專利名稱：一種水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，尤其涉及在環(huán)境可控 條件下，通過(guò)在苗期對(duì)水稻品種或品系的抗性鑒定，快速有效的篩選水稻紋 枯病抗源，提高水稻抗紋枯病育種的效率。本發(fā)明屬于植物病害防治技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
水稻紋枯病(Rice Sheath Blight)，俗稱"花腳病"，是由絲核菌 Rhizoctoniasolani所引起的一種世界性水稻病害，也是目前水稻生產(chǎn)危害 最嚴(yán)重的病害(王法明，1988;陳志誼，1994;檀根甲，2000)。尤以密植矮 稈雜交稻的高產(chǎn)田發(fā)生最為普遍而嚴(yán)重，致葉片枯死，結(jié)實(shí)率降低，千粒重 減輕， 一般造成損失10 20%，甚者可達(dá)50%以上。該病已在南方造成了嚴(yán)重 的經(jīng)濟(jì)損失，并且北方稻區(qū)紋枯病發(fā)生也逐漸加重。該病最先由Miyake (宮 宅)于1910年在日本發(fā)現(xiàn)，隨后Reinking (1918)和Palo (1926)在菲律 賓、Park和Bertus (1932)在斯里蘭卡相繼報(bào)道了此病，水稻紋枯病在我國(guó) 發(fā)生為害的報(bào)道最早見(jiàn)于著名植物病理學(xué)家魏景超教授(Wei J C[12]) 1934 年的研究。該病在我國(guó)發(fā)生發(fā)展很快，70年代以前，該病在我國(guó)僅為零星發(fā) 生至平緩擴(kuò)展；70年以后則迅速蔓延，在1975年被列為全國(guó)防治對(duì)象，并 于80年代在水稻種植區(qū)大面積暴發(fā)，發(fā)展成為我國(guó)水稻生產(chǎn)上的一種主要病 害；90年代以后，該病的發(fā)生為害更為猖獗，南方稻區(qū)的發(fā)病面積比例普遍 超過(guò)50%以上(廖皓年，1997)。據(jù)報(bào)道，1982年水稻紋枯病在全國(guó)的發(fā)病面 積約為O. l億公頃，損失稻谷約為35億公斤；1995年發(fā)病面積己擴(kuò)大到近 0. 16億公頃，損失稻谷超過(guò)110億公斤(彭紹裘，1997;任春梅，2000)。 近年來(lái)，在我國(guó)南方大多數(shù)水稻種植區(qū)，紋枯病己經(jīng)成為最重要的水稻病害， 無(wú)論是發(fā)生面積或造成的為害損失總量均居各病害之首，成為制約水稻生產(chǎn) 的嚴(yán)重障礙。發(fā)掘抗性穩(wěn)定的優(yōu)異種質(zhì)資源是開(kāi)展抗紋枯病育種的是解決水稻紋枯病 危害最有效、經(jīng)濟(jì)的途徑之一，篩選水稻抗紋枯病資源是開(kāi)展這一工作的前 提。而簡(jiǎn)單有效的水稻紋枯病抗性鑒定技術(shù)體系的建立是進(jìn)行紋枯病抗病育 種和分子遺傳研究的關(guān)鍵。由于水稻紋枯病是一種土傳真菌病害，病原菌寄 主廣泛，容易受到環(huán)境影響。目前，對(duì)水稻紋枯病抗性鑒定主要在成株期進(jìn) 行人工接種鑒定。人工接種的方法主要有牙簽接種法、撒施法。 一般認(rèn)為嵌 入法接種使品種間發(fā)病均勻且充分，并能較好地鑒別品種間抗感差異；撒施
法接種品種內(nèi)株間發(fā)病差異較大(潘學(xué)彪，1997)。但目前成株期水稻紋枯病
抗性鑒定尚難排除環(huán)境因素影響，且評(píng)價(jià)系統(tǒng)不穩(wěn)定，鑒定時(shí)間周期長(zhǎng)、工 作量大等問(wèn)題。水稻紋枯病抗性的苗期鑒定目前應(yīng)用不多，且結(jié)論不一。因 此，迫切需要相應(yīng)的開(kāi)發(fā)、建立一套簡(jiǎn)便、合理、有效的水稻紋枯病抗性苗 期鑒定技術(shù)體系，在環(huán)境可控條件下，用不同致病力及遺傳多樣性的混合菌 株，合適的接種方法、合理的病情評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)研究品種的抗性差異，為快速高 效的水稻紋枯病抗病育種奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)水稻紋枯病抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)體系缺乏，易受環(huán)境影響， 鑒定時(shí)間長(zhǎng)、工作量大，提供一種新的水稻紋枯病抗性苗期鑒定的體系。
本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) 一種水稻紋枯病抗性苗期鑒定的 方法，包括以下步驟
(1) 菌種準(zhǔn)備將水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)用PDA培養(yǎng) 基活化培養(yǎng)2-5天，獲得菌絲；
(2) 接種體的準(zhǔn)備在步驟(1)活化培養(yǎng)后的菌落邊緣，劃取lmmX 1腿菌絲塊接種至裝有PDB培養(yǎng)基的燒瓶中，黑暗、28°C， 130-140 rpm振蕩 培養(yǎng)7-10天至產(chǎn)生菌絲球；接種前將菌絲球用40目雙層尼龍網(wǎng)過(guò)濾并用無(wú) 菌水沖洗2次后，待用；
(3) 將待鑒定的水稻品種或品系的種子在培養(yǎng)皿中于濕潤(rùn)濾紙上、30 'C下催芽后播種于育秧盤(pán)中，每品種均勻播種1行，每行15株苗，每盤(pán)10 行；每品種播3次重復(fù)；播種后育秧盤(pán)放置水槽中，水槽中保水深度為2cm， 根據(jù)溫度，溫室或露天放置，待苗長(zhǎng)至3-4葉期，待用；(4) 接種將步驟(2)過(guò)濾后的菌絲球用鑷子夾取放置于2cmX2cm 的錫箔紙上，貼包至步驟(3)獲得的水稻苗近基部，使菌絲球與稻莖接觸，每行選擇10株接種；接種后秧盤(pán)移至水槽內(nèi)，并罩上透明密閉的聚酯玻璃箱內(nèi)保濕度大于80%，環(huán)境溫度28t:;待病斑擴(kuò)展至錫箔紙外時(shí)，將錫箔紙及 菌絲球取下；幼苗正常生長(zhǎng)管理；(5) 在接種7-10天后或感病對(duì)照品種Loment發(fā)病至9級(jí)，對(duì)苗期單株 水稻材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定；(6) 根據(jù)病害評(píng)價(jià)等級(jí)計(jì)算病情指數(shù)，確定水稻品種或品系苗期紋枯病 的抗性。將待鑒定的水稻品種或品系的種子按步驟(3) (6)至少再進(jìn)行l(wèi)次 重復(fù)鑒定，將分次鑒定的病情指數(shù)的平均值作為該水稻品種或品系的最終鑒 定的病情指數(shù)。步驟(l)中將水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)用PDA培養(yǎng)基活化 培養(yǎng)3天。步驟(2)中菌絲塊接種至裝有PDB培養(yǎng)基，是每毫升PDB培養(yǎng)基接種一塊 菌絲塊，PDB培養(yǎng)基體積為燒瓶總體積的1/3-1/2。步驟(2)中的接種是取50-100個(gè)菌絲塊至裝有150mlPDB培養(yǎng)基的250ml 燒瓶中。步驟(3)中的育秧盤(pán)是56cmX21cmX4cm的育秧盤(pán)。 步驟(3)中在環(huán)境溫度小于2(TC時(shí)溫室放置，在環(huán)境溫度高于20。C時(shí)露 天放置。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用同一水稻紋枯病菌菌株，消除病原菌致病性差 異；在環(huán)境可控條件下，通過(guò)在苗期對(duì)水稻品種或品系進(jìn)行抗性鑒定，可快 速篩選水稻抗紋枯病抗源，提供水稻資源利用效率；本方法周期相對(duì)較短， 工作量小。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但這并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成 任何意義上的限定。6實(shí)施例1:
水稻紋枯病病原菌水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani融合群為AG-1 IA)菌株購(gòu)于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，菌株的編號(hào)為 TTZF-1(下同)。
將菌株TTZF-1在超凈工作臺(tái)上接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28°C、黑暗活 化培養(yǎng)3d后待用。
從活化培養(yǎng)后的水稻紋枯病菌菌落邊緣用解剖刀劃取50-100個(gè)lmmX lmm菌絲塊，接種至裝有150mlPDB培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，130-140rpm， 28 。C下振蕩培養(yǎng)7-10d，形成大小均一的菌絲球，用40目雙層尼龍網(wǎng)過(guò)濾后并 用無(wú)菌水沖洗2次，備用。
實(shí)施例2:
被鑒定品種Jasmine 85，由中國(guó)水稻研究所國(guó)家水稻種質(zhì)資源中期庫(kù) 免費(fèi)提供或購(gòu)買(mǎi)。
菌絲球通過(guò)實(shí)施例l獲得。
將水稻Jasmine 85和感病對(duì)照Lemont的種子在培養(yǎng)皿中于3CTC下催芽 2d后，選出芽好的種子播于裝有育秧土的育秧盤(pán)中(56cmX21cmX4cm)，每 品種均勻播種l行，兩品種隔行播種，每行15株苗；每盤(pán)10行。播種3盤(pán)。 播種后育秧盤(pán)放置水槽中，水槽中保水深度為2cm。根據(jù)不同季節(jié)，溫室或 露天放置，待苗長(zhǎng)至3-4葉期，待用。
播種后18d左右，用消毒鑷子夾取菌絲球放置于2cmX2cm的錫箔紙上， 貼包至水稻苗近基部(距土表lcm左右)，使菌絲球與稻莖接觸，每行選擇 10株接種。接種后秧盤(pán)移至水槽內(nèi)，并罩上透明密閉的聚酯玻璃箱內(nèi)保濕 (RH>80%)，環(huán)境溫度保持在28°C。待病斑擴(kuò)展至錫箔紙外時(shí)，將錫箔紙及 菌絲球取下。幼苗正常生長(zhǎng)管理。如陽(yáng)光太強(qiáng)，適當(dāng)遮陽(yáng)。如箱體上水汽太 多，影響透光可適當(dāng)敲擊箱體，使水珠流走。
在接種7-10天后或感病對(duì)照品種Loment發(fā)病至9級(jí)，對(duì)苗期單株水稻 材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定；鑒定等級(jí)參見(jiàn)表2。
表2水稻紋枯病病情分級(jí)病情級(jí)數(shù) 病征
0無(wú)發(fā)病癥狀
1病斑長(zhǎng)度與株高比值X100。/。《10%
310%<病斑長(zhǎng)度與株高比值乂100%《30%
530%〈病斑長(zhǎng)度與株高比值xiooy?！?0%
750%<病斑長(zhǎng)度與株高比值X10(Fo《70%
9病斑長(zhǎng)度與株高比值X100% 〉70o/o
根據(jù)病情指數(shù)的公式
0 X X0+1 X Xl+3 X X3+5 X X5+7 X X7+9 X X9
病情指數(shù)二 -^-^- X 100%
(X0+X1+X3+X5+X7+X9) X9
式中0、 1、 3、 5、 7、 9分別表示相應(yīng)的病害等級(jí)；
XO、 XI、 X3、 X5、 X7、 X9分別表示病害評(píng)價(jià)等級(jí)的水稻株數(shù)。
計(jì)算獲得水稻Jasmine 85的病情指數(shù)為18.4%。依據(jù)病情指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)
(表l)，鑒定Jasmine 85苗期對(duì)水稻紋枯病抗性為抗(R)。
表1水稻紋枯病抗性類型劃分
抗性類型 病情指數(shù)
免疫a)無(wú)發(fā)病癥狀
抗病(R)病情指數(shù)《20%
中抗(MR)20. 01%〈病情指數(shù)《40%
中感(MS)40. 01%<病情指數(shù)《60%
感病(s)60. 01%〈病情指數(shù)《80%
高感(HS)80. 01%<病情指數(shù)《100%重復(fù)上述過(guò)程(實(shí)施例2)，進(jìn)行第二次鑒定，獲得水稻Jasmine 85的 病情指數(shù)為23. 1%，依據(jù)病情指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)，病情指數(shù)為中抗(MR)。
將2次鑒定的病情指數(shù)平均，獲得水稻Jasmine 85的病情指數(shù)為20. 75%， 屬于中抗(MR)。
實(shí)施例3
利用實(shí)施例1獲得的菌絲球，采用與實(shí)施例2相同的鑒定方法，對(duì)02428、 Maybelle、白葉秋、大葉谷、特青、Jasmine 85和Lemont 7個(gè)不同水稻品 種(含秈、粳不同亞種)進(jìn)行水稻紋枯病抗性苗期鑒定，鑒定結(jié)果記載于表 3中。所有品種均由中國(guó)水稻研究所國(guó)家水稻種質(zhì)資源中期庫(kù)免費(fèi)提供或購(gòu) 買(mǎi)。
表3 7個(gè)水稻品種苗期紋枯病抗性鑒定結(jié)果
品種名稱鑒定l 病情指數(shù)(%)鑒定2 病情指數(shù)(%)平均病情指數(shù)(%)苗期抗性類型
02428 (粳)71. 775. 473. 55S
Maybelle(粳)70. 268.569. 35S
白葉秋(秈) Baiyeqiu20. 725.523. 1MR
大葉谷(秈) Dayegu83. 585.884. 65HS
特青(秈) Teqing51. 256. 453.8MS
Jasmine 85 (粳) 23. 122. 522. 8MR
Lemont (粳)90. 092. 491.2HS
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能 從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為 本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于包括以下步驟(1)菌種準(zhǔn)備將水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)用PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2-5天，獲得菌絲；(2)接種體的準(zhǔn)備在步驟(1)活化培養(yǎng)后的菌落邊緣，劃取1mm×1mm菌絲塊接種至裝有PDB培養(yǎng)基的燒瓶中，黑暗、28℃，130-140rpm振蕩培養(yǎng)7-10天至產(chǎn)生菌絲球；接種菌絲球前將菌絲球用40目雙層尼龍網(wǎng)過(guò)濾并用無(wú)菌水沖洗2次后，待用；(3)將待鑒定的水稻品種或品系的種子在培養(yǎng)皿中于濕潤(rùn)濾紙上、30℃下催芽后播種于育秧盤(pán)中，每品種均勻播種1行，每行15株苗，每盤(pán)10行；每品種播3次重復(fù)；播種后育秧盤(pán)放置水槽中，水槽中保水深度為2cm，根據(jù)溫度，溫室或露天放置，待苗長(zhǎng)至3-4葉期，待用；(4)接種將步驟(2)過(guò)濾后的菌絲球用鑷子夾取放置于2cm×2cm的錫箔紙上，貼包至步驟(3)獲得的水稻苗近基部，使菌絲球與稻莖接觸，每行選擇10株接種；接種后秧盤(pán)移至水槽內(nèi)，并罩上透明密閉的聚酯玻璃箱內(nèi)保濕度大于80％，環(huán)境溫度28℃；待病斑擴(kuò)展至錫箔紙外時(shí)，將錫箔紙及菌絲球取下；幼苗正常生長(zhǎng)管理；(5)在接種7-10天后或感病對(duì)照品種Loment發(fā)病至9級(jí)，對(duì)苗期單株水稻材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定；(6)根據(jù)病害評(píng)價(jià)等級(jí)計(jì)算病情指數(shù)，確定水稻品種或品系苗期紋枯病的抗性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征 在于將待鑒定的水稻品種或品系的種子按步驟(3) (6)至少再進(jìn)行 1次重復(fù)鑒定，將分次鑒定的病情指數(shù)的平均值作為該水稻品種或品系的 最終鑒定的病情指數(shù)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征 在于步驟(l)中將水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)用PDA培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)3天。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征 在于步驟(2)中菌絲塊接種至裝有PDB培養(yǎng)基，是每毫升PDB培養(yǎng)基接 種一塊菌絲塊，PDB培養(yǎng)基體積為燒瓶總體積的1/3-1/2。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征在于步驟(2)中的接種是取50-100個(gè)菌絲塊至裝有150mlPDB培養(yǎng)基的 250ml燒瓶中。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征 在于步驟(3)中的育秧盤(pán)是56cmX21cmX4cm的育秧盤(pán)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，其特征 在于步驟(3)中在環(huán)境溫度小于2(TC時(shí)溫室放置，在環(huán)境溫度高于20"C -35"C時(shí)露天放置。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻紋枯病抗性苗期鑒定的方法，包括以下步驟(1)將水稻紋枯病菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)得菌絲；(2)取菌絲塊接種至PDB培養(yǎng)基至產(chǎn)生菌絲球；過(guò)濾并沖洗2次；(3)將待鑒定的種子催芽后播種，苗長(zhǎng)至3-4葉期；(4)將菌絲球放置于錫箔紙上，貼包至步驟(3)獲得的水稻苗近基部；待病斑擴(kuò)展至錫箔紙外時(shí)，將錫箔紙及菌絲球取下；(5)在接種7-10天后或感病對(duì)照品種Loment發(fā)病至9級(jí)，對(duì)苗期單株水稻材料進(jìn)行紋枯病病害等級(jí)鑒定；(6)根據(jù)病害評(píng)價(jià)等級(jí)計(jì)算病情指數(shù)，確定水稻品種或品系苗期紋枯病的抗性。本發(fā)明的方法可快速篩選水稻抗紋枯病抗源，提供水稻資源利用效率；本方法周期相對(duì)較短，工作量小。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101671721SQ20091015351
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者華 姜, 孫國(guó)昌, 震 張, 杜新法, 柴榮耀, 毛雪琴, 王教瑜, 王艷麗, 邱海萍 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院