專利名稱：用于防除連作煙草青枯病的拮抗菌njl-14的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能防除連作煙草青枯病的拮抗菌及用其制成的微生物有機(jī)肥料，屬于 農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，專用于克服和消除連作煙草青枯病問題。
背景技術(shù)：
煙草是我國主要的經(jīng)濟(jì)作物，其質(zhì)量的優(yōu)劣關(guān)系著國計(jì)民生。煙草青枯病是煙草 的主要病害之一，危害嚴(yán)重，謂之“煙癌”。1880年首次發(fā)現(xiàn)于美國，目前，在我國西南煙區(qū) 普遍發(fā)生，在疫區(qū)常呈暴發(fā)流行，造成毀滅性損失，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)量損失80%左右。煙草 青枯病是一種發(fā)病嚴(yán)重的土傳性細(xì)菌性病害，該病廣泛分布于全世界的熱帶、亞熱帶和一 些溫暖的地區(qū)。在中國，此病在河南、山東、江蘇、云南、廣西、河北、湖南、廣東、福建等地普 遍發(fā)生，成為影響我國煙草產(chǎn)量及質(zhì)量的罪魁禍?zhǔn)字?。煙草青枯病致病?Ralstonia solanacearum)能通過土壤、流水(灌溉等)、種子等方式傳播，對(duì)環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。 青枯菌侵染土壤初期，由于病原菌數(shù)量少，植株表現(xiàn)為生長受限，矮小，畸形，易感病，農(nóng)民 往往認(rèn)為是養(yǎng)分問題而加大氮肥投入，導(dǎo)致土壤中微生物群落進(jìn)一步失衡，病原菌在根際 占據(jù)優(yōu)勢地位，煙草青枯病發(fā)生。在高溫高濕的條件下，病害發(fā)展迅速，發(fā)病嚴(yán)重的田塊發(fā) 病率達(dá)100%，造成絕收。另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規(guī)模化養(yǎng)殖后的畜禽糞便 隨地棄置等不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，也極大地浪費(fèi)了能作為有機(jī)肥和生物有機(jī)肥產(chǎn)品的原 料；大量的養(yǎng)分資源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系統(tǒng)之外，明顯地削弱了 我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的能力。如何將從土壤中因收獲作物取走的營養(yǎng)元素最大限度地歸還 到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機(jī)廢棄物制成商品有機(jī)肥，再施入土壤。如果將 這些固體有機(jī)廢棄物經(jīng)過高溫發(fā)酵合成高品位的有機(jī)堆肥，再用于功能菌的載體，所制成 的微生物有機(jī)肥料功能明確，將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
1.技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于研制一種能防除煙草青枯病的拮抗微生物有機(jī)肥料，防治效率 達(dá)到80%以上，使大量的連作障礙土壤得到生物修復(fù)，確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。2.技術(shù)方案用于防除連作煙草青枯病的拮抗菌，包括菌株NJL-25和菌株NJL-14，其中，菌株NJL-25屬于短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，2009年7月9日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 3175，主要生 物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，在膨大孢囊內(nèi)含橢圓形芽孢，菌落平滑，嚴(yán)格好氧生長，接觸酶陰性、V. P.反應(yīng)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性，發(fā)酵蔗糖、果糖、甘露醇、山梨 醇等產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，硝酸還原酶陰性，淀粉水解陰性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性，不產(chǎn)生 硫化氫，產(chǎn)生吲哚，最適生長溫度30°C，最適pH為7. 0 ；菌株NJL-14屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，2009年7月10日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 3174，主要生物學(xué)特 性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，孢囊無明顯膨大，芽孢圓形或柱形，中生或近中 生。表面粗糙，扁平，不規(guī)則，兼性好氧生長，接觸酶陽性、V. P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽性， 發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、山梨醇等產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明 膠水解陽性，分解酪蛋白陽性，不產(chǎn)生硫化氫和吲哚，最適生長溫度30°C，最適pH為7. 0。用上述拮抗菌所生產(chǎn)的防除連作煙草青枯病的微生物有機(jī)肥料，其特征在于該 肥料中分別含有1 X IO10個(gè)/g以上的拮抗菌NJL-25和NJL-14、全氮質(zhì)量比含量為4 5%， 全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為 30 35%。所述防除連作煙草青枯病的微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括1)將菌株NJL-25和菌株NJL-14分別接種到PDA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā) 酵生產(chǎn)的條件為初始PH范圍為7. 0-7.2，培養(yǎng)溫度301，溶氧通氣量范圍為30 100%， 170轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵的拮抗菌液含菌或芽孢量> 1 X IO10個(gè)/ml ；所用 PDA培養(yǎng)液配制方法為(以配置IL培養(yǎng)基為例)用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里 煮，沸騰后煮30min，經(jīng)過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調(diào)至7. 2-7. 4， 121 °C 滅菌 20min。2)將NJL-25和NJL-14液體菌劑按50L/噸的量分別接種到腐熟的豬糞堆肥和菜 粕微生物酶解混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30-50°C，發(fā)酵中每天翻堆1次，發(fā)酵5-7 天后結(jié)束，使拮抗菌含量達(dá)到1 X IO8個(gè)/g以上，分別獲得拮抗菌N幾-25和N幾-14的固 體菌劑；所用腐熟后的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)含量>35%，有機(jī)氮含量為 1. 2-2%，含水量 25-30% ο3)按堆肥和菜粕的微生物分解混合物兩類分別將拮抗菌N幾-25固體菌劑和 N幾-14固體菌劑以體積比1 1混合，獲得堆肥的固體混合菌劑和菜粕微生物分解混合物 的固體混合菌劑。4)再將堆肥的固體混合菌劑按體積比50-70%與菜粕微生物酶解混合物的固體 混合菌劑按體積比30-50 %的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過程中翻堆2次，最后在溫 度不超過60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為防除連 作煙草青枯病的微生物有機(jī)肥料。所述微生物有機(jī)肥料可專用于防除連作煙草青枯病。3.有益效果本發(fā)明一種能克服或消除連作煙草青枯病的微生物有機(jī)肥料及其生產(chǎn)方法，利用 豬糞堆肥和菜粕的微生物酶解氨基酸混合物，再與拮抗菌液混合后制成微生物有機(jī)肥料， 其產(chǎn)品與目前市場上的產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1)該肥料產(chǎn)品中含有兩種抑制煙草青枯病病原細(xì)菌生長的專一性高效菌株(短 短芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌)，其抑制效果非常顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，在連作煙草青枯病的土壤上施用本產(chǎn)品后，煙草青枯病的生物防治率達(dá)80%以上，連續(xù)三年施用本肥料的土壤， 青枯病的生物防治率更高。2)該肥料為有機(jī)肥，含有豐富的有機(jī)質(zhì)(含量30-35%)，有機(jī)氮含量為4%，而且 大部分為氨基酸和小分子多肽。本產(chǎn)品總磷含量為4%，而且生物有效性特別高，使用本產(chǎn) 品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性較差。 有機(jī)肥料中含有的豐富營養(yǎng)也為其中的拮抗菌提供了生長繁殖的條件，使在土壤中存活下 來并形成優(yōu)勢群，從而發(fā)揮防病作用。3)由于是生物菌株制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而 有利于煙草的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他防治青枯病化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅 可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于農(nóng)產(chǎn)品的出口。同時(shí)，該微生物肥料還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng) 民增加收入。
四

圖1 拮抗菌NJL-25和NJL-14的抑菌圈A :NJL-25的抑菌圈 B =NJL-14的抑菌圈圖2 溫室盆栽試驗(yàn)防治效果
五具體實(shí)施例方式(一 )菌株的分離和鑒定采集已經(jīng)發(fā)生連作障礙并出現(xiàn)嚴(yán)重青枯病病癥的植株和周圍土壤，樣品低溫 保存，采用Kelman ‘s TTC Agar選擇性培養(yǎng)基分離病原菌——茄勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)。然后以青枯病病原菌為指示菌，從來自于連作煙草青枯病發(fā)病田塊中的健 康煙草植株根際土壤中分離拮抗菌。再通過盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)最終復(fù)篩出高效拮抗菌株 NJL-25和NJL-14，鑒定到屬種，菌種于30%甘油中-70°C保存。拮抗菌NJL-25和NJL-14 的抑菌圈直徑分別為24mm、29mm(圖1)。菌株NJL-25屬于短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)，主要生物學(xué)特性為革 蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，在膨大孢囊內(nèi)含橢圓形芽孢，菌落平滑，嚴(yán)格好氧生長， 接觸酶陰性、V. P.反應(yīng)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性，發(fā)酵蔗糖、果糖、甘露醇、山梨醇等產(chǎn)酸不產(chǎn) 氣，硝酸還原酶陰性，淀粉水解陰性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性，不產(chǎn)生硫化氫，產(chǎn)生 吲哚，最適生長溫度30°C，最適pH為7. 0 ；菌株NJL-14屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，主要生物學(xué)特性為革蘭氏 染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，孢囊無明顯膨大，芽孢圓形或柱形，中生或近中生。表面粗 糙，扁平，不規(guī)則，兼性好氧生長，接觸酶陽性、V. P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽性，發(fā)酵葡萄 糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、山梨醇等產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽 性，分解酪蛋白陽性，不產(chǎn)生硫化氫和吲哚，最適生長溫度30°C，最適pH為7. 0。( 二 )菌劑生產(chǎn)1)將菌株NJL-25和菌株NJL-14分別接種到PDA培養(yǎng)液中，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)， 其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為初始PH范圍為7. 0-7. 2，培養(yǎng)溫度30°C，溶氧通氣量范圍為30 100%，170轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵的拮抗菌液含菌或芽孢量> 1 X IO10個(gè)/ml ；所用PDA培養(yǎng)液配制方法為(以配置IL培養(yǎng)基為例)用200g 土豆削皮后切成 小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，用紗布過濾后，濾液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH 值調(diào)至 7. 2-7. 4，121°C滅菌 20min。2)將NHL-25和NJL-14拮抗菌液按50L/噸的接種量接種到腐熟的豬糞堆肥 和菜粕的微生物酶解混合物進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天翻堆1次，使固體發(fā)酵溫度 30-500C，發(fā)酵5-7天后結(jié)束，使拮抗菌含量達(dá)到1 X IO8個(gè)/g以上，獲得拮抗菌N幾-25固 體菌劑和N幾-14固體菌劑。所用腐熟后的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)含量 ^ 35%,有機(jī)氮含量為1.2-2%，含水量25-30%。。其中菜粕的微生物分解混合物制備方法為(公知公用，見發(fā)明專利 ZL200610086126. 0，一種農(nóng)用氨基酸的生物制取方法及其肥料產(chǎn)品)，菌株37_1發(fā)酵液加 入到菜粕原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6. 0-7. 5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上 升至50°C時(shí)立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開 始后，堆物的PH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和pH，使它們分別維持在 55-65%和6. 0-7. 0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5. 0左右，再進(jìn) 行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)。3)按堆肥和菜粕的微生物分解混合物兩類分別將拮抗菌N幾-25固體菌劑和 N幾-14固體菌劑以1 1混合，獲得堆肥的固體混合菌劑和菜粕微生物分解混合物的固體 混合菌劑；4)再將堆肥的固體單菌菌劑、混合菌劑按體積比70%與菜粕微生物酶解混合物 的固體混合菌劑按體積比30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過程中翻堆2次，最后 在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，獲得防除連作煙 草青枯病的的單菌微生物有機(jī)肥(分別含菌株N幾-25、菌株N幾-14)、混合微生物有機(jī)肥 (含菌 NJL-25 和菌 NJL-14)。用上述拮抗菌所生產(chǎn)的混合微生物有機(jī)肥(防除連作煙草青枯病的專用微生物 有機(jī)肥料)，該肥料中含有1 X IO10個(gè)/g以上的拮抗菌NJL-25和NJL-14、全氮質(zhì)量比含量 為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)質(zhì) 量比含量為30 35%。(三)溫室盆栽試驗(yàn)供試土壤為煙草連作土，青枯病發(fā)病嚴(yán)重。煙草種子采用煙草青枯病敏感型的“云 煙97”。處理如下CK1 健康水稻土 ；CK2 煙草連作土 ；Tl :CK2+氨基酸有機(jī)肥；T2 :CK2+NJL_25液體 發(fā)酵液；T3 :CK2+NJL-14液體發(fā)酵液；T4 :CK2+NJL-14和NJL-25發(fā)酵液混合物(1 1) ；T5 CK2+NJL-25微生物有機(jī)肥；T6 :CK2+NJL_14微生物有機(jī)肥；T7 :CK2+NJL_14和NJL-25混合 微生物有機(jī)肥。 每處理采用4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)23kg病土 /盆，接種拮抗菌，使拮抗菌在土壤中的濃 度達(dá)到108cfu/g干土，T5-T7每盆施115g微生物有機(jī)肥，其他處理用化肥補(bǔ)齊肥料差異。 煙苗移苗前，在菌懸液中浸泡30min。接種拮抗菌后10天開始記錄發(fā)病情況，25天后，CK2 發(fā)病率達(dá)100%，而接種拮抗菌液或微生物有機(jī)肥都能有效降低青枯病的發(fā)病率，其中使用NJL-14和NJL-25生產(chǎn)的混合微生物有機(jī)肥表現(xiàn)出最好的防治效果(圖2)，發(fā)病率為0%。拮抗菌的施入，不但可以起到防治煙草青枯病，大大減少土壤中青枯病原菌 (R. solanacearum)數(shù)量的作用，促進(jìn)煙草根際微生物群落的變化，有益細(xì)菌群落顯著增加， 有害真菌及病原菌群落顯著減少(表1，還能使煙草的生物量顯著增加(表2)，施入拮抗菌 尤其是施入微生物有機(jī)肥處理的生物量與CKl和CK2都呈顯著差異。用微生物有機(jī)肥比直 接使用液體菌劑的生防效果更好(生物量增加到1. 65倍)。施入拮抗菌后，煙草的系統(tǒng)抗病性也有所增強(qiáng)，相關(guān)酶的酶活也顯著提高?？赡苁?拮抗菌的加入引起了煙草植株系統(tǒng)抗性的產(chǎn)生。(表3)(四)田間試驗(yàn)2009年在安徽省宣城市黃渡鄉(xiāng)柏枧村煙草青枯病發(fā)病嚴(yán)重的大田施用微生物有 機(jī)肥。大田試驗(yàn)處理1、施用當(dāng)?shù)責(zé)煵輰Ｓ脧?fù)合肥；2、施用由NJL-14和NJL-25生產(chǎn)的 混合微生物有機(jī)肥。將青枯病發(fā)病嚴(yán)重一塊田以隨機(jī)的方式布置成四個(gè)重復(fù)，每重復(fù)2個(gè) 處理，共8個(gè)小區(qū)。煙草品種為當(dāng)?shù)貞T用品種云煙97，煙苗和肥料都采用穴施，生物有機(jī)肥 施入量按30kg/畝田，用化肥補(bǔ)齊處理1、2間的肥料差異。定期到田間采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)和微生物區(qū)系，最后采收后計(jì)算其不 同處理間生物量的差異。施入由混合拮抗菌微生物有機(jī)肥可以顯著地減少青枯病害的發(fā) 生，防治率達(dá)97. 6%以上，煙葉產(chǎn)量增加2. 27倍(表4)。本發(fā)明專利從微生物區(qū)系這一關(guān)鍵問題著手，研制出一種能顯著消除連作煙草青 枯病發(fā)生的微生物有機(jī)肥料產(chǎn)品，防治率達(dá)97. 6%以上(安徽大田試驗(yàn))。本肥料產(chǎn)品的 作用機(jī)制在于本肥料產(chǎn)品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源給連作障礙土壤有益微生 物區(qū)系的培育提供了很好的條件，使之迅速恢復(fù)和建立外源有益功能菌微生物的生態(tài)及其 食物鏈；另一方面，本肥料產(chǎn)品中含有較高含量的有機(jī)氮和有機(jī)磷，這些營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)連作障 礙土壤中作物的生長十分有利，大大提高了煙草作物的立苗率和抗逆能力。表1 不同盆栽處理根表微生物的含量差異 表2 不同盆栽處理鮮重、干重差異 表3 不同處理間地上部系統(tǒng)抗性酶和與次生代謝物有關(guān)的各種酶的變化 表4 安徽大田試驗(yàn)效果 注防病率=100X (對(duì)照感病指數(shù)_處理感病指數(shù))/對(duì)照感病指數(shù)煙草病情分級(jí)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)0級(jí)全株無病。1級(jí)莖部偶有退綠斑，或在有條斑一側(cè) 有少數(shù)葉片凋萎。2級(jí)莖部有黑色條斑，但尚未達(dá)到頂部，或病側(cè)半數(shù)以上葉片凋萎。3 級(jí)。4級(jí)病株基本枯死。
權(quán)利要求
用于防除連作煙草青枯病的拮抗菌NJL-14，屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，2009年7月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCCNO.3174，主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，孢囊無明顯膨大，芽孢圓形或柱形，中生或近中生。表面粗糙，扁平，不規(guī)則，兼性好氧生長，接觸酶陽性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、山梨醇等產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性，不產(chǎn)生硫化氫和吲哚，最適生長溫度30℃，最適pH為7.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于防除連作煙草青枯病的拮抗菌NJL-14，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離到了對(duì)煙草青枯病病原細(xì)菌有顯著拮抗作用的兩種拮抗菌(短短芽孢桿菌NJL-25和蠟狀芽孢桿菌NJL-14)，利用該拮抗菌與有機(jī)堆肥制成微生物有機(jī)肥料，肥料中分別含有1×1010個(gè)/g以上的NJL-25和NJL-14、全氮含量為4～5％(90％以上為有機(jī)氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為6～10％、有機(jī)質(zhì)含量為30～35％。試驗(yàn)表明，這種微生物有機(jī)肥料施入土壤后能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優(yōu)勢群，在已經(jīng)有煙草青枯病的土壤中青枯病的生物防治率達(dá)97.6％以上。在還沒有形成連作障礙的土壤上長期施用本微生物有機(jī)肥料能在很大程度上防止連作煙草青枯病的發(fā)生。
文檔編號(hào)C05F11/08GK101886055SQ20101022233
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者劉艷霞, 徐陽春, 楊興明, 沈其榮, 沈標(biāo) 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)