專利名稱：部分接種鑒定煙草病毒病抗性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及煙草的育種、栽培，具體來說，涉及鑒定煙草病毒病抗性的方法。
背景技術：
煙草上發(fā)生的主要病毒病包括煙草普通花葉病毒(TMV)病、黃瓜花葉病毒(CMV) 病、馬鈴薯Y病毒(PVY)病等。煙草品種病毒病抗性田間鑒定，是不一種不可替代的抗病性鑒定方法，田間鑒定是煙草品種在自然環(huán)境下多種因素綜合作用的抗病性表現(xiàn)，是最直接、 最真實的抗病性反映。但煙草品種病毒病抗性田間鑒定存在發(fā)病率難于控制的問題，煙草品種病毒病抗性田間鑒定通常采用自然發(fā)病法、或人工接種病毒法。自然發(fā)病法經(jīng)常出現(xiàn)發(fā)病率很低的情況；而人工接種法則會出現(xiàn)全部煙草發(fā)病的情況。這兩種情況會導致抗病品種與感品種都不發(fā)病或都發(fā)病，這樣就難以準確區(qū)分不同品種間的抗病性差異。中國專利數(shù)據(jù)庫中涉及煙草抗性鑒定的技術方案有200610048657. 0號《一種煙草普通花葉病抗性的苗期鑒定方法》、200610048658. 5號《一種煙草黑脛病抗性的苗期鑒定方法》、200910094173. 3號《一種煙草黑脛病抗性的病圃鑒定方法》、200910094174. 8號《一種煙草青枯病抗性的苗期鑒定方法》、200910041164. 8號《一種煙草普通花葉病抗性的離體快速鑒定方法》和201010280169. 9號《一種煙草黑脛病抗性的苗期恒溫水培鑒定方法》等， 但迄今為止，未見針對可有效控制田間發(fā)病率、多種煙草病毒病抗性田間鑒定的方法專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供部分接種鑒定煙草病毒病抗性的方法，以控制煙草的田間發(fā)病率，解決鑒定煙草品種對病毒病抗性的難題。本發(fā)明提供的部分接種鑒定煙草病毒病抗性的方法，是在田間進行的，具體做法是(1)擇地選擇相對較平整、均勻的地塊，該地塊滿足以下條件排灌方便，與周圍環(huán)境有隔離措施，周圍50m內(nèi)不種植煙草以外的其它茄科作物；(2)種植煙草每個品種每重復種植10株，單行區(qū)排列；隨機區(qū)組，設4個重復；四周設雙行保護行；(3)接種在移栽后的 10 15天，選擇氣溫20°C 30°C、無雨的下午對各個小區(qū)的每個品種進行部分人工接種， 每個品種均按鑒定株數(shù)的30%接種(即對田間每行的第2、5、8、株進行人工接種)，注意避免葉面潮濕；(4)鑒定根據(jù)調(diào)查記載、病情指數(shù)計算，按相應煙草病害調(diào)查、煙草品種抗病性鑒定的行業(yè)標準劃分煙草品種的抗性等級。發(fā)明人指出接種時間如遇煙草生長緩慢或無適宜天氣等問題，可適當推后。上述第3步中，具體的接種方法是將已鑒定、純化的煙草病葉(TMV、CMV、PVY)進行仔細研磨，用雙層沙布濾除殘渣，最終濃度以病葉質(zhì)量與水的體積之比計為1 20;在病毒液中直接加入質(zhì)量分數(shù)為2%經(jīng)滅菌的600目金剛砂混勻，作為接種時創(chuàng)造微傷口的介質(zhì)；采用人工摩擦接種法，每株待接種煙株接種3cm以上兩片新生葉；接種時，用手托起葉背，用已滅菌砂布蘸已制備的病毒汁液，在葉正面由內(nèi)側向外輕輕摩擦接種。本方法的“部分接種”即是需鑒定抗病性的煙草在田間對部分煙株進行接種。例如一個品種田間種植10株，只對30 %的煙草進行接種，即人工接種病毒3株煙，其余7株不接種，由其自然發(fā)病。接種的3株煙的作用，一是觀察接種煙株是否對接種病毒有抗病性； 二是使其成為田間自然傳染源，觀察其它未接種煙株的抗病性。對需接種煙草的確定，是以這3株煙能成為另外7株煙均等傳染源為原則。即接種煙草較為均勻的分布在未 接種煙草的中間(以距離計算)。以10株一行為列，通常接種第2、5、8株煙。各品種間接種方法、接種煙株保持一致，各品種間有可比性即可。發(fā)明人指出病毒接種即是采用人工手段使病毒進入煙草活細胞內(nèi)，并在煙草細胞內(nèi)開始繁殖，致使煙草發(fā)病的過程。其關鍵在于使病毒進入“活細胞”。這需要在煙草表皮細胞上制造出一點“微傷口 ”這些傷口應該是肉眼看不到的，是在活細胞上的傷口，這樣的微傷口才能讓病毒進入細胞，而細胞也不會死亡，這樣才能接種成功。如無傷口則病毒無法侵入、而傷口過大則會使細胞死亡，病毒無法繁殖，這兩種情況都會導致接種失敗。600 目金剛砂是一種極細的無化學作用的顆粒，病毒汁液混入金剛砂后，通過手的摩擦，金剛砂可劃破煙草表皮細胞，造成微傷口，使病毒進入活細胞。傳統(tǒng)方法是采用400 500目金剛砂，先用金剛砂摩擦葉片劃出傷口，再用病毒汁液涂摸接種。600目金剛砂混入病毒汁液一次接種比傳統(tǒng)方法減少步驟，并因顆粒細度的提高而使接種效果明顯提高。本發(fā)明采用部分接種的方法鑒定煙草病毒病抗病性，可有效控制田間發(fā)病率在 30% 80%之間，各品種對病毒病抗病、感病特征表現(xiàn)明顯，顯著提高病毒病田間鑒定準確性。有效解決了傳統(tǒng)田間鑒定自然發(fā)病或全部接種時，田間發(fā)病率過高過低的問題。使用 1 20的煙草病毒汁液，混入600目金剛砂接種，可提高病毒接種成功率及接種效率。
具體實施例方式實施例2009年貴州省烤煙品種區(qū)域試驗馬鈴薯Y病毒(PVY)抗性鑒定，需鑒定煙草品系 14份，對照品種2份，計16個品種(系)。田間試驗地在海拔IOOOm的貴州省煙科所福泉實驗基地進行。田間試驗設4重復， 隨機排列，每小區(qū)每品種10株。試驗地5月20日移栽，除不采摘煙葉外其余管理按田間生產(chǎn)規(guī)范進行。田間鑒定于移栽后18天，對各個小區(qū)的每個品種(系)的第2、5、8三株煙草進行病毒汁液人工摩擦接種，作為傳染源。每株接種兩片葉，接種濃度以病葉質(zhì)量與水的體積之比計為1 20。將已鑒定、純化的PVY病葉進行仔細研磨，用雙層沙布濾除殘渣，最終濃度以病葉質(zhì)量與水的體積之比計為1 20。在病毒液中直接加入2%滅菌600目金剛砂混勻。 采用人工摩擦接種的方法，每株待接種煙株接種3cm以上兩片新生葉。接種時，用手托起葉背，用已滅菌砂布蘸已制備的病毒汁液，在葉正面由內(nèi)側向外輕輕摩擦接種。田間記載分在打頂后10天一次記載，調(diào)查所有煙株，病級分級按相關標準執(zhí)行。 計算病情指數(shù)后進行抗病性初判。病害嚴重度分級(以株為單位分級調(diào)查)0級全株無病。1級心葉脈明或輕微花葉，病株無明顯矮化。3級1/3葉片花葉但葉不變形，或病株矮化為正常株高的3/4以上。
5級1/3 1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，或病株矮化為正常株高的 2/3 3/4。7級1/2 2/3葉片花葉，或變形或主側脈壞死，或病株矮化為正常株高的1/2 2/3。9級全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，或病株矮化為正常株高的1/2以上。病情指數(shù)(D)計算公式D=E (各級病株數(shù)X該病級數(shù))X 100/ (調(diào)查總株數(shù)X最高級數(shù))抗性評價分級標準

免疫病指為0抗病病指為0.1 20中抗病指為20. 1 40中感病指為40. 1 60感病病指為60. 1 80高感病指為80.1 100感病對照的病情指數(shù)不低于60時方可認為試驗及評價有效。結果PVY抗病對照TN90病指為0，對照K326病指為60，實驗發(fā)病程度屬正常范圍。在鑒定材料中其余均表現(xiàn)為感病至中感。各材料鑒定結果見下表
權利要求
1.部分接種鑒定煙草病毒病抗性的方法，是在田間進行的，其特征包括(1)擇地選擇相對較平整、均勻的地塊，該地塊滿足以下條件排灌方便，與周圍環(huán)境有隔離措施，周圍 50m內(nèi)不種植煙草以外的其它茄科作物；(2)種植煙草每個品種每重復種植10株，單行區(qū)排列；隨機區(qū)組，設4個重復；四周設雙行保護行；(3)接種在移栽后的10 15天，選擇氣溫20°C 30°C、無雨的下午對各個小區(qū)的每個品種進行部分人工接種，每個品種均按鑒定株數(shù)的30%接種，即對田間每行的第2、5、8、株進行人工接種，注意避免葉面潮濕；(4)鑒定根據(jù)調(diào)查記載、病情指數(shù)計算，按相應煙草病害調(diào)查、煙草品種抗病性鑒定的行業(yè)標準劃分煙草品種的抗性等級。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述第3步中，具體的接種方法是將已鑒定、純化的煙草病葉(TMV、CMV、PVY)進行仔細研磨，用雙層沙布濾除殘渣，最終濃度以病葉質(zhì)量與水的體積之比計為1 20;在病毒液中直接加入質(zhì)量分數(shù)為2%經(jīng)滅菌的600目金剛砂混勻，作為接種時創(chuàng)造微傷口的介質(zhì)；采用人工摩擦接種法，每株待接種煙株接種3cm 以上兩片新生葉；接種時，用手托起葉背，用已滅菌砂布蘸已制備的病毒汁液，在葉正面由內(nèi)側向外輕輕摩擦接種。
全文摘要
本發(fā)明公開了部分接種鑒定煙草病毒病抗性的方法，包括(1)擇地選擇相對平整、均勻，排灌方便，與周圍環(huán)境有隔離措施，周圍50m內(nèi)不種植其它茄科作物的地塊；(2)種植每個品種重復種植10株，單行區(qū)排列；隨機區(qū)組，設4個重復；四周設雙行保護；(3)接種在移栽后10～15天，選擇氣溫20℃～30℃、無雨的下午對各小區(qū)每個品種進行部分接種；(4)鑒定根據(jù)調(diào)查記載、病情指數(shù)計算，按相應煙草病害調(diào)查、煙草品種抗病性鑒定的行業(yè)標準劃分煙草品種的抗性等級。本方法有效控制田間發(fā)病率在30％～80％，各品種對病毒病抗病、感病特征表現(xiàn)明顯，顯著提高病毒病田間鑒定準確性；有效解決了傳統(tǒng)田間鑒定自然發(fā)病或全部接種時，發(fā)病率過高過低的問題。
文檔編號C12Q1/18GK102220437SQ201110106440
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權日2011年4月27日
發(fā)明者任學良, 張吉順, 李莉, 王仁剛, 謝升東 申請人:貴州省煙草科學研究所