專利名稱：一種木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)載體，及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
據(jù)世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計，截至2010年世界饑餓人口已超過10億，隨著人口增長和畜牧業(yè)的發(fā)展，人畜爭糧矛盾也日漸突出，同時畜牧業(yè)的高速發(fā)展也給世界帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題。在這種情況下，尋找開發(fā)新的飼料資源，提高現(xiàn)有飼料資源的利用效率就顯的尤為重要。纖維素和半纖維素是一種可再生自然資源，在自然界中含量極為豐富。因此充分開發(fā)纖維素和半纖維素，可有效拓展我國飼料資源開發(fā)范圍，同時減緩人畜爭糧的矛盾。木聚糖(Xylan)是植物半纖維素的主要成分，谷物飼料中存在的木聚糖是阻礙營養(yǎng)物質(zhì)消化的抗?fàn)I養(yǎng)因子，它使飼料消化利用率大大降低，影響畜禽的生長發(fā)育。木聚糖是一種多聚五碳糖，主要成分是D-木糖，它與纖維素、果膠等結(jié)合在一起形成復(fù)雜的超分子結(jié)構(gòu)，僅靠自然條件的單一酶類很難降解利用它。目前人們通過化學(xué)法和生物酶法來對木聚糖進(jìn)行降解，雖然化學(xué)方法的降解效率比起自然降解的效率有所提高，但是這種方法操作復(fù)雜，降解成本高，污染環(huán)境的同時也會危害到操作者自身的健康。因此現(xiàn)階段人們經(jīng)常用采用生物酶法來降解木聚糖，利用的主要生物酶是木聚糖的專屬水解酶-木聚糖酶。木聚糖酶是一類將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復(fù)合水解酶系，其中β-1， 4-D-木聚糖酶負(fù)責(zé)水解木聚糖主鏈骨架，是酶系中的關(guān)鍵酶。這種酶在提高飼料轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵成產(chǎn)乙醇、紙漿漂白等眾多領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用價值。利用基因工程的方法改造木聚糖酶基因、優(yōu)化分泌表達(dá)系統(tǒng)從而獲得優(yōu)良的酶工程菌具有重要的工業(yè)生產(chǎn)意義。在木聚糖酶基因克隆表達(dá)中常使用大腸桿菌作為分泌和表達(dá)宿主，具有遺傳背景清楚、表達(dá)周期短、轉(zhuǎn)化效率高、操作簡單等優(yōu)點，因此也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。 但是大腸桿菌也有其自身的不足之處它的表達(dá)蛋白易形成包涵體，不利于下游的純化加工，同時木聚糖酶的表達(dá)蛋白無法分泌至胞外，也為酶活測定和直接利用帶來麻煩?？莶菅挎邨U菌則是繼大腸桿菌后又一廣泛使用的表達(dá)系統(tǒng)，它與大腸桿菌一樣遺傳背景清楚，培養(yǎng)簡單，易操作，但同時它沒有致病性，并且可以經(jīng)由信號肽引導(dǎo)將表達(dá)蛋白分泌至培養(yǎng)基中，表達(dá)產(chǎn)物多數(shù)具有天然構(gòu)象和生物活性，彌補(bǔ)了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足?？莶菅挎邨U菌具有很強(qiáng)的向胞外分泌蛋白(中性蛋白酶A和B、堿性蛋白酶、枯草多肽酶F、a_淀粉酶)的能力，蛋白分泌主要通過Sec途徑，其次是Tat途徑。其中大多數(shù)細(xì)菌分泌蛋白都通過Sec轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分泌。Sec途徑又叫普通分泌途徑，目前大部分文獻(xiàn)報道中外源表達(dá)蛋白均通過Sec途徑分泌，枯草芽孢桿菌的分泌蛋白約有300種(Manting EH etal. 2000)，幾乎所有分泌蛋白都是經(jīng)由Sec途徑轉(zhuǎn)移分泌至胞外。Sec轉(zhuǎn)運系統(tǒng)包括信號肽、信號肽酶、SecYEG通道以及各種細(xì)胞因子，其中SecA、SecD, SecE, SecF, SecY, ffh、ftsY編碼蛋白參與整個轉(zhuǎn)運過程。 SecA是ATP酶，通過水解ATP提供分泌蛋白前體穿膜的驅(qū)動力，SecE, SecY和kcG組成蛋白轉(zhuǎn)移極性通道-SecYEG，SecD和kcF則是蛋白轉(zhuǎn)移酶的輔助成分。
在Sec途徑中，核糖體首先合成分泌蛋白前體，該分泌蛋白前體帶有分泌蛋白的標(biāo)記-信號肽，蛋白處于未折疊狀態(tài)。隨后Sec蛋白(SecA)的ATP酶活性水解ATP和質(zhì)子原動力，分泌蛋白前體在信號肽的引導(dǎo)下，通過細(xì)胞膜上的極性通道轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜外，通道蛋白由一組膜蛋白組成，負(fù)責(zé)定位和轉(zhuǎn)移分泌蛋白的細(xì)胞質(zhì)(周冰和張惟材2004)，在整個轉(zhuǎn)移過程中分泌蛋白體以肽鏈形式存在。穿過細(xì)胞膜之后，信號肽酶切除信號肽，蛋白質(zhì)正確折疊并穿過細(xì)胞壁被釋放至培養(yǎng)基中。由此過程可以看出信號肽是引導(dǎo)外源蛋白跨膜分泌的關(guān)鍵元件。信號肽是引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞膜的一段連續(xù)的氨基酸序列。一般由10-40個左右的氨基酸殘基構(gòu)成，它包括三個區(qū)域氨基端區(qū)、疏水端區(qū)和羧基端區(qū)。氨基端區(qū)的N端由帶正電荷的氨基酸組成，又稱為堿性氨基末端或N端，常見的氨基酸有賴氨酸和精氨酸。疏水端區(qū)由20個或20個以上的中性氨基酸組成，在與膜脂接觸時形成α螺旋結(jié)構(gòu)，常見氨基酸有亮氨酸、異亮氨酸等，又稱為H端；羧基端區(qū)的C端含有小分子氨基酸，主要有甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等，含有信號肽酶的切割位點，亦稱加工區(qū)或C端。其中疏水區(qū)的長度和疏水性在分泌中起著重要的作用。但特定的高效分泌表達(dá)蛋白調(diào)控元件對其他基因不一定具有普遍適用性， UlfBrockmeier等Q006)將兩種脂肪酶cutinase和esterase分別作為異源目的蛋白對枯草芽孢桿菌sec途徑中的148個信號肽進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，這兩種目的蛋白的高效表達(dá)信號肽之間并沒有對應(yīng)關(guān)系，即使是同一種蛋白，在不同信號肽的引導(dǎo)作用下，雖然大部分都能將其引導(dǎo)表達(dá)，但是分泌效率也相差甚遠(yuǎn)。綜上所述，我們可以看出，首先，信號肽的一些指標(biāo)，如N端正電荷數(shù)目、疏水性等并不能決定信號肽的引導(dǎo)分泌效率。對于每種異源蛋白的分泌必須篩選出相對應(yīng)的信號肽。其次，信號肽數(shù)量多。就目前發(fā)現(xiàn)而言Sec途徑有148個信號肽，Tat途徑有27個信號肽，數(shù)量眾多的信號肽對木聚糖酶有不同的引導(dǎo)分泌效率，在進(jìn)行木聚糖酶的引導(dǎo)表達(dá)過程中，很難篩選出高效引導(dǎo)木聚糖酶表達(dá)的信號肽，為構(gòu)建木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)載體消耗大量人力物力。(參見期干Ij Ball A S, Mc Carthy A J. 1989. Production and properties of xylanasefrom acti-nomycetes. J. Appl Bacteriol,66 439 444.Berks B C. 1996. A common export pathway for proteins binding complex redoxcofactors ？ . Mol Microbiol, 22 393 404.M D Gibbs, R A Reeves and P L Bergquist. 1995. Cloning, sequencing andexpression of xylanase gene from the extreme thermophile Dictyoglomus thermophilumRt46B. 1 and activity of the enzyme on fiber-bound subtracte. Appl EnvironMicrobiol,61(12) :4403 4408.Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S.1997. Identification of prokaryotic andeukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.Protein Eng, 10 :1 6.Ulf Brockmeier,Michael Caspers,Roland Freudl. 2006. Systematic Screening of AllSignal Peptides from Bacillus subtilis :A Powerful Strategy in OptimizingHeterologousProtein Secretion in Gram-positive Bacteria. J. Mol. Biol, 362 :393 402.)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的載體。本發(fā)明所述的木聚糖酶表達(dá)載體，包括大腸桿菌復(fù)制子ColEl、枯草芽孢桿菌復(fù)制子B. sub. r印、篩選標(biāo)記以及啟動子，在所述啟動子下游設(shè)有一信號肽序列和一木聚糖酶 XynA基因序列。本發(fā)明中，信號肽序列，為Sec途徑信號肽序列，是根據(jù)Ulf Brockmeier (2006)報道，選擇的30個Sec途徑信號肽將測序正確并酶切成功的信號肽片段連接至信號肽篩選載體上，如可以是PhoB、Bpr、Vpr, YnfF, LipA或YjdB等，可用的信號肽序列詳見附圖2表中所列，本發(fā)明中，優(yōu)選的％0途徑信號序列為W10B,其具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
本發(fā)明中，編碼該W10B信號肽序列的核苷酸序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)所需要編碼的氨基酸序列而設(shè)計出多種，這些，是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所能知曉并獲得的，編碼WioB信號肽的核苷酸序列，具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，也可以使是與SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列具有至少70%同一性，優(yōu)選80%同一性、更優(yōu)選90%、 95% ,97^^99%同一性的核苷酸序列。本發(fā)明中，木聚糖酶基因XynA是事先去掉自身信號肽后的成熟肽編碼基因，編碼木聚糖酶成熟氨基酸序列的基因為具有與SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列至少70%同一性的核苷酸序列，優(yōu)選為具有至少80%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選為具有85%、90%、 92%,95%,97%,98%,99%,100%同一性的核苷酸序列，其編碼木聚糖酶的成熟肽(或稱為成熟氨基酸序列)。當(dāng)然，本發(fā)明根據(jù)需要，也可將木聚糖酶基因換成其它形式的基因，以構(gòu)建具有表達(dá)不同多肽、酶或蛋白的載體。本發(fā)明中，所述啟動子可以是本領(lǐng)域常用的啟動子，如可以是Lac乳糖啟動子、 tac啟動子、trc啟動子、T7啟動子、麥芽糖啟動子I^glv等，所選用的啟動子，是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所能熟知的，本發(fā)明中，優(yōu)選的啟動子是麥芽糖啟動子I^glv。本發(fā)明中，所用的篩選標(biāo)記可以是各種抗性，如氨芐抗性、新霉素抗性、鏈霉素抗性、潮霉素抗性、壯觀霉素抗性等。本發(fā)明中，構(gòu)建所述木聚糖酶表達(dá)載體的起始載體是大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體PGJ148。具體地，本發(fā)明所述木聚糖酶表達(dá)載體(簡寫成“PSX”)具有如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列，其結(jié)構(gòu)示意圖詳見附圖4。本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有本發(fā)明所述木聚糖酶表達(dá)載體的宿主細(xì)胞， 所述宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌、枯草桿菌或酵母菌。本發(fā)明的還一目的在于提供一種構(gòu)建本發(fā)明所述木聚糖酶表達(dá)載體的方法，具體包括如下步驟篩選載體的構(gòu)建首先構(gòu)建大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體PGJ148 (參見文獻(xiàn)白曉婷，張愛玲，曹要玲.大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38(9) 8-10)在該文獻(xiàn)中構(gòu)建的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體PGJ103，利用本試驗室保存的質(zhì)粒pBluskm-PglvM (把M去掉)和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pGJ103來構(gòu)建pGJ148。 用ApaI和EcoRI雙酶切pBluskm-Pglv，得到啟動子片段I^glv。用DNA回收試劑盒分別回收約250bp的I^glv和消化處理后的pGJ103。用DNA連接酶將回收得到的三個片段連接后電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α。將重組菌接入含氯霉素抗性的液體LB中過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。為了在WB700中篩選重組子，要更換PGJ148抗性基因。以pGJ148為模板，擴(kuò)增獲得去氯霉素骨架載體并在兩端引入BglII酶切位點，再以shuttle為模板擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因(Sper+)在兩端引入BamHI酶切位點，然后分別用BglII和BamHI進(jìn)行酶切，膠回收后連接這兩個片段獲得到中間載體PPS。以短小芽孢桿菌BYG5-20基因組為模板擴(kuò)增木聚糖酶基因XynA去掉自身信號肽后的編碼區(qū)，用BamHI和McI消化后連接至pPS相應(yīng)位點內(nèi)，構(gòu)建pPSX。BYG5-20是實驗室先前所篩出的能分泌耐堿性木聚糖酶的短小芽孢桿菌。(參見文獻(xiàn)曹要玲，白曉婷.1株產(chǎn)堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及其木聚糖酶基因的克隆[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38 (9) 11-14)由于信號肽克隆位點上兩個酶切位點較近，而且信號肽片段較短，因此很難估計載體雙酶切效率以及篩選連接有信號肽陽性克隆，因此我們在信號肽克隆位點EcoRI至 BamHI之間插入了綠色熒光蛋白基因GFP，方便信號肽的更換，將篩選載體命名為pGPSX。分泌表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)UlfBrockmeier (2006)報道，選擇30個Sec途徑信號肽將測序正確并酶切成功的信號肽片段連接至信號肽篩選載體PGPSX上GFP所在位置，從而構(gòu)建了具有不同信號肽的木聚糖酶分泌表達(dá)載體。然后將這些載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB700中，在Spec (壯觀霉素抗性)和Cm(氯霉素抗性)抗性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后保存菌液。篩選出一種能夠引導(dǎo)木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的信號肽用DNS法測定酶活，檢測不同信號肽對重組枯草芽孢桿菌分泌木聚糖酶的影響， 從而篩選出一種能夠引導(dǎo)木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的信號肽。 (4)木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)載體構(gòu)建將篩選出的能夠引導(dǎo)木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的信號肽連接至信號肽篩選載體PGPSX上GFP所在位置，從而構(gòu)建了一種木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)載體PSX。本發(fā)明的還一目的在于提供一種利用本發(fā)明所述木聚糖酶表達(dá)載體生產(chǎn)木聚糖酶的方法，它是將本發(fā)明所構(gòu)建的木聚糖酶表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，在適當(dāng)培養(yǎng)基的條件下，發(fā)酵表達(dá)得到外源蛋白，合適的宿主細(xì)胞可以是大廠桿菌、枯草桿菌，優(yōu)選為枯草芽孢桿菌，更優(yōu)選為枯草芽孢桿菌WB700。本發(fā)明有如下優(yōu)勢本發(fā)明篩選出針對木聚糖酶具有強(qiáng)表達(dá)的信號肽，為木聚糖酶的高效表達(dá)奠定基石出。本發(fā)明構(gòu)建木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)載體為以后構(gòu)建木聚糖酶的高效表達(dá)系統(tǒng)節(jié)省人力物力。


圖1是擴(kuò)增片段引物序列圖。圖2是不同信號肽對木聚糖酶活性率的影響。圖3是本發(fā)明高效表達(dá)載體的酶切鑒定圖，其中泳道M是DNA marker，泳道1、3是載體PSX用BamHI-HindI 11酶消化后的圖，泳道2、4是載體PSX用Ec0RI-HindI 11酶消化后的圖。由于信號肽片段只有IOObp左右，直接酶切檢測較為困難，而在XynA基因靠近3’段有HindIII酶切位點，因此對獲得的分泌表達(dá)載體分別用EcoRI-HindIII和BamHI-HindIII 進(jìn)行兩組雙酶切，兩組酶切得到的較小片段分別為640bp左右和540bp則證明信號肽連接成功圖。圖4是木聚糖酶表達(dá)載體PSX物理圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明通過下述實施例進(jìn)一步闡明，但任何實施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng)域一般常識，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。材料與試劑主要限制性內(nèi)切酶、pGME-T Vector購自！Iomega公司，T4連接酶購自！^ermentas公司，Ex Taq酶，堿性磷酸酶，DNA make購自TAKALA公司，細(xì)菌基因組提取、 質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，抗生素、樺木木聚糖購自Sigma公司，瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨購自O(shè)xiod，Tris(pH值8. 0)、飽和的苯酚、氯仿等試劑均為國產(chǎn)分析純，測序服務(wù)由南京金斯瑞公司提供。LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基按文獻(xiàn)配制，各種抗生素培養(yǎng)基中濃度為氨芐青霉素 (Amp) 100mg/L，壯觀霉素(Spec) 50mg/L，氯霉素(Cm) 7. 5mg/L。大腸桿菌質(zhì)粒提取、DNA的酶切、電泳、DNA片斷連接、轉(zhuǎn)化均參照薩姆布魯克Q002)進(jìn)行?？莶輻U菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化參考祝發(fā)明O006)博士論文。1、大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體PGJ148構(gòu)建(參見文獻(xiàn)白曉婷，張愛玲，曹要玲.大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體的構(gòu)建及應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38 (9) 8-10)在該文獻(xiàn)中構(gòu)建的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體PGJ103，利用本試驗室保存的質(zhì)粒pBlUSkm-PglvM(也可從市場直接購買得到，為商業(yè)化載體)和大腸桿菌_枯草芽孢桿菌穿梭載體PGJ103來構(gòu)建pGJ148。用ApaI和EcoRI雙酶切pBluskm-Pglv，得到啟動子片段I^glv。用DNA回收試劑盒分別回收約250bp的I^glv和消化處理后的pGJ103。酶切反應(yīng)體系DNA10 μ L內(nèi)切酶各IyL
7
IOXbuffer2μ L
BSA0. 2μ L
ddH20補(bǔ)足20ul
連接反應(yīng)體系
IOXbuffer1 μ L
載體片段3μ L
插入片段5 μ L
T4DNA連接酶1 μ L
用DNA連接酶將回收得到的三個片段連接后電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α。將重組菌
接入含氯霉素抗性的液體LB中過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，構(gòu)建得到載體pGJ148。2、篩選載體各部件擴(kuò)增以圖1所示序列P1/P2為引物對，以質(zhì)粒PGJ148為模板擴(kuò)增獲得2. 7kb的pGJ148 去氯霉素骨架并在兩端引入BglII酶切位點，上面含有大腸桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)制子， 以及麥芽糖誘導(dǎo)性啟動子I^glv。PCR反應(yīng)條件為94°C變性30sec ；52°C退火30sec ；72°C 延伸180sec ；35個循環(huán)，最后電泳回收PCR產(chǎn)物。引物Pl 5' GCGAGATCTTAGTTTTTAGATTTTGGAAGTG 3,P2 5’ CCAGATCTTTACTCCAAAATCTAAATTCACG 3’PCR反應(yīng)體系上游引物(0.3pmol/L)Iul下游引物(0.3pmol/L)Iul模板IuldNTP4ulExTaq0. 25ulIOXBuffer5ulddH20補(bǔ)足至 50ul以圖1所示序列P3/P4為引物對，以質(zhì)粒Siuttle做為模板獲得了 1. Okb的壯觀霉素抗性基因，在兩端引入BamHI酶切位點。PCR反應(yīng)條件為94°C變性30sec力4°C退火 30sec ；72°C延伸60sec ；35個循環(huán)，最后電泳回收PCR產(chǎn)物。引物P3 5' TAGGATCCGAATGGCGATTTTC 3'P4 5， CCCGGATCCTTATAATTTTTTTAATCTG 3，PCR反應(yīng)體系同上。以圖1所示序列P5/P6引物對，以短小芽孢桿菌BYG5-20基因組為模板擴(kuò)增木聚糖酶基因XynA去掉自身信號肽后的編碼區(qū)。PCR反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)條件為94°C變性 40sec ；57°C退火40sec ；72°C延伸4kec ；34個循環(huán)，最后電泳回收PCR產(chǎn)物。弓丨物P5 5' CAGGATCCAGAACCATTACGAATAATG 3'P6 5’ TTGAGCTCTTAGTTGCCAATAAACAGC 3’PCR反應(yīng)體系同上。以圖1所示序列P7/P8引物對，以pLRES2-ZSGreenl質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得了 700bp 綠色熒光蛋白基因，在兩端引入EcoR I和BamH I酶切位點。PCR反應(yīng)條件為94°C變性30sec ；52°C退火30sec ；72°C延伸90sec ；35個循環(huán)，最后電泳回收PCR產(chǎn)物。引物P7 5，TATGAATTCTCAGGGCAAGGCGGA 3，
P8 5’ ATAGGATCCATGGCCCAGTCCAAGC 3’
PCR反應(yīng)體系同上。
將以上獲得的片段連接至PGEM-T Vector載體上，獲得4個中間載體pl48Cm_TV、pSpec-TV,pXynA-TV,pGFP-TV。
連接反應(yīng)體系
2X buffer5 μ L
pGEM-T Vector1 μ L
PCR產(chǎn)物3μ L
T4DNA連接酶1 μ L
3、篩選載體的構(gòu)建
用 Bgl II 禾口 BamH I分別消化pl48Cm-TV和pSpec-TV，將兩個片段連接，得到載體pPS。
酶切反應(yīng)體系
DNA10 μ L
內(nèi)切酶各IyL
IOXbuffer2μ L
BSA0. 2μ L
ddH20補(bǔ)足至20ul
連接反應(yīng)體系
IOXbuffer1 μ L
載體片段3μ L
插入片段5 μ L
T4DNA連接酶1 μ L
BamH I和Mc I消化pXynA-TV，獲得木聚糖酶基因編碼區(qū)去掉自身信號肽片段，
將其連接至PPS上，獲得載體pPSX。
0114]酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系同上。
0115]用EcoR I和BamH I酶切pGFP_TV獲得GFP基因編碼區(qū)，連接至pPSX相應(yīng)位點獲得最終篩選載體PGPSX。
0116]酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系同上。
0117]4、分泌表達(dá)載體的構(gòu)建
0118]將測序正確并酶切成功的信號肽片段連接至木聚糖酶篩選載體pGPSX上GFP所在位置，從而構(gòu)建了具有不同信號肽的木聚糖酶分泌表達(dá)載體。
0119]5.篩選出一種能夠引導(dǎo)木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的信號肽
0120]將上述分泌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB700中，在Spec (壯觀霉素抗性)和 Cm(氯霉素抗性)抗性培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后保存菌液。取50ul上述菌液接種至含5ml Spec抗性LB培養(yǎng)基的試管中擴(kuò)大培養(yǎng)12h，吸取擴(kuò)大后的菌液600ul接種到30mlLB中37°C培養(yǎng)M小時，然后在4V 8000r/min離心IOmin收集上清。取1. 8ml的0. 5%木聚糖酶溶液于IOml加塞玻璃管中，加入稀釋后的上清液0. anl，50°C水浴lOmin，取出后立即加入DNS試劑anl，沸水浴5min，流水冷卻后，用蒸餾水定容至10ml，混勻后在波長 540nm下測吸光值(OD)。見圖2及表1。表1不同位點對應(yīng)的信號肽
權(quán)利要求
1.一種木聚糖酶表達(dá)載體，包括大腸桿菌復(fù)制子ColEl、枯草芽孢桿菌復(fù)制子B. sub. r印、篩選標(biāo)記以及啟動子，在所述啟動子下游設(shè)有一信號肽序列和一木聚糖酶XynA基因序列。
2.權(quán)利要求1所述的木聚糖酶表達(dá)載體，其特征在于所述的信號肽序列為PhoB，具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其中表達(dá)所述信號肽W10B的編碼基因為具有與SEQID NO 2所示核苷酸序列至少70%同一性的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的木聚糖酶表達(dá)載體，其特征是所述的木聚糖酶XynA基因的堿基序列具有與SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列至少70%同一性的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1所述的木聚糖酶表達(dá)載體，其特征是所述的啟動子為麥芽糖啟動子 Pglv。
6.權(quán)利要求1所述的木聚糖酶表達(dá)載體，其特征是所述的篩選標(biāo)記為壯觀霉素抗性 Spec0
7.含有權(quán)利要求1-6中任意一權(quán)利要求所述木聚糖酶表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
8.構(gòu)建權(quán)利要求1-6中任意一權(quán)利要求所述木聚糖酶表達(dá)載體的方法，其特征在于包括如下步驟(1)構(gòu)建載體PGJ148；(2)以pGJ148為模板擴(kuò)增獲得去氯霉素骨架載體并在兩端引入BglII酶切位點，再以 shuttle為模板擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因(Sper+)在兩端引入BamHl酶切位點，然后分別用 Bgl II和BamH I進(jìn)行酶切，膠回收后連接這兩個片段獲得到中間載體pPS ；(3)以短小芽孢桿菌BYG5-20基因組為模板擴(kuò)增木聚糖酶基因XynA去掉自身信號肽后的編碼區(qū)，用BamH I和Mc I消化后連接至pPS相應(yīng)位點內(nèi)，構(gòu)建pPSX ；(4)在pPSX載體的EcoRI至BamH I之間插入了綠色熒光蛋白基因GFP，將篩選載體命名為pGPSX;(5)將篩選出的能夠引導(dǎo)木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)的信號肽WioB的編碼基因連接至信號肽篩選載體PGPSX上GFP所在位置，構(gòu)建得到木聚糖酶表達(dá)載體PSX。
9.利用權(quán)利要求1至6中任一項權(quán)利要求所述的表達(dá)載體生產(chǎn)木聚糖酶的方法，是將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，發(fā)酵表達(dá)得到外緣蛋白。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其特征是所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)木聚糖酶的表達(dá)載體，以及該表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所述表達(dá)載體包括大腸桿菌復(fù)制子ColE1、枯草芽孢桿菌復(fù)制子B.sub.rep、篩選標(biāo)記以及啟動子，在所述啟動子下游設(shè)有一信號肽序列和一木聚糖酶XynA基因序列，其以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌為穿梭載體，通過篩選出針對木聚糖酶具有強(qiáng)表達(dá)的信號肽，可實現(xiàn)木聚糖酶的高效表達(dá)。
文檔編號C12N1/19GK102154361SQ20111000983
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月17日
發(fā)明者宋秀平, 張偉, 張雯, 曹鵬濤, 楊明明, 范鑫, 龔月生 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)