專利名稱：快速檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異引物對及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及快速檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異引物對及其應用。
背景技術(shù)：
黃瓜綠斑駁花葉病毒(CucumberGreen Mosaic Mottle Virus, CGMMV)為煙草花 葉病毒屬成員，主要侵染包括葫蘆、黃瓜、西瓜、香瓜、甜瓜等在內(nèi)的葫蘆科作物，在生產(chǎn)上 造成嚴重的危害。該病毒1935年由英國Ainsworth在黃瓜上首次發(fā)現(xiàn)，可侵染許多葫蘆科 作物，在黃瓜上產(chǎn)生的典型癥狀為葉片上出現(xiàn)色斑，水泡及變形，植株矮化，受感染的果實 通常沒有癥狀，但有些株系能夠?qū)е鹿麑嵁a(chǎn)生嚴重的色斑和變形，引起的產(chǎn)量損失達15%， 在西瓜上葉片只產(chǎn)生輕微的斑駁和矮化，但在果實中卻造成嚴重的變色或腐爛。有些亞洲 株系葉片上并不表現(xiàn)癥狀卻能引起相當大的產(chǎn)量損失。CGMMV可通過多種方式傳播，包括種 子調(diào)運、植物間接觸、農(nóng)事操作、汁液、病株殘體及含病株殘體的土壤、嚙齒動物(如兔子、 小白鼠等)的糞便、栽培營養(yǎng)液、河水、灌溉水、被污染的包裝容器、用作肥料的牛糞和菟絲子等。黃瓜綠斑駁花葉病毒分布廣泛，已報道的地區(qū)包括希臘(克里特島)、羅馬尼亞、 中國臺灣、巴西、前蘇聯(lián)、伊朗、丹麥、印度、芬蘭、德國、英國、沙特阿拉伯、以色列、波蘭，烏 克蘭等，其中以亞洲的日本、韓國報道較多。CGMMV在我國屬于進境檢疫性有害生物，自 2004年廈門出入境檢驗檢疫局首次從日本進口的南瓜種子中截獲CGMMV以來，我國已發(fā)生 多起進口源性CGMMV，2005年在我國的遼寧蓋州地區(qū)造成西瓜大面積毀滅，引起農(nóng)業(yè)部、質(zhì) 檢總局等相關(guān)部門的高度重視，并且在廣西、甘肅等地也有CGMMV報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供快速檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異引物對及其應用。本發(fā)明提供的輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異引物對由序列表的序列1所 示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。所述特異引物對可用于制備輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的試劑盒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的試劑盒，包括所述特異引物 對。所述試劑盒還可包括PCR常規(guī)試劑(如10XPCR buffer,dNTP mix,Taq DNA polymerase 等)、反轉(zhuǎn)錄常規(guī)試劑以及電泳常規(guī)試劑。所述特異引物對或所述試劑盒可用于輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測 病毒的cDNA為模板，用所述特異引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到524bp的PCR產(chǎn) 物，則待測病毒為候選的黃瓜綠斑駁花葉病毒；如果沒有得到524bp的PCR產(chǎn)物，則待測病 毒為候選的非黃瓜綠斑駁花葉病毒。所述待測病毒具體可為黃瓜綠斑駁花葉病毒、煙草花葉病毒或齒蘭環(huán)斑病毒。所 述 PCR 的反應體系具體可由 18. 2μ L ddH20,2. 5μ L 10XPCR buffer、1. 0 μ L IOmmol/LdNTP mix.O. 5μ L 10mmol/L序列表的序列1所示DNA (上游引物)、0. 5 μ L 10mmol/L序列 表的序列 2 所示 DNA (下游引物)、2μ L 模板(cDNA)禾口 0. 3 μ L 5U/μ L Taq DNApolymerase 組成。所述PCR的反應條件具體可為94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，;34個循環(huán)； 72°C IOmin0 IOXPCR buffer具體可為購自北京六合通貨號為DRR100A的緩沖液。本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，包括如 下步驟以待測樣本的CDNA為模板，用所述特異引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到 524bp的PCR產(chǎn)物，則待測樣本中含有黃瓜綠斑駁花葉病毒；如果沒有得到524bp的PCR產(chǎn) 物，則待測樣本中不含有黃瓜綠斑駁花葉病毒。所述待測樣本可為植物樣本。所述植物具體可為可被黃瓜綠斑駁花葉病毒感 染的植物(如葫蘆)。所述PCR的反應體系具體可由18. 2μ L ddH20、2. 5yL 10XPCR bufferU. 0μ L 10mmol/L dNTP mix.O. 5μ L lOmmol/L 序列表的序列 1 所示 DNA (上游引 物)、0· 5 μ L 10mmol/L序列表的序列2所示DNA(下游引物)、2 μ L模板(cDNA)禾Π 0. 3 μ L 5U/ μ LTaq DNA polymerase 組成。所述 PCR 的反應條件具體可為94°C 5min -MV 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，;34 個循環(huán)；72°C IOmin0 10XPCR buffer 具體可為購自北京六合通， 貨號為DRR100A的緩沖液。本發(fā)明提供的試劑盒，具有較高的靈敏度，可快速有效的進行檢疫性病毒CGMMV 的田間檢測，特別適合CGMMV 口岸檢測和田間疫情的調(diào)查。采用本發(fā)明的特異引物對或試劑盒檢測CGMMV，操作簡單、快速、結(jié)果可靠、特異性 強、靈敏度高，非常適合應用在口岸現(xiàn)場檢測。本發(fā)明的特異引物對或試劑盒可用于CGMMV 口岸檢測和田間疫情調(diào)查，特別適合農(nóng)業(yè)部門的各檢疫檢查站、各口岸檢驗檢疫局、植物病 毒研究機構(gòu)等應用。


圖1為特異性檢測結(jié)果；M為Marker，1-9為CGMMV，10為陰性對照(以10XPCR buffer為模板)，11為煙草花葉病毒，12為齒蘭環(huán)斑病毒。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。PCR儀為Eppendorf PCR擴增儀。ReversejTranscription和 dNTPs 購于 Promega 公司。ExTaq 酶和 DNA Marker DL2000 購自 TaKaRa。10XPCR buffer 購自北京六合通，貨號為DRR100A。黃瓜綠斑駁花葉病毒(CucumberGreen Mosaic Mottle Virus, CGMMV) :RNA 病毒；參考文獻A Strain of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus (CGMMV) from Bottlegourd(葫聲)in Saudi Arabia, Ibrahim M. Al-Shahwan, Omer A. Abdalla, Article first published online 1 MAY 2008,Journal of Phytopathology,Volumel34,Issue 2, pages 152-156, February 1992.煙草花葉病毒(tobaccomosaic virus,TMV) :RNA病毒；參考文獻Chemical and enzymatic probing of spatial structure of the omega leader of tobacco mosaicvirus RNA. Biochemistry (Mosc). 20IOApr ；75 (4) :405-11. Shirokikh NE, Agalarov SCh, Spirin AS.齒蘭環(huán)斑病毒(OdontoglossumRingspot Virus，ORSV) :RNA 病毒；參考文獻 The use of DIG-Iabelled cRNA probes for the detection of cymbidium mosaic potexvirus(CymMV) and odontoglossum ringspot tobamovirus(ORSV) in orchids.J Virol Methods. 1998 Feb ；70 (2) :193-9. Hu WW, Wong SM.實施例1、特異引物對的設(shè)計設(shè)計用于輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV)的特異引物對如下上游引物:5，-gaagagtccagttctgtttc-3，(序列表的序列1)；下游引物5，-accctcgaaactaagctttc-3，(序列表的序列2)。該上游引物和下游引物的靶序列如序列表的序列3所示。實施例2、特異引物對在輔助鑒定CGMMV中的應用及其特異性用實施例1設(shè)計的特異引物對(序列表的序列1所示上游引物和序列表的序列2 所示下游引物)分別鑒定各種病毒(CGMMV，TMV和0RSV)，具體步驟如下1、提取病毒的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系(30 μ L)中，含有 0. 5μ L M-MLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L)、 1 μ L RNA 禾口 0· 5 μ L 下游引物(10mmol/L)。2、以步驟1得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。PCR 擴增體系(25 μ L) :18. 2μ L ddH20, 2. 5 μ L 10XPCR buffer, l.OyL dNTP mix(10mmol/L)，0· 5 μ L 上游引物(10mmol/L), 0. 5 μ L 下游引物(10mmol/L)，2 μ L 模板， 0. 3μ L Taq DNA polymerase (5U/ μ L)。PCR 擴增條件94°C 5min ；94°C 30s，53°C 30s, 72°C lmin，34 個循環(huán)；72°C IOmin0將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，只有CGMMV得 到PCR擴增產(chǎn)物(5Mbp)，其它3種病毒都沒有得到PCR擴增產(chǎn)物。將PCR擴增產(chǎn)物進行測 序，測序結(jié)果表明，只有CGMMV得到524bp的PCR擴增產(chǎn)物，其它3種病毒都沒有得到PCR 擴增產(chǎn)物。實施例3、特異引物對在輔助鑒定CGMMV中的靈敏度黃瓜綠斑駁花葉病毒可以使植株矮化、結(jié)果延時，果實大部分黃化或變白并產(chǎn)生 墨綠色水皰狀的壞死斑，損失產(chǎn)量甚至導致不孕而絕產(chǎn)。黃瓜綠斑駁花葉病毒在葫蘆葉片 的感病表征為新葉出現(xiàn)黃色小斑點，然后出現(xiàn)花葉并帶有濃綠色突起，葉片上引起色斑、 水泡及變形，葉脈間褪色呈綠帶狀。用黃瓜綠斑駁花葉病毒接種葫蘆葉片，取出現(xiàn)感病表征 的新鮮葉片作為待測樣本進行檢測。取未接種黃瓜綠斑駁花葉病毒且無感病表征的新鮮葫 蘆葉片作為對照樣本。1、提取待測樣本(或?qū)φ諛颖?的總RNA，得到RNA溶液。2、將RNA溶液進行梯度稀釋，得到各種稀釋液，具體如下將RNA溶液用水稀釋至20倍體積(稀釋液A ； 1 20)；將RNA溶液用水稀釋至40倍體積(稀釋液B ； 1 40)；將RNA溶液用水稀釋至80倍體積(稀釋液C ； 1 80)；將RNA溶液用水稀釋至160倍體積(稀釋液D ;1 160)；
將 RNA %§液用水稀釋至320倍體積(稀釋液E ;1 320)；
將 RNA %§液用水稀釋至640倍體積(稀釋液F ； 1 640)；
將 RNA %§液用水稀釋至1280倍體積(稀釋液G ；11280)；
將 RNA %§液用水稀釋至2560倍體積(稀釋液H ;12560)；
將 RNA %§液用水稀釋至5120倍體積(稀釋液I ； 15120)。
3、將各個稀釋液分別進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。
反轉(zhuǎn)錄體系中，含有 0. 5μ L M-MLV Reverse Transcriptase (200U/ μ L) >0. 3 μ L
稀釋液和0. 5 μ L下游引物(10mmol/L)。4、分別以步驟3得到的18種cDNA為模板，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。PCR 擴增體系(25μ L) :18· 2μ L dd H2O, 2. 5 μ LlO X buffer, l.OyL dNTP mix(10mmol/L)，0· 5 μ L 上游引物(10mmol/L), 0. 5 μ L 下游引物(10mmol/L)，2 μ L 模板， 0. 3μ L Taq DNA polymerase (5U/ μ L)。PCR 擴增條件94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin, 34 個循環(huán)；72°C IOmin0將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，待測樣本各個稀釋液的泳道 均顯示目的條帶，即將RNA溶液用水稀釋至5120倍體積還能夠檢測到病毒的存在。對照樣 本各個稀釋液的泳道均未顯示目的條帶。
權(quán)利要求
1.輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的特異引物對；所述特異引物對由序列表的序列1所 示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。
2.權(quán)利要求1所述特異引物對在制備輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的試劑盒中的應用。
3.一種輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述特異引物對。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括10XPCRbuffer,dNTP mix 禾口 Taq DNA polymerase。
5.權(quán)利要求1所述特異引物對，或權(quán)利要求3或4所述試劑盒在輔助鑒定黃瓜綠斑駁 花葉病毒中的應用。
6.一種輔助鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的cDNA為模 板，用特異引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到524bp的PCR產(chǎn)物，則待測病毒為候選 的黃瓜綠斑駁花葉病毒；如果沒有得到524bp的PCR產(chǎn)物，則待測病毒為候選的非黃瓜綠斑 駁花葉病毒；所述特異引物對由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述待測病毒為黃瓜綠斑駁花葉病毒、煙草 花葉病毒或齒蘭環(huán)斑病毒。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述PCR的反應體系由18.2yLddH20、 2. 5μ L 10XPCR bufferU. 0μ L 10mmol/L dNTP mix.O. 5μ L lOmmol/L 序列表的序列 1 所示DNA、0. 5 μ L 10mmol/L序列表的序列2所示DNA、2 μ L所述模板和0. 3 μ L5U/ μ L Taq DNA polymerase 組成；所述 PCR 的反應條件為94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin, 34 個循環(huán)；72 °C IOmin。
9.一種輔助檢測待測樣本中是否含有黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法，包括如下步驟以 待測樣本的cDNA為模板，用特異引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到524bp的PCR產(chǎn) 物，則待測樣本中疑似含有黃瓜綠斑駁花葉病毒；如果沒有得到524bp的PCR產(chǎn)物，則待測 樣本中疑似不含有黃瓜綠斑駁花葉病毒；所述特異引物對由序列表的序列1所示DNA和序 列表的序列2所示DNA組成。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述PCR的反應體系由15.2yLddH20、 2. 5μ L 10XPCR bufferU. 0μ L 10mmol/L dNTP mix.O. 5μ L lOmmol/L 序列表的序列 1 所示 DNA、0. 5 μ L 10mmol/L 序列表的序列 2 所示 DNA、2 μ L 模板和 0. 3 μ L 5U/μ L TaqDNA polymerase 組成；所述 PCR 的反應條件為94°C 5min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，34 個 循環(huán)；72°C IOmin ；所述待測樣本為植物樣本。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的試劑盒及其應用。本發(fā)明提供的特異引物對由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成。采用本發(fā)明的特異引物對或試劑盒檢測CGMMV，操作簡單、快速、結(jié)果可靠、特異性強、靈敏度高，非常適合應用在口岸現(xiàn)場檢測。本發(fā)明的特異引物對或試劑盒可用于CGMMV口岸檢測和田間疫情調(diào)查，特別適合農(nóng)業(yè)部門的各檢疫檢查站、各口岸檢驗檢疫局、植物病毒研究機構(gòu)等應用。
文檔編號C12Q1/68GK102140536SQ201110020249
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月18日
發(fā)明者丁建云, 張永江, 朱水芳, 李明福, 李桂芬, 田永蕾, 趙竹, 陳笑瑜, 馬潔, 魏梅生 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院