專利名稱：一種選育聚合水稻紋枯病抗性育種材料的方法
一種選育聚合水稻紋枯病抗性育種材料的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)作物新品種新材料選育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗水稻紋枯病育種材料的選育方法。
背景技術(shù)：
由立枯絲核菌(lihizoctonia solani kuhn)引起的紋枯病是水稻重要的真菌病害之一，產(chǎn)量損失為10%-30%，嚴重時可達50%以上。大量使用化學(xué)藥劑防治病害不僅容易造成環(huán)境污染，而且由于病原菌的抗藥性增強導(dǎo)致防治費用逐年上升。利用生物拮抗菌防治水稻紋枯病能夠彌補化學(xué)藥劑的不足，但防治時期等問題還有待于進一步研究，因此培育和種植抗病品種防治水稻紋枯病最經(jīng)濟有效的方法之一。
20世紀70年代以來，國內(nèi)外研究者對數(shù)千份水稻種質(zhì)資源進行紋枯病抗性評價， 發(fā)現(xiàn)水稻品種對紋枯病的抗性存在明顯差異，但未發(fā)現(xiàn)免疫品種(陳宗祥等，2000，對水稻紋枯病抗源的初步研究，中國水稻科學(xué)，14(1) 15 18)。已鑒定出的水稻抗源對紋枯病菌大多呈部分抗性，表現(xiàn)為數(shù)量性狀的遺傳方式，受多個數(shù)量性狀位點。傳統(tǒng)育種中選擇是根據(jù)植株的表型性狀進行的，對于單基因遺傳的選擇非常有效，但面對復(fù)雜的數(shù)量性狀時這種選擇往往收效甚微。因此，與水稻白葉枯病等病原菌與寄主抗病基因存在典型?；曰プ鞯奈：乐氐乃静『ο啾?，迄今，水稻對紋枯病的抗性改良一直未取得有效的進展。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者相繼開展了水稻抗紋枯病數(shù)量位點 (Quantitative trait loci, QTL)定位研究，目前，在水稻12條染色體上均定位到控制紋枯病的 QTL(Li ZK 等，1995, Characterization of quantitative trait loci (QTLs) in cultivated rice contributing to field resistance to sheath blight(Rhizoctonia solani)，Theor Appl Genet, 91 :374 381 ；韓月澎等，2202，雜交水稻親本明恢63對紋枯病水平抗性的QTL定位，遺傳學(xué)報，29 (7) 565 570)。但是，進一步表明水稻抗紋枯病單個位點提高抗性的效應(yīng)較小，并且具有顯著的背景依賴性，即使在相同的環(huán)境條件下，在一個水稻遺傳背景中表達的多數(shù)抗紋枯病QTL在另一遺傳背景中往往不表達(謝學(xué)文等，2008， 水稻抗紋枯病QTL表達的遺傳背景及環(huán)境效應(yīng)，作物學(xué)報，34 (11) 1885 189 ，因此，雖然研究者從不同抗病品種中鑒定出了一些QTL，但是由于以往大多數(shù)基因/QTL定位通常與遺傳育種的實踐完全脫節(jié)，目前分子標記輔助選擇技術(shù)難以有效地改良水稻品種對紋枯病的抗性；另外，通過不同遺傳背景的抗性株系進行雜交的常規(guī)策略，也難以獲得抗病性進一步提高的抗紋枯病聚合系。
近年來，通過對回交群體進行目標性狀篩選發(fā)現(xiàn)，供體親本所攜帶的各種有利基因大多是以隱蔽的形式存在的，回交育種技術(shù)是發(fā)掘利用水稻原始基因庫中的隱蔽基因來改良抗旱性、耐冷性等復(fù)雜性狀的有效方法(Lafitte H R等，2006，Improvement of rice drought tolerance through backcross breeding !evaluation of donors and results from drought nurseries, Field Crop Res,97(1) :77-86)。對回交后代群體目標性狀的篩選不必拘泥于供體親本本身在性狀上的表現(xiàn)，回交群體通過嚴格的脅迫和表型選擇均能得到目標性狀改良的株系。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過構(gòu)建和聚合遺傳背景相近的抗病選擇導(dǎo)入系來提高水稻紋枯病抗性的方法。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
(I)BC2F2導(dǎo)入系群體的構(gòu)建和抗紋枯病導(dǎo)入系篩選。
以生產(chǎn)上應(yīng)用的水稻品種或雜交稻親本為輪回親本，以地方品種或其它水稻品種為供體親本，雜交1次，回交2次，在回交過程中隨機選擇20 25單株與輪回親本回交，直到獲得BC2,然后所有回交F1家系自交一代，將來自每個組合的BC2F2單株的自交種子混收， 形成每個雜交組合高代回交群體的混合集團，以便有足夠多的回交后代群體種子進行抗紋枯病性狀鑒定與篩選。從每個組合的BC2F2混合集團中取300 500粒種子，在分蘗盛期采用田間拋灑稻殼接種法進行紋枯病接種。接種后，待抽穗后30天左右病斑穩(wěn)定時進行病情調(diào)查，選擇20-40個發(fā)病程度顯著低于輪回親本的株系。
田間拋灑稻殼接種法具體方法是將稻谷與稻殼按3 1的比例混合后裝入三角瓶中滅菌，然后接種病原菌培養(yǎng)15到20天，待菌絲體布滿瓶基部而瓶上部有菌核長出時，再進行二級擴大培養(yǎng)，3天后將混合物撒施于稻谷基部或者水稻行系之間。
(2)導(dǎo)入系后代紋枯病抗性的跟蹤鑒定。
將獲得的20 40個BC2F3抗性株系每個株系種兩行，每行10株，行株距為 20cmX 15cm, 2次重復(fù)，在分蘗盛期采用牙簽嵌入法人工接種每行中間6株，進行紋枯病抗性鑒定，收獲BC2F4抗病株系。
牙簽嵌入法具體方法為10X1. 5X Imm的木質(zhì)短棒平鋪于培養(yǎng)皿底部，然后倒入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，121°C滅菌15分鐘，然后用打孔器將生長在固體培養(yǎng)基上的菌絲接種到滅菌過的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，待菌絲密集的長滿培養(yǎng)基時，就可進行田間接種。用鑷子將短棒嵌入倒三葉鞘內(nèi)側(cè)，并確保葉鞘包莖狀態(tài)不受影響，使植株呈自然發(fā)病狀態(tài)。
接種后，待抽穗后30天左右病斑穩(wěn)定時進行病情調(diào)查。計算相對病斑高度度量， 即絕對病斑高度與劍葉葉枕高度的比值。
(3)基因型分析與抗性QTL定位。
從水稻12條染色體上選擇均勻分布且親本間有多態(tài)的SSR標記對BC2F4回交群體進行基因型分析。參考Cornell大學(xué)的圖譜確定各標記在染色體上的位置及遺傳距離。 用SSR標記對抗紋枯病導(dǎo)入系進行基因型分析，根據(jù)遺傳搭車理論，對基因型分析結(jié)果進行卡方檢測，供體基因頻率與期望頻率有顯著差異的位點將被看作是與紋枯病抗性相關(guān)的位點，將P < 0. 005作為發(fā)現(xiàn)抗紋枯病QTL的閾值。
(4)抗病導(dǎo)入系農(nóng)藝形狀考察和抗病聚合系群體構(gòu)建。
將所獲得的BC2F4代選擇導(dǎo)入系種植于適于輪回親本生長的地區(qū)，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，單本插種植，種植密度為20cmX 15cm, 10株1行，每個株系種植4次重復(fù)，其中紋枯病接種和非接種試驗分別設(shè)置2次重復(fù)。淺水灌溉，施肥和病蟲害防治如同一般大田。
在植株分蘗盛期，采用牙簽嵌入法對每行中間6株接種紋枯病菌?？疾烀總€株系中間的6株，記載抽穗期。紋枯病病情穩(wěn)定后在田間進行病斑高、劍葉枕高和株高的測量。成熟時從中間6株中選擇長勢均勻一致且周圍不缺棵的三株用于考察產(chǎn)量相關(guān)性狀，包括單株有效穗、穗長、每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重，上述指標考察結(jié)束后將三株混合脫粒測定單株產(chǎn)量。
從每個組合分別選取優(yōu)良的抗病株系，相近遺傳背景內(nèi)兩兩配置雜交進行抗病 QTL的聚合。F1通過分子標記鑒定真假雜種，采用牙簽嵌入法接種F2聚合群體。
說明書附圖

圖IF2聚合群體的紋枯病相對病斑高度的頻率分布
圖 2BSB1/BSB2 群體中 Qsb6b (RM469)與 Qsbla(RM86)的分布
RP、Pl和P2分別代表輪回親本明恢86、聚合親本BSBl和BSB2，其中輪回親本帶型為A，不同的供體親本帶型為B，混合帶型為H。*表示為含有QsMb與Qsbla兩個位點的純合株系。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施實例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，下列實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護范圍。應(yīng)用實例中以明恢63為輪回親本，以孟關(guān)大麻谷和江西絲苗為供體親本，但本發(fā)明實際適用于本發(fā)明采用的親本以及其它水稻品種為親本構(gòu)成的群體。
(1)抗紋枯病優(yōu)良選擇導(dǎo)入系的篩選
以生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的雜交稻恢復(fù)系明恢86為輪回親本，以水稻品種江西絲苗和地方品種孟關(guān)大麻谷為供體親本，分別配制BC2F2混合群體。2005年春季在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院昌平育種基地種植兩個群體各400個BC2F2單株，在水稻分蘗末期，采用拋灑稻殼接種法進行抗性鑒定，紋枯病菌菌株為江蘇稻區(qū)的強致病菌株RH-9。從兩個群體中各篩選M個發(fā)病程度低于輪回親本的單株。2005年冬季將M個來自明恢86/江西絲苗和M個明恢86/孟關(guān)大麻谷群體的BC2F3株系種植在海南島隔離的田塊中，分別設(shè)置2個重復(fù)，每行10株，在分蘗末期采用牙簽嵌入法接種，選擇抗病株系，獲得BC2F4種子；2006年春季在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院昌平育種基地對BC2F4株系再次采用牙簽嵌入法接種鑒定，觀察株系抗病性的穩(wěn)定性。
2007年春季，將篩選到的BC2F5株系種植在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計單本插種植，每個株系種植4次重復(fù)，其中紋枯病接種和非接種試驗分別設(shè)置2次重復(fù)。采用牙簽嵌入法于植株分蘗盛期接種紋枯病菌，考察各株系中間的6株，記載抽穗期。紋枯病病情穩(wěn)定后在田間進行病斑高、劍葉枕高和株高的測量。成熟時從中間6株中選擇長勢均勻一致的三株用于考察產(chǎn)量相關(guān)性狀，包括單株有效穗、穗長、每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重，上述指標考察結(jié)束后將三株混合脫粒測定單株產(chǎn)量。
明恢86平均相對病斑高度為0. 63，江西絲苗和孟關(guān)大麻谷的平均相對病斑高度分別為0. 46和0. 47。為了便于對選擇有效性進行描述，根據(jù)導(dǎo)入系在接種和正常生長條件下下與輪回親本相比較的紋枯病抗性和相對產(chǎn)量表現(xiàn)，將導(dǎo)入系分為4個類型。
Tl類型代表紋枯病抗性較輪回親本有顯著提高，在人工接種紋枯病菌和正常種植兩種條件或其中一種條件下與輪回親本比較產(chǎn)量有顯著提高。2個群體中有2個株系屬于這一類型，人工接種紋枯病菌條件下平均相對病斑高度比明恢86降低0. 20，產(chǎn)量增加 4. 3t/ha,正常種植條件下平均產(chǎn)量比明恢86增加2. 7t/ha。
表1以明恢86為輪回親本的2個導(dǎo)入系群體的主要農(nóng)藝性狀相對于明恢86在人工接種紋枯病菌和正常種植兩種條件下的表現(xiàn)
供體親本類型株系處理相對病斑抽穗期株1 單株有每穗實每穗總結(jié)實率千粒重每公頃產(chǎn)數(shù)高度(天)(cm)效穗粒數(shù)粒數(shù)(%)fe)量(t/ha)JXSMTl1S-0.19-3.57.0"*1.556.2*43.119.0*5.54.26*(24)N-2.57.80.349.338.116.51.63.61"T22S-0.060.54.6*0.922.0*161*9.5-0.1-0.16N0.54.7-0.614.83.68.8-0.80.19T34S0.01-16.6"2.535.1*11.8*22.02.83.10*N-2.24.1-1.024.45.417.11.21.00T416S-0.06-0.96.7*1.422.817.57.9-0.30.40N-1.58.9-0.121.413.69.6-0.41.18T51S-0.05-4.5*-0.30.519.51.513.5-2.0-0.96N-3.5*-6.3-0.8-12.77.9-12.3-1.5-1.94'MGDMGTl1S-0.212.58.62.899.7*94.7*20.61.24.44(24)N2.53.82.273.267.117.22.31.74T27S-0.153.5*3.50.920.440.8-1.9-1.5-0.86N2.1*9.3-0.923.546.4-2.7-1.2'0.44T33S-0.07-3.2*4.61.742.159.410.00.71.87*N-3.2*2.8-0.838.934.510.00.32.11T413S-0.070.05.0*0.234.452.8"3.0-1.2-0.34N1.03.6-1.734.741.56.7-2.0*0.10Minghui86S0.55110.5122.47.1149.4197.975.326.46.6N107.0125.77.5143.7179.579.627.810.6
S代表人工接種紋枯病菌，N代表正常生長條件，JXSM代表江西絲苗，MGDMG代表孟關(guān)大麻谷，Minghui86代表明恢86。*，**和***分別代表t測驗中P < 0.05, P < 0. 01和 P < 0. 001的顯著水平。
T2類型代表紋枯病抗性較輪回親本有顯著提高，但在人工接種紋枯病菌和正常種植兩種條件下與輪回親本比較產(chǎn)量無顯著差別。2個群體中有9個株系屬于這一類型，人工接種紋枯病菌條件下平均相對病斑高度比明恢86降低0. 10。
T3類型代表紋枯病抗性與輪回親本無顯著差別，但在人工接種紋枯病菌和正常種植兩種條件或其中一種條件下產(chǎn)量顯著高于輪回親本。2個群體中有7個株系屬于這一類型，人工接種紋枯病菌和正常種植兩種條件下平均產(chǎn)量分別比明恢86增加2. 5t/ha和 1. 5t/ha0
T4類型代表紋枯病抗性與輪回親本無顯著差別，且產(chǎn)量在人工接種紋枯病菌和正常種植兩種條件下與輪回親本相比均無顯著差別。2個群體中有四個株系屬于這一類型。
或其中一種條件下產(chǎn)量顯著低于輪回親本，這樣的株系所占比例很小。2個群體中有1個株系屬于這一類型。
從水稻12條染色體上選擇均勻分布且親本間有多態(tài)的SSR標記對BC2F4回交群體進行基因型分析。參考Cornell大學(xué)的圖譜確定各標記在染色體上的位置及遺傳距離。用 SSR標記對抗紋枯病導(dǎo)入系進行基因型分析，根據(jù)遺傳搭車理論，對基因型分析結(jié)果進行卡方檢測，將P < 0. 005作為發(fā)現(xiàn)抗紋枯病QTL的閾值。在533個SSR標記中，明恢86與江西絲苗、孟關(guān)大麻谷的組合中分別有60和52個標記呈現(xiàn)較好的多態(tài)性，采用這些標記對導(dǎo)入系群體進行基因型分析。
BC2F2代隨機群體雜合基因型和供體親本純合基因型頻率的理論預(yù)期分別為0. 125和0. 0625，供體基因?qū)腩l率的理論預(yù)期為0. 125。本研究中的6個選擇導(dǎo)入系群體供體親本純合基因型頻率平均值分別為0. 13和0. 17，雜合基因型頻率的平均值分別為 0. 05和0. 04，明顯偏離了理論預(yù)期。供體基因?qū)腩l率的平均值分別為0. 15和0. 19同樣偏離了理論預(yù)期，表明選擇效果明顯，符合選擇群體的特征。
設(shè)置檢測閾值為0. 005，對選擇群體標記基因型頻率進行了卡方檢測。所選用2 個群體共檢測到選擇后導(dǎo)入頻率顯著變化的位點15個，根據(jù)遺傳搭車理論，這些位點可能就是與水稻紋枯病抗性相關(guān)的QTL位點。Minghui86/JXSM群體檢測到8個，分別為Qsbla、 Qsblb、Qsb2a, Qsb2b, Qsb3a、Qsb6a、Qsb7a 和 Qsb8 ；明恢 86/ 孟關(guān)大麻谷群體檢測到 7 個， 分別為 Qsblc、Qsb2c、Qsb6c、Qsb6a、Qsb7c、Qsb7b 禾口 QsblO0
明恢 86/江西絲苗群體中 5 個 QTLsJP Qsbla、Qsblb，Qsb2a、Qsb3a 和 Qsb7a 對相對病斑高度表現(xiàn)了負向加性效應(yīng)，其余QTLs均表現(xiàn)出對相對病斑高度的正向加性效應(yīng)；明恢86/孟關(guān)大麻群體中3個QTLs，即QSl32C、Qsb7c、和Qsb 10，對相對病斑高度表現(xiàn)了負向加性效應(yīng)，其余QTLs均表現(xiàn)出對相對病斑高度的正向加性效應(yīng)(表2)。
表2在水稻Minghui86/TQ和Minghui86/孟關(guān)大麻谷導(dǎo)入系中檢測到的抗紋枯病 QTL
權(quán)利要求
1.一種抗紋枯病水稻育種材料的選育方法。其特征在于以生產(chǎn)上應(yīng)用的品種輪回親本，以地方品種或其它栽培品種為供體親本，雜交1次回交2次再自交2次獲得混合群體， 采用田間拋灑稻殼法篩選紋枯病發(fā)病程度低于輪回親本的單株，再采用牙簽嵌入法連續(xù)接種兩代。利用卡方檢測定位抗紋枯病位點，選擇抗性穩(wěn)定、遺傳背景相近的BC2F6優(yōu)良株系進行雜交，通過分子標記選擇和人工接種從F2群體中篩選抗病聚合系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗紋枯病水稻育種材料的選育方法，其特征在于上述方法中所涉及的利用遺傳背景相近的抗紋枯病選擇導(dǎo)入系進行抗性聚合的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗水稻紋枯病育種材料的選育方法。以生產(chǎn)上應(yīng)用的品種輪回親本，以地方品種或其它栽培品種為供體親本，雜交1次回交2次再自交2次獲得混合群體。采用田間拋灑稻殼法和牙簽嵌入法相結(jié)合，連續(xù)三代人工接種，從混合群體中選擇紋枯病發(fā)病程度顯著低于輪回親本的單株，利用卡方檢測檢測抗紋枯病位點，選擇BC2F6優(yōu)良抗病株系進行雜交，通過分子標記選擇和人工接種篩選抗病的聚合系。本發(fā)明能有效地將目標性狀的QTL定位與品種改良整合起來，通過聚合遺傳背景相近的抗病選擇導(dǎo)入系可以克服抗紋枯病QTL的遺傳背景效應(yīng)，提高水稻品系的抗病水平。
文檔編號A01H1/04GK102511385SQ20111043184
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者周永力, 高用明, 黎志康 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所