專利名稱：與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及黃瓜常規(guī)雜交育種、分子標(biāo)記輔助育種的方法與技術(shù)，特別涉及與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段。
背景技術(shù)：
1999年秋天在45株黃瓜育種材料中發(fā)現(xiàn)了 3株具“無毛”性狀的突變體，遺傳研究表明，無毛性狀是由一對(duì)核基因控制的隱性性狀，與曹辰興(1999年)的研究結(jié)果相一致。黃瓜無毛突變體與普通黃瓜相比，幼苗的各種性狀均沒有明顯變化，整株任何地方均無短剛毛，手感光滑，無扎手感覺，此特點(diǎn)在幼苗子葉展平時(shí)就可以與普通黃瓜苗區(qū)分。 黃瓜無毛突變體最早由Robinson和Mishanec (1964)報(bào)道(通過福射誘變產(chǎn)生)，表現(xiàn)為莖、葉、卷須、花萼、子房均沒有表皮毛，果實(shí)表面也沒有果刺和果瘤，并將該隱性突變基因命名為glabrous (gl)。Whelan (1973)、曹辰興和郭紅蕓(1999)也先后發(fā)現(xiàn)黃瓜無毛突變體。Inggamer&Ponti (1980)報(bào)道的葉片無毛突變體(gl_2)黃瓜NCG-042表現(xiàn)為果柄、花柄、花萼上有稀疏的絨毛，果實(shí)上有稀少的果瘤，但是莖、葉及葉柄光滑無毛。研究表明，無毛基因?qū)龌虼嬖陔[性上位作用，參與黃瓜果瘤的形成(曹辰興等，2001 )。關(guān)媛(2008)利用棉花和擬南芥TTGl基因?qū)S瓜進(jìn)行同源克隆，得到一個(gè)黃瓜TTGl-Iike基因——CsTTGl，功能驗(yàn)證表明CsTTGl可以互補(bǔ)擬南芥ttgl突變體的表型，但是表達(dá)分析證明引起gl突變的基因不是黃瓜TTGl-Iike基因。張弛等(2009)以曹辰興和郭紅蕓發(fā)現(xiàn)的無毛突變體和普通有毛黃瓜為親本，獲得了兩個(gè)與gl基因連鎖的SRAP標(biāo)記ME6EM5和ME230D15，遺傳距離分別為3. 6cM和12. 9cM。苗晗等(2011)以黃瓜有毛野生類型‘9110Gt’ (Pl)和無毛突變體‘NCG-042’ (P2)(含有葉片無毛基因gl_2)為試材，明確了黃瓜的有毛、無毛性狀(gl-2)由一對(duì)核基因控制，有毛對(duì)無毛為顯性。并以F2為作圖群體，構(gòu)建了包含18個(gè)SSR標(biāo)記的gl-2基因的SSR連鎖群，并將該基因定位在黃瓜第2條染色體上，兩側(cè)最近的連鎖標(biāo)記為SSR10522和SSR13275，遺傳距離分別為O. 6cM和3. 8cM。由于無毛性狀是由一對(duì)核基因控制的隱性性狀，非常適合作為形態(tài)標(biāo)記、純度鑒定的標(biāo)記性狀。因此，對(duì)黃瓜無毛性狀的研究，特別是確定與黃瓜有毛基因緊密連鎖的SSR片段對(duì)黃瓜生產(chǎn)和育種都具有重要的理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段，所述基因片段是SEQ ID No. I所述的序列。上述基因片段在對(duì)黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行有毛性狀篩選或?qū)S瓜有毛性狀進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的用途。
利用本發(fā)明的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段對(duì)構(gòu)建的F2代分離群體和黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行有毛性狀評(píng)價(jià)，其結(jié)果與表型鑒定符合率達(dá)100% (數(shù)據(jù)見表1)，在黃瓜育種中進(jìn)行資源有毛性狀篩選和利用具有很大的應(yīng)用價(jià)值。以這些序列為依據(jù)，可以進(jìn)行有毛性狀分子標(biāo)記輔助選擇、育種；可以為進(jìn)行黃瓜有毛基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的性狀奠定基礎(chǔ)。


圖I是本發(fā)明的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段的獲得圖譜其中A(M)為指示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶的Marker ^(P1)為母本F80有毛基因片段；1_5為有毛單株；6_10為無毛單株，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)。圖2是F80 XF80WM雜交后代F2代分離情況圖譜其中A (M)為DNA標(biāo)準(zhǔn)；C為F2群體中有毛基因片段，I 32、42 53、78 93為有毛單株，33 41、54 77為無毛單株。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是在對(duì)黃瓜有毛親本F80和無毛親本F80WM及其雜交后代F1、F2、BC1群體進(jìn)行人工觀察鑒定，獲得黃瓜無毛種質(zhì)的基礎(chǔ)上，采用SSR技術(shù)分離與黃瓜有毛基因連鎖的基因片段，進(jìn)行測(cè)序、分析，為種質(zhì)資源的篩選、分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用SSR (Simple sequence repeat)分子標(biāo)記技術(shù)，采用BSA法對(duì)黃瓜種質(zhì)F80的有毛相關(guān)基因和黃瓜種質(zhì)F80WM的相關(guān)基因進(jìn)行了分子標(biāo)記研究。獲得與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因DNA片段I個(gè)，對(duì)這個(gè)片段測(cè)序后，其大小為164bp (SEQ ID No. I所述的核苷酸序列)。本發(fā)明獲得的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因序列的具體操作步驟如下I. F2分離群體的構(gòu)建及表型鑒定利用黃瓜有毛親本F80和無毛親本F80麗雜交獲得F1, F1自交獲得F2。田間種植F2群體，正常管理。第2真葉時(shí)肉眼觀察并借助顯微鏡觀察F2單株分離情況。2. DNA提取及SSR分析體系剪取黃瓜幼嫩小葉，采用CTAB法單株提取DNA，_20°C保存。PCR 反應(yīng)體系為 20 μ I，黃瓜基因組 DNA20ng、SSR 引物各 50ng、dNTPO. 2mM、Mg2+1. 5mM、l倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶I. 6單位；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性300秒，94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，35個(gè)循環(huán)，再72 °C延伸350秒。3. SSR弓丨物篩選和驗(yàn)證在抗感親本間篩選1164對(duì)SSR引物和29對(duì)EST-SSR引物，在雙親間產(chǎn)生多態(tài)性的引物15對(duì)，其中引物SSRO1647在兩親本以及F2極端個(gè)體單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一個(gè)顯性SSR標(biāo)記，用該引物組合分別對(duì)組外的其它F2單株以及育種和生產(chǎn)上的有毛高代自交系進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步確認(rèn)所篩選到的標(biāo)記。結(jié)果表明有毛親本和有毛單株擴(kuò)增出164bp的特異片段，無毛親本和無毛單株未擴(kuò)增出該特異片段。經(jīng)組外其余F2單株和育種自交系分析，所篩選到的標(biāo)記與目標(biāo)基因一黃瓜有毛性狀相關(guān)基因緊密連鎖，符合率為100%。所用SSR引物SSRO1647的堿基序列為
Pl:5，-CACCCTCTCACTTGTAGCCC-3 丨(SEQ ID No.2)P2 5' -CGATCAGAAGGGGGAAAAA-3 ; (SEQ ID No. 3)4. PCR產(chǎn)物的回收和測(cè)序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察。采用煮沸法將目的片段從銀染膠上回收、擴(kuò)增，送至北京三博遠(yuǎn)志生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。5.序列分析根據(jù)測(cè)序結(jié)果，與黃瓜有毛基因緊密連鎖的特異片段有164個(gè)堿基(SEQ ID No. I·所示)。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I采用BSA法，以黃瓜有毛親本F80和無毛親本F80WM及其184株F1代分離群體為試材，采用CTAB法提取黃瓜基因組DNA。以1164對(duì)SSR引物和29對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)特異DNA片段在F2代分離群體中的表現(xiàn)情況，對(duì)照以上的苗期人工表型鑒定結(jié)果，獲得與黃瓜有毛基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記SSR01647以及與有毛基因緊密連鎖的DNA片段(SEQ ID No. I 所示)。實(shí)施例2用保存于天津科潤黃瓜研究所育種一室的有毛黃瓜種質(zhì)資源W43、G5、XL6_1_2、Q12、P57-1、P59-1-1、P60-1-1、P62-l-l、66、F51、Q6、Q21 等。根據(jù)實(shí)施例 I 獲得的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的SSR特異弓I物SSRO1647，對(duì)上述黃瓜材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)164bp的特異片段的材料，為有毛黃瓜資源；凡未擴(kuò)增出164bp產(chǎn)物特異片段的材料，為無毛黃瓜資源。表IF2單株表型及標(biāo)記分離統(tǒng)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段，其特征是所述基因片段是SEQ ID No. I所述的序列。
2.權(quán)利要求I所述基因片段在對(duì)黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行有毛性狀篩選或?qū)S瓜有毛性狀進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段及用途，所述基因片段是SEQ ID No.1所述的序列。利用本發(fā)明的與黃瓜有毛基因緊密連鎖的基因片段對(duì)構(gòu)建的F2代分離群體和黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行有毛性狀評(píng)價(jià)，其結(jié)果與表型鑒定符合率達(dá)100%，在黃瓜育種中進(jìn)行資源有毛性狀篩選和利用具有很大的應(yīng)用價(jià)值。以這些序列為依據(jù)，可以進(jìn)行有毛性狀分子標(biāo)記輔助選擇、育種；可以為進(jìn)行黃瓜有毛基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的性狀奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102757959SQ20121026013
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者李淑菊, 楊瑞環(huán), 王惠哲, 管煒 申請(qǐng)人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司