(yè)與生物中心基因資源保藏中心(International Mycological Institute, CABI Genetic Resource Collection)，保藏地址英國 TW209TY 薩里郡艾格鎮(zhèn)貝克漢姆路國際農(nóng)業(yè)與生物中心英國中心，保藏日期2006. 4. 19，保藏編號 IMI 394084。該菌株已經(jīng)在申請?zhí)枮?00610155209. 0的專利中被公開。本發(fā)明的生物防腐保鮮劑，是將羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii ZJU 10，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號CGMCC NO. 3590)、粘紅酵母 (Rhodotorulaglutinis ZJU 11，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號CGMCC NO. ；3589)、紅冬孢酵母(Rhodosporidiumpaludigenum Fell&Tallman，英國國際真菌研究所國際農(nóng)業(yè)與生物中心基因資源保藏中心保藏編號IMI 394084〕懸浮液復(fù)合進(jìn)行處理而得；其可以進(jìn)行常溫或低溫貯藏。本發(fā)明的生物防腐保鮮劑只有在確保酵母活性的基礎(chǔ)上才能發(fā)揮最佳的防腐效應(yīng)，因此所用的酵母懸浮液是指經(jīng)過菌種活化、并配制成的具有抑菌效果且濃度適宜的酵母菌懸液。本發(fā)明的生物防腐保鮮劑有效整合了 3種生防酵母的活性，從而能顯著抑制柑橘果實(shí)病害的發(fā)生和發(fā)展；由于能根據(jù)具體情況大幅度降低拮抗酵母的使用量，從而顯著降低成本。本發(fā)明的生物防腐保鮮劑具有安全高效、環(huán)境友好、病害防治效果突出等優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明的生物防腐保鮮劑，能轉(zhuǎn)變長期以來依賴化學(xué)殺菌劑為主的果實(shí)真菌病害控制方法，對確保食品安全、環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收和經(jīng)濟(jì)社會可持續(xù)的發(fā)展等具有重要
眉、ο實(shí)際使用時(shí)，可任選以下任意一種處理方式對果實(shí)進(jìn)行處理處理方式一選擇無機(jī)械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質(zhì)基本一致的果實(shí)，用自來水沖洗、并在室溫(25°C左右)下放干。將果實(shí)在本發(fā)明的生物防腐保鮮劑中浸泡3分鐘后，取出放干，然后放入保鮮薄膜袋中在室溫(25°C左右)下保持20 24小時(shí)，接著將果實(shí)從薄膜袋中取出，裝箱貯藏。處理方式二 采前采用噴壺噴灑的處理方法，將本發(fā)明的生物防腐保鮮劑溶液噴在果實(shí)表面(濕潤即可)，待干后取下果實(shí)放入保鮮薄膜袋中在室溫(25°C左右)下保持 20 M小時(shí)，再將果實(shí)從薄膜袋中取出，裝箱貯藏。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中的果實(shí)為正常商業(yè)成熟度的柑橘(Citrus unshiu Marc.)果實(shí)，試驗(yàn)品種為早桔。選擇無機(jī)械損傷、未感染、大小和成熟度等外觀品質(zhì)基本一致的果實(shí)，用質(zhì)量濃度0. 次氯酸鈉溶液浸泡消毒1-2分鐘后，用自來水沖洗，在室溫下Q0-25°C )放干后備用。拮抗酵母為羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii ZJU 10)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis ZJU 11)禾口紅冬抱酵母(Rhodosporidium paludigenum Fell&Tallman)；病原菌為病原菌為指狀青霉(Penecillium digitatum)。3種酵母懸浮液的制備方法分別如下以下所用的NYDA培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，瓊脂20克，水定容至1000ml，常規(guī)高壓(lkg/cm2)12rC滅菌30分鐘。。所用的NYDB種子培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g、酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，常規(guī)高壓(lkg/cm2) 121°C滅菌30分鐘。羅倫隱球酵母、粘紅酵母，紅冬孢酵母分別在低溫)下保存在NYDA培養(yǎng)基中。 培養(yǎng)程序均依次為①、活化先在NYDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，然后重復(fù)傳代培養(yǎng)2次(每次均為在NYDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí))；將上述重復(fù)傳代培養(yǎng)2次所得的活化好的酵母用接種環(huán)接到NYDB種子培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng)M小時(shí)；然后在相同條件下重復(fù)培養(yǎng)1次(即將NYDB種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得的酵母再次用接種環(huán)接到NYDB種子培養(yǎng)基中，28°C下培養(yǎng) 24小時(shí))；②、液體培養(yǎng)用步驟①活化所得的酵母按照5% (重量比)的接種量接到NYDB種子培養(yǎng)基中，在200rpmJ8°C條件下培養(yǎng)M小時(shí)；③、離心分離將步驟②培養(yǎng)后的所得物在3000rpm條件下，離心10分鐘，并用滅菌蒸餾水洗2次，以去除培養(yǎng)介質(zhì)；④、懸浮和確定濃度用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細(xì)胞，用血球記數(shù)板的方法確定酵母的濃度，并用無菌蒸餾水調(diào)整到試驗(yàn)所需要的濃度。實(shí)驗(yàn)并以釀酒酵母作為對照，保存方法和培養(yǎng)方法同上。該釀酒酵母為從啤酒中一般性分離得到的普通酵母。實(shí)施例1、一種生物防腐保鮮劑先分別單獨(dú)活化和培養(yǎng)羅倫隱球酵母、粘紅酵母，紅冬孢酵母；將3種酵母的濃度均調(diào)整到5 X IO8個(gè)細(xì)胞/ml，取2升體積的羅倫隱球酵母懸浮液，加入2升體積的粘紅酵母懸浮液，攪拌混勻3分鐘；然后加入2升體積的紅冬孢酵母懸浮液，完畢后繼續(xù)攪拌混勻5 分鐘，加水稀釋到10升備用。該最終所得的每L生物防腐保鮮劑中分別含有IX IO11個(gè)的羅倫隱球酵母、1 X IO11個(gè)的粘紅酵母，1 X IO11個(gè)的紅冬孢酵母細(xì)胞，其余為水。為了證明本發(fā)明的生物防腐保鮮效果，發(fā)明人進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)、柑橘果實(shí)生物防腐保鮮劑的效果實(shí)驗(yàn)用消過毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面形成統(tǒng)一大小和的深度的傷口。將不同的組合試劑50 μ 1分別添加到不同的果實(shí)傷口處。病原菌接種在以上處理2小時(shí)后在每個(gè)傷口加入等量(30 μ 1)的病原菌孢子懸浮液(Penecillium digitatum濃度為104spores/ml)。處理完畢后27 下貯藏，并用PE塑料膜密封作保濕處理。每個(gè)處理每重復(fù)12個(gè)果實(shí)， 每處理重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果見表1。具體處理安排如下處理1:水，即空白對照。處理2 處理液所含成分濃度分別為粘紅酵母細(xì)胞懸浮液濃度為lX108CellS/ml， 紅冬孢酵母細(xì)胞懸浮液濃度為ι χ 108cells/ml，羅倫隱球酵母懸浮液濃度為1 X IO8Cells/ ml。即實(shí)施例1。處理3 處理液所含成分為粘紅酵母細(xì)胞懸浮液濃度為3X 108CellS/ml。處理4 處理液所含成分為紅冬孢酵母細(xì)胞懸浮液濃度為3X 108Cells/ml。處理5 處理液所含成分為羅倫隱球酵母懸浮液濃度為3X 108Cells/ml。處理6 處理液所含成分為普通酵母懸浮液濃度為3X 108Cells/ml。處理7 處理液所含成分分別為粘紅酵母細(xì)胞懸浮液濃度為2X108CellS/ml，紅冬孢酵母細(xì)胞懸浮液濃度為lX108cells/ml。處理8 處理液所含成分分別為粘紅酵母細(xì)胞懸浮液濃度為2X108CellS/ml，羅倫隱球酵母細(xì)胞懸浮液濃度為IX 108cells/ml。處理9 處理液所含成分分別為紅冬孢酵母懸浮液濃度為2X 108Cells/ml，粘紅酵母細(xì)胞懸浮液濃度為lX108cells/ml。處理10 處理液所含成分分別為紅冬孢酵母懸浮液濃度為2X 108Cells/ml，羅倫隱球酵母細(xì)胞懸浮液濃度為IX 108cells/ml。處理11 處理液所含成分分別為羅倫隱球酵母懸浮液濃度為2X108CellS/ml， 粘紅酵母細(xì)胞懸浮液濃度為lX108cells/ml。處理12 處理液所含成分分別為羅倫隱球酵母懸浮液濃度為2X108CellS/ml， 紅冬孢酵母細(xì)胞懸浮液濃度為IX 108cells/ml。處理13 處理液所含成分為粘紅酵母細(xì)胞懸浮液濃度為1 X 109cells/mL·處理14 處理液所含成分為紅冬孢酵母細(xì)胞懸浮液濃度為1 X 109cells/mL·處理15 處理液所含成分為羅倫隱球酵母懸浮液濃度為1 X 109cells/mL·處理16 處理液所含成分為普通酵母懸浮液濃度為IX 109Cells/ml。具體結(jié)果如表1所示。表1、試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.基于三種生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，其特征是所述保鮮劑由羅倫隱球酵母懸浮液、粘紅酵母懸浮液、紅冬孢酵母懸浮液和水組成，每IL保鮮劑中含有 IXlO10 IXlO11個(gè)羅倫隱球酵母細(xì)胞、IXlOici IXlO11個(gè)粘紅酵母細(xì)胞、IXlOici IXio12個(gè)紅冬孢酵母細(xì)胞1，其余為水；所述羅倫隱球酵母為保藏號為CGMCC NO. 3590的羅倫隱球酵母 Cryptococcuslaurentii ZJU 10 ；所述紅冬孢酵母是保藏號為IMI 394084的海洋酵母Iihodosporidium paludigenum Fell&TalIman ；所述粘紅酵母參椐的生物材料為ZJU 11，分類命名為粘紅酵母Iihodotorula glutinis，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2010年1月20日，保藏號CGMCC NO 3589。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于三種生防酵母拮抗活性的柑橘生物防腐保鮮劑，該保鮮劑由羅倫隱球酵母懸浮液、粘紅酵母懸浮液、紅冬孢酵母懸浮液和水組成，每1L保鮮劑中含有1×1010~1×1011個(gè)羅倫隱球酵母細(xì)胞、1×1010~1×1011個(gè)粘紅酵母細(xì)胞、1×1010~1×1012個(gè)紅冬孢酵母細(xì)胞1，其余為水；羅倫隱球酵母的保藏號為CGMCC NO.3590，紅冬孢酵母的保藏號為IMI394084，粘紅酵母為保藏號為CGMCC NO.3589。該生物防腐保鮮劑，能在不使用化學(xué)殺菌劑的前提下有效控制柑橘果實(shí)的采后病害。
文檔編號A23B7/155GK102224842SQ201110111499
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月2日
發(fā)明者余挺, 努爾哈音, 盧黃娉, 朱瑞瑜, 路來風(fēng), 鄭曉冬, 郭峻 申請人:浙江大學(xué)