專(zhuān)利名稱(chēng)：基于mp基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法及探針和引物組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以及在該方法中應(yīng)用到的檢測(cè)用探針和引物組合。
背景技術(shù)：
黃瓜綠斑駁花葉病毒{Cucumbergreen mottle moasic virus, CGMMV)隸屬番爺叢矮病毒科{Tombusviridae)煙草花葉病毒屬(TbAaffioriry1S),是嚴(yán)重危害葫蘆科作物的重要病毒之一，為典型的種傳病毒。該病毒于1935年在英國(guó)的黃瓜上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，因此命名為黃瓜病毒3 (CV3)和黃瓜病毒4(CV4)，由Anisworth記述。CGMMV株系眾多，包括英國(guó)和歐洲早期報(bào)道的典型株系{Cucumber green mottle mosaic、黃瓜桃葉珊瑚花葉株系{Cucumber aucuba ,日本報(bào)道的西瓜株系(Watermelon strain)和日本黃瓜株系(Japanese cucumber strai/ )、洋東株系(Jodo strain)以及印度C株系{Indian strain C)。韓國(guó)報(bào)道了 CGMMV-KW、CGMMV_KM4、CGMMV-HY 和 CGMMV-K0W 等株系。近幾年中國(guó)也有一些不同地理株系的報(bào)道，如分離自廣西、遼寧等地的CGMMV-GX、CGMMV-LN、Liaoning 等。黃瓜綠斑駁花葉病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布，主要分布于歐洲的英國(guó)、德國(guó)、荷蘭、丹麥、芬蘭、瑞典、希臘、俄羅斯、羅馬尼亞、西班牙，南美的巴西，亞洲的以色列、巴基斯坦、伊朗、印度、沙特阿拉伯、日本、韓國(guó)等國(guó)家和地區(qū)。1987年中國(guó)臺(tái)灣已有該病毒的報(bào)道。近年來(lái)在我國(guó)遼寧、廣西、廣東部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病毒為害，造成西瓜、黃瓜、甜瓜、南瓜等農(nóng)作物不同程度的減產(chǎn)甚至絕收，經(jīng)濟(jì)損失非常嚴(yán)重。CGMMV的寄主范圍比較窄，包括藜科、茄科和葫蘆科植物，主要侵染葫蘆科的黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜、絲瓜、`西葫蘆和葫蘆等植物。CGMMV侵染引起的癥狀因寄主、環(huán)境及株系的不同而有差異，一般造成植株生長(zhǎng)緩慢、矮化，葉片斑駁、凹凸、畸形及水皰，果肉變色、腐爛及纖維化。侵染黃瓜后在新葉上出現(xiàn)黃色的小斑點(diǎn)，后期呈花葉并帶有濃綠色的突起，葉脈間褪色為綠帶狀；植株矮化，果實(shí)受損嚴(yán)重，表面上產(chǎn)生銀白色條斑，產(chǎn)量可下降15% ;侵染西瓜后表現(xiàn)為輕型葉斑駁，植株矮化，果實(shí)成熟期癥狀嚴(yán)重，果實(shí)表面形成濃綠色圓斑，內(nèi)部出現(xiàn)果肉變色和腐爛。在甜瓜上造成莖端新葉出現(xiàn)黃斑，但隨葉片老化癥狀減輕。南瓜植株感病后表現(xiàn)為矮化、綠脈和花葉的等癥狀。黃瓜綠斑駁花葉病毒主要存在于花粉、種皮、病苗的胚軸、葉片、果實(shí)等組織中。是典型的種傳病毒，黃瓜新鮮種子的傳毒率為8%，保存5個(gè)月之后下降到1%，西瓜種子傳毒率為5%，土壤帶毒率很低。黃瓜葉甲有可能是媒介昆蟲(chóng)，目前沒(méi)有蚜傳的報(bào)道。介體菟絲子主要包括 C subinclusa 和 C. campestris。CGMMV引起的病毒病在其發(fā)生歷史上造成過(guò)嚴(yán)重危害。1935年英國(guó)最早報(bào)道在黃瓜上發(fā)生；1969年日本報(bào)道過(guò)該病的發(fā)生，當(dāng)時(shí)被稱(chēng)為“魔芋病”；1974年德國(guó)溫室黃瓜受到該病毒的影響面積達(dá)5% ;1976年前蘇聯(lián)Georgia地區(qū)黃瓜上的發(fā)病率達(dá)到80 100%，導(dǎo)致黃瓜減產(chǎn)30% ；1989年韓國(guó)報(bào)道該病在大田作物上大面積蔓延，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，1998年又在韓國(guó)的西瓜和黃瓜上為害，受災(zāi)面積達(dá)到463hm2，引起“西瓜血瓤病”，造成巨大損失。1987年中國(guó)臺(tái)灣有該病發(fā)生危害的報(bào)道；2003年在廣西的溫室南瓜上分離到該病毒；2005年遼中地區(qū)的西瓜上大面積發(fā)生，造成嚴(yán)重危害，這是大陸首次在大田發(fā)生該病的報(bào)道。2004 2006年廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局多次從日本進(jìn)境的南瓜種子中截獲該病毒。2009年甘肅局在進(jìn)口自俄羅斯的黃瓜種子中到截獲該病毒。2007年農(nóng)業(yè)部862號(hào)公文《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》將其列為重要的對(duì)外檢疫性有害生物。CGMMV為直桿狀病毒，粒子大小約300 X 18nm，核酸為線性單正鏈RNA，基因組長(zhǎng)度約為6. 5kb，為單組份?；蚪M編碼4個(gè)蛋白分子，靠近5’端的126kDa和183kDa兩個(gè)蛋白與病毒的復(fù)制有關(guān)，其中183kDa是由126kDa蛋白終止子超讀產(chǎn)生的；另外兩個(gè)蛋白分別為約 30kDa 的運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement protein, MP)和 17. 5kDa 的外殼蛋白(Coat protein,CP)，這兩個(gè)蛋白分別由不同的亞基因組RNA表達(dá)產(chǎn)生。病毒基因組5’端和3’端分別含有一段非編碼區(qū)(Noncoding region，NCR)，5’端含帽子結(jié)構(gòu)，3’端有一個(gè)可以接受組氨酸的類(lèi)似tRNA狀結(jié)構(gòu)。半個(gè)世紀(jì)來(lái)，現(xiàn)代病毒學(xué)研究水·平不斷提高，病毒的檢測(cè)技術(shù)也在不斷發(fā)展和改進(jìn)。目前病毒的檢測(cè)方法主要包括枯斑和指示植物檢測(cè)法，血清學(xué)檢測(cè)法，酶標(biāo)免疫吸附法(ELISA)，電鏡負(fù)染檢測(cè)法，免疫電鏡檢測(cè)法，電鏡超薄切片法以及常規(guī)PCR檢測(cè)方法。C. Varveri 米用 DAS_ELISA( Double-antibody sandwich ELISA)和F(ab’)2-ELISA兩種酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)希臘分離物進(jìn)行檢測(cè)，并比較了兩種方法的檢測(cè)靈敏度，后者比前者靈敏性高出IO3倍；Shim用DAS-ELISA方法對(duì)來(lái)自葫蘆上表現(xiàn)CGMMV癥狀的樣品進(jìn)行了定性檢測(cè)；Choi等將RIPA (Radioimmunoprecipitation Assay,放射免疫沉淀檢測(cè)法)發(fā)展為mult1-RIPA技術(shù)，并同時(shí)檢測(cè)西瓜、黃瓜、西葫蘆和瓠子上的CGMMV，mult1-RIPA 檢測(cè) CGMMV 的最低量為 5OngAil ；Kawai 等使用 M-ELISA ( modified ELISA)檢測(cè)黃瓜種子，結(jié)果比標(biāo)準(zhǔn)ELISA更靈敏，其靈敏度相當(dāng)于檢測(cè)到800粒健康種子中的I粒病種。血清學(xué)方法是目前普遍運(yùn)用的常規(guī)檢測(cè)方法，可操作性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)可靠。但是該方法成本較高，周期性長(zhǎng)，且靈敏度有限，難以檢測(cè)含量很少的病毒。RT-PCR是反轉(zhuǎn)錄RNA和利用單鏈寡核苷酸弓I物對(duì)特異性DNA片段進(jìn)行體外快速擴(kuò)增的方法。張永江等(2008)對(duì)葫蘆、西瓜、甜瓜3種作物的不同種質(zhì)資源以及同種種質(zhì)資源的不同處理進(jìn)行了 DAS- EL IS A和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示受侵染的不同種質(zhì)資源均可帶毒，而RT-PCR方法的靈敏度遠(yuǎn)高于ELISA，并且建立了直接從葫蘆種子中檢測(cè)CGMMV的技術(shù)方法。黃靜等(2007)用該方法檢測(cè)了黃瓜、葫蘆、南瓜三種作物的病葉和莧色藜枯斑中的CGMMV病毒，均可以擴(kuò)增到650bp的目的條帶，但是條帶清晰度一般，說(shuō)明檢測(cè)水平有限。此外，保存于_20°C中的冷凍黃瓜病葉經(jīng)多次試驗(yàn)均無(wú)目的條帶，不能對(duì)試驗(yàn)條件下保存的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)是該方法的一大缺陷。李紅霞等(2007)運(yùn)用RT-PCR方法對(duì)采自甘肅的南瓜果實(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果證明果實(shí)中存在CGMMV病毒。Slavokhotov等(2007)針對(duì)CP基因設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法檢測(cè)到了分離自俄羅斯的兩個(gè)CGMMV病毒株系。Chang等(2005)采用RT-PCR方法從韓國(guó)西瓜葉片中檢測(cè)出CGMMV病毒，得到646bp的CP基因，明確為 CGMMV-HYI 株系。鄧叢良等(2008)將納米磁珠(Magnetic Nano Particles, MNP)和RT-PCR結(jié)合，建立了檢測(cè)CGMMV的新方法。用納米磁珠提取陽(yáng)性材料中的RNA，用三組引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)CGMMV并進(jìn)行靈敏度測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法可以檢測(cè)出IOng植物葉組織中的CGMMV，靈敏度是常規(guī)檢測(cè)方法的1/10。雖然在RNA提取過(guò)程中節(jié)省了時(shí)間和步驟，但是該方法依賴(lài)高靈敏度的抗體，提高了成本，且在檢測(cè)靈敏度并沒(méi)有良好的改觀，所以普及和運(yùn)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種針對(duì)CGMMV的運(yùn)動(dòng)蛋白基因(MP gene)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物和熒光探針，并優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，建立了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR快速檢測(cè)CGMMV病毒的方法。特異性測(cè)試結(jié)果表明該方法具有很強(qiáng)的特異性，可以從TMV屬中10多種病毒中特異性檢出CGMMV病毒，并且可同時(shí)檢測(cè)四個(gè)CGMMV的不同分離物。該方法靈敏性遠(yuǎn)高于常規(guī)RT-PCR方法的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)該方法也可直接運(yùn)用于葫蘆科帶毒種子的檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。1996年美國(guó)Applied Biosystems公司推出實(shí)時(shí)突光定量PCR技術(shù)(Real - timefluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q - PCR)，即在PCR檢測(cè)過(guò)程中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性強(qiáng)、快速高效、成本低廉、自動(dòng)化程度高、有效解決PCR污染問(wèn)題等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于 人類(lèi)疾病、動(dòng)物病毒、及動(dòng)植物疾病檢測(cè)和預(yù)防等諸多領(lǐng)域。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是該基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用探針和弓I物組合包括上游弓I物MMV-Fl、下游引物MMV-Rl和熒光探針MMV-1，其序列分別如下
MMV-Fl :5’ - CACCTTTATGTCACATTGTTG-3’ ；
MMV-Rl :5’ - GAATGCATCCTTGTGTCAAC -3’ ；
MMV-1 :5’ -FAM-CTACAGGATTCCGGTACGTTCCAT-TAMRA-3’。所述基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法包括以下步驟
(1)取待測(cè)樣品提取植物組織總RNA；
(2)以總RNA為模板，引入所述下游引物MMV-Rl進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成；
(3)將所述上游引物MMV-Fl、所述下游引物MMV-Rl和所述熒光探針MMV-1置于熒光PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
(4)反應(yīng)結(jié)束后，熒光PCR儀讀取CT值并判斷檢測(cè)結(jié)果。在上述步驟(2)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成時(shí)，其反應(yīng)體系為T(mén)otal RNA
2.5 ii L，5 X PCR 緩沖液 2iiL，dNTP I y L，下游引物 MMV-Rl (10 u mol/L) 2 y L，反轉(zhuǎn)錄酶
0.L，加 ddH20 至總體系 IOii L ;反應(yīng)條件37°C 15min，85°C 5sec，16°C 30sec，反應(yīng)結(jié)束后將模板于_4°C保存?zhèn)溆谩Ｔ谏鲜霾襟E(3)中的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為2Xpremix Taq(Real Time)混合反應(yīng)液 10 u L，上下游引物(MMV-F1, MMV-Rl, 10 u mol/L)各1. 25 y L，熒光探針MMV-1 I u L，模板 cDNA 2iiL，加 ddH20 補(bǔ)足到 20iiL;反應(yīng)條件為95° C，30s;95。C 5s,60° C 30s，45個(gè)循環(huán)。上述步驟中，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度范圍為
0.1 0. 8 u mol/L。進(jìn)一步地，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度均為
0.5 u mol/L。所述熒光探針MMV-1的濃度范圍為0. 05 0. 5 ii mol/L。更進(jìn)一步地，所述熒光探針MMV-1的濃度范圍為0. 25 U mol/L。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明針對(duì)檢疫性有害生物黃瓜綠斑駁花葉病毒(.Ccucumber green mottle mosaic virus，CGMMV),設(shè)計(jì)了特異性引物和突光探針,建立了實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)CGMMV的方法，并將該方法直接運(yùn)用于帶毒種子的檢測(cè)。該方法具有快速準(zhǔn)確、靈敏度高、并且全程閉管，無(wú)需電泳檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，減少了有毒試劑的接觸，檢測(cè)時(shí)間也縮減到2個(gè)小時(shí)之內(nèi)，極大的提高了效率。整個(gè)過(guò)程采用熒光信號(hào)放大及計(jì)算機(jī)全程控制，減少人為誤差，提高了靈敏度，試驗(yàn)證明該方法比體系優(yōu)化過(guò)的普通RT-PCR靈敏度要高近100倍，適用于病毒低含量的檢測(cè)。


圖1是實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)CGMMV特異性檢測(cè)結(jié)果分析示意圖，其中，C4 :來(lái)自廣東雷州的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-GD-LZ)，D4 :來(lái)自廣東高州的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-GD-GZ), E4 :來(lái)自廣州陸豐的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-( -LF)，E5 :來(lái)自Agdia的黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-DIA)，F(xiàn)4 :番茄花葉病毒(ToMV)，G4 :齒舌蘭環(huán)斑病毒(0RSV)，H4 :番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)，F(xiàn)5 =Kyuri綠斑駁花葉病毒(KGMMV)，G5 :小西葫蘆綠斑駁花葉病毒(ZGMMV)，H5 :煙草花葉病毒(TMV)，F(xiàn)6 :西瓜花葉病毒2號(hào)(WMV-2)，G6 :辣椒輕斑駁病毒(PMMV)，H6 :車(chē)前草花葉病毒(RMV)，F(xiàn)7 :土傳小麥花葉病毒(WSBMV)，G7 :標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，H7 :水對(duì)照組；
圖2是帶毒種子中CGMMV病毒檢測(cè)結(jié)果分析示意圖，其中，D7:黃瓜帶毒種子I(CGMMV-Cul ),D8 :黃瓜帶毒種子 2 (CGMMV_Cu2)，D9 :黃瓜帶毒種子(CGMMV-Sq)，DlO :西葫蘆帶毒種子(CGMMV-Pu)，GlO :黃瓜綠斑駁花葉病毒(CGMMV-GD-LZ)對(duì)照組，Gll :標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，Dll :水對(duì)照組；
圖3是所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)CGMMV靈敏度的動(dòng)力學(xué)曲線，其中，1-2 :CGMMV病毒10倍稀釋液；3_4 102倍稀釋液；5-6 103倍稀釋液；7-8 IO4倍稀釋液；9_10 105倍稀釋液；11-12 :1O6倍稀釋液；13-14 :1O7倍稀釋液；
圖4是所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)CGMMV靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明。該基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法包括以下步驟
一、選擇供試驗(yàn)材料。本發(fā)明采用的供試驗(yàn)的病毒樣品見(jiàn)表I。表I供試驗(yàn)病毒樣品
權(quán)利要求
1.一種基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用探針和引物組合，其特征在于，它包括上游引物MMV-F1、下游引物MMV-Rl和熒光探針MMV-1，其序列分別如下MMV-Fl :5’ - CACCTTTATGTCACATTGTTG-3’ ；MMV-Rl :5’ - GAATGCATCCTTGTGTCAAC -3’ ；MMV-1 :5’ -FAM-CTACAGGATTCCGGTACGTTCCAT-TAMRA-3’。
2.一種基于MP基因的利用如權(quán)利要求1所述的探針和引物組合對(duì)黃瓜綠斑駁花葉病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)取待測(cè)樣品提取植物組織總RNA； (2)以總RNA為模板，引入所述下游引物MMV-Rl進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成； (3)將所述上游引物MMV-Fl、所述下游引物MMV-Rl和所述熒光探針MMV-1置于熒光PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)； (4)反應(yīng)結(jié)束后，熒光PCR儀讀取CT值并判斷檢測(cè)結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，在所述步驟(2)中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成時(shí)，其反應(yīng)體系為T(mén)otal RNA2. 5u L, 5父？0 緩沖液21^，(1見(jiàn)13 I yL，下游引物 MMV-Rl (10umol/L) 2 y L，反轉(zhuǎn)錄酶0. L，加 ddH20 至總體系 IOii L ;反應(yīng)條件37°C 15min，85°C 5sec，16°C 30sec，反應(yīng)結(jié)束后將模板于_4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，在所述步驟(3)中的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為2Xpremix Taq(Real Time)混合反應(yīng)液IOii L，上下游引物(MMV-F1,MMV-R1,10 u mol/L)各1. 25 y L，熒光探針MMV-1luL，模板 cDNA L，加 ddH20 補(bǔ)足到 20ii L ;反應(yīng)條件為95° C，30s;95。C 5s，60。C30s, 45個(gè)循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度范圍為0.1 0. 8iimol/L，所述熒光探針MMV-1的濃度范圍為0. 05 0. 5 y mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述上游引物MMV-Fl和所述下游引物MMV-Rl的使用濃度均為0. 5 y mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于MP基因的黃瓜綠斑駁花葉病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光探針MMV-1的濃度為0. 25 u mol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于運(yùn)動(dòng)蛋白基因(MovementProtein,MP)的黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemoasicvirus,CGMMV)快速分子鑒定的PCR檢測(cè)方法及在該方法中應(yīng)用到的引物和探針組合。本發(fā)明采用的引物和探針序列分別為上游引物MMV-F1、下游引物MMV-R1和熒光探針MMV-1；本發(fā)明方法包括以下步驟(1)取待測(cè)樣品提取植物組織總RNA，(2)以總RNA為模板，引入所述下游引物MMV-R1進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄模板cDNA的合成，(3)將所述上、下游引物和所述熒光探針置于熒光PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，(4)反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)收集的熒光曲線CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線CT值比較，判斷檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明可應(yīng)用于生物物種分子診斷領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103060476SQ201310026978
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 廖力, 王嵐, 梁玉英, 權(quán)永兵, 遲遠(yuǎn)麗, 徐淼鋒 申請(qǐng)人:張衛(wèi)東, 廖力, 王嵐, 梁玉英, 權(quán)永兵, 遲遠(yuǎn)麗, 徐淼鋒