黃瓜抗番木瓜環(huán)斑病毒病基因prsv的Indel標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明“黃瓜抗番木瓜環(huán)斑病毒病基因prsv的Indel標(biāo)記及其應(yīng)用，”涉及生物技術(shù)輔助育種領(lǐng)域。黃瓜番木瓜環(huán)斑病毒病(PRSV)抗性基因prsv緊密連鎖的Indel標(biāo)記，其特征在于：prsvInde2-F/prsvInde2-R:CTTCCCCATCATCATACATC/AAGCAGGAGAATGAAACAAC；所述Indel標(biāo)記擴(kuò)增的與黃瓜PRSV感病基因PRSV連鎖的特征條帶為176bp，核苷酸序列見Seq ID No.1；所述Indel標(biāo)記擴(kuò)增的與黃瓜PRSV抗病基因prsv連鎖的特征條帶為170bp，核苷酸序列見Seq ID No.2所示；采用本發(fā)明獲得的Indel標(biāo)記，可以在黃瓜候選材料的任何階段判斷其是否對(duì)PRSV具有抗性，該標(biāo)記具有高效、限制少的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)選育抗PRSV的黃瓜育種材料提高了效率，縮短了育種周期。
【專利說明】黃瓜抗番木瓜環(huán)斑病毒病基因 prsv的I nde I標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種黃瓜中抗番木瓜環(huán)斑病毒 基因 prsv的Indel標(biāo)記及其在黃瓜育種材料選擇中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 病毒病是影響黃瓜生產(chǎn)的主要病害之一，病原種類繁多，難以防治。其中番木瓜環(huán) 斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV)就是引起該病的一種主要病原。PRSV是一種以蟲牙 蟲傳播為主的馬鈴薯Y病毒屬病毒，一般在夏末秋初時(shí)傳播較快，因?yàn)樵谶@個(gè)時(shí)候攜帶病 源蚜蟲數(shù)量的增加大大提高了病毒的蔓延速率，一旦植株染上病毒病，一般可減產(chǎn)10%? 20 %，重者可達(dá)40 %?50 %，甚至絕產(chǎn)，而且嚴(yán)重降低了瓜類商品品質(zhì)。
[0003] 目前，已經(jīng)挖掘了一些抗PRSV的黃瓜種質(zhì)資源，而且前人也利用了其中一些抗病 材料對(duì)黃瓜PRSV抗性遺傳規(guī)律及分子標(biāo)記進(jìn)行了初步研究，Wang等（1984)利用黃瓜抗病 材料Surinam Local和感病材料Wisconsin2757雜交得出PRSV-W受一對(duì)隱性基因 prsv-1 控制；Wai和Grumet (1995b)在TMG-I中發(fā)現(xiàn)PRSV抗性是由單顯性基因 PRSV-2決定的；隨 后，Wai等（1997)證實(shí)prsv-Ι和PRSV-2互為等位基因；張海英等（2005)以感病親本自交 系歐洲八號(hào)、抗病親本自交系秋棚構(gòu)建的RILs群體為材料，對(duì)PRSV-W進(jìn)行了抗病性鑒定， 研究表明抗病性狀是受隱性單基因控制的，但同時(shí)也存在微效基因的修飾。目前報(bào)道的與 PRSV抗性相關(guān)的遺傳連鎖標(biāo)記有AFLP、RAPD標(biāo)記，但是這些標(biāo)記與抗病基因連鎖距離較 遠(yuǎn)，且尚未將其定位在染色體上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明基于上述領(lǐng)域的不足，提供了與黃瓜中抗PRSV基因 prsv緊密連鎖的Indel 標(biāo)記，并提供了該標(biāo)記在篩選對(duì)PRSV抗感的黃瓜種質(zhì)資源上的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種與黃瓜中抗番木瓜環(huán)斑病毒基因 prsv連鎖的Indel標(biāo)記，其特征在于：所述 標(biāo)記的引物的核苷酸序列如下：
[0007] prsvInde2-F/prsvInde2-R ：
[0008] CTTCCCCATCATCATACATC/AAGCAGGAGAATGAAACAAC ；
[0009] 所述引物擴(kuò)增的與黃瓜中感番木瓜環(huán)斑病毒基因 PRSV連鎖的特征條帶為176bp， 其核苷酸序列如Seq ID No. 1所示；
[0010] 所述引物擴(kuò)增的與黃瓜中抗番木瓜環(huán)斑病毒基因 prsv連鎖的特征條帶為170bp， 其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0011] 所述Indel標(biāo)記在篩選具有抗番木瓜環(huán)斑病毒基因 prsv的黃瓜種質(zhì)資源中的應(yīng) 用，其步驟如下：
[0012] (1)采用上述Indel標(biāo)記的引物對(duì)待選黃瓜材料的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] (2)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測；
[0014] (3)從檢測結(jié)果中篩選出現(xiàn)與抗番木瓜環(huán)斑病毒基因 prSV連鎖的Indel標(biāo)記特征 條帶一致的材料。
[0015] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：1. 5ng/ul DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/ul， 0· 5 μ L/ul Go TaqK Green Master Mix，其余為雙蒸水。
[0016] 所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒，72°C 延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72 °C保溫5分鐘，16 °C保存。
[0017] 所述凝膠電泳檢測，指采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分 離，最后銀染顯色。
[0018] 本發(fā)明以感PRSV高代自交系65G與抗PRSV高代自交系02245為親本構(gòu)建Fl、F2 群體及F2:3家系，通過苗期人工接種鑒定和ELISA檢測，對(duì)黃瓜PRSV抗性基因 prsv進(jìn)行 了遺傳規(guī)律分析。以F2群體為作圖材料，利用BSA法和SSR及Indel標(biāo)記技術(shù)，實(shí)現(xiàn)prsv 基因在染色體上的遺傳定位，并獲得緊密連鎖的Indel標(biāo)記prsvlndel2,與prsv的遺傳距 離為I. 6cM。所述Indel標(biāo)記擴(kuò)增的與黃瓜PRSV感病基因 PRSV連鎖的特征條帶為176bp， 核苷酸序列如Seq ID No. 1 ;所述Indel標(biāo)記擴(kuò)增的與黃瓜PRSV抗病基因 prsv連鎖的特 征條帶為170bp，核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0019] 本發(fā)明通過利用35份不同遺傳背景的黃瓜資源進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明prSVIndel2 驗(yàn)證的正確率為85. 7%，而對(duì)其中的24份抗性材料驗(yàn)證的正確率高達(dá)95. 8%。
[0020] 本試驗(yàn)不僅為黃瓜抗PRSV基因 prsv的精細(xì)定位和分子克隆奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也 為利用分子標(biāo)記輔助選育具有抗PRSV基因的黃瓜新品種提供了高效途徑。本發(fā)明基于開 發(fā)的Indel標(biāo)記引物提供用于輔助篩選具有特定PRSV抗性的黃瓜新品種的方法，該方法 中，采用Indel標(biāo)記引物擴(kuò)增待測材料的DNA，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物可 能出現(xiàn)三種情況：第一種是僅僅出現(xiàn)一條170bp條帶，這種為隱型純合材料（抗PRSV);另 一種是170bp條帶和176bp條帶都出現(xiàn)，這種是顯性雜合材料（感PRSV);第三種是僅僅出 現(xiàn)176bp條帶，這種為顯性純合材料（感PRSV)。通過本發(fā)明提供的方法，可以在黃瓜候選 材料的任何階段對(duì)其進(jìn)行PRSV抗性鑒定和篩選，具有高效、限制少、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1.是用？^￥111(1612標(biāo)記驗(yàn)證黃瓜親本材料656(?1)、02245(?2)、？1以及？2群 體隨機(jī)單株的部分電泳檢測結(jié)果；其中，Pl :65G (感PRSV) ;P2:02245(抗PRSV);紅色字體 對(duì)應(yīng)的泳道為表型與標(biāo)記條帶驗(yàn)證不一致的單株。
[0022] 圖2.是prsvlndel2標(biāo)記驗(yàn)證35份不同遺傳背景的黃瓜材料的電泳檢測結(jié)果；紅 色字體對(duì)應(yīng)的泳道為表型與標(biāo)記條帶驗(yàn)證不一致的單株。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但并不限制本發(fā)明的范 圍。如無特殊說明，下述實(shí)施例中使用的操作均為常規(guī)方法，所采用的試劑均可以商購獲 得。
[0024] 生物材料的來源和記載出處
[0025] 本研究所用的試驗(yàn)材料為黃瓜高代自交系65G和02245。以65G為母本，228為父 本雜交，獲得Fl，自交獲得F2群體及F2:3家系。
[0026] 黃瓜高代自交系65G(Pl):由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育的歐洲溫室型 黃瓜雌性系，生長勢強(qiáng)，連續(xù)座果多，瓜長20多厘米，表面光滑無刺瘤，無苦味，抗黑星病， 感番木瓜環(huán)斑病毒?。≒RSV)。為現(xiàn)有已知品種，在顧興芳等人于2006年在《園藝學(xué)報(bào)》第 3期第690頁上發(fā)表的文章《黃瓜新品種'中農(nóng)19號(hào)'》中也有記載。本實(shí)驗(yàn)室有保存，保 證自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
[0027] 黃瓜高代自交系02245 (P2):由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育的露地耐熱 抗病自交系，華北型黃瓜，耐熱性突出，分枝性強(qiáng)，腰瓜長約35厘米，刺瘤密，抗番木瓜環(huán)斑 病毒?。≒RSV)，抗霜霉病，白粉病，枯萎病。為現(xiàn)有已知品種，在顧興芳等人于2008年在《中 國蔬菜》第6期第31-33頁發(fā)表的文章《耐熱黃瓜新品種中農(nóng)106號(hào)的選育》中也有記載。 本實(shí)驗(yàn)室有保存，保證自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
[0028] 35份不同遺傳背景的黃瓜材料的具體來源和出處詳見Zhang等于2010年在 ((Journal of the American Society for Horticultural Science〉〉第 135 期第 53-58 頁 發(fā)表的文章 《Genetic Mapping of the Scab Resistance Gene in Cucumber》。其中 24 份 為抗性材料，11份為感病材料。本實(shí)驗(yàn)室有保存，保證自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
[0029] 主要試劑
[0030] 重測序的基因組信息詳見Qi等在《Nature Genetics》雜志2013年發(fā)表的論文 ((A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity))
[0031] Indel標(biāo)記引物是本實(shí)驗(yàn)室基于兩親本重測序的基因組信息、利用primer3. 0軟 件設(shè)計(jì)得到。
[0032] SSR引物來自國際黃瓜基因組計(jì)劃（CUGI) ;PCR實(shí)驗(yàn)使用Shanghai PromeGa公司 的 GoTaq Green Master Mix ;
[0033] 凝膠電泳使用康潤公司的40%非變性聚丙烯酰胺，將其稀釋至6%后使用。
[0034] 實(shí)施例1.與黃瓜抗PRSV基因 prsv連鎖的prsvlndel2標(biāo)記的獲得
[0035] 步驟1.黃瓜PRSV苗期抗性鑒定
[0036] 本試驗(yàn)以黃瓜高代自交系65G(感病）和02245(抗?。槟副竞透副?，自交獲得 Fl、F2群體及F2:3家系。2013年秋，在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所病理課題組人工氣 候室對(duì)Fl及144個(gè)F2:3家系進(jìn)行PRSV苗期人工摩擦接種，其中每個(gè)家系種植15株，待第 一片真葉展平時(shí)，進(jìn)行接種鑒定。
[0037] 待第一次接種20天后，進(jìn)行調(diào)查，在調(diào)查中，將病情劃分為6個(gè)等級(jí)，分別為：0 級(jí)，無癥狀；1級(jí)，心葉明脈或輕花葉；3級(jí)，心葉及中部葉片花葉；5級(jí)，心葉及中部葉片花 葉，少數(shù)葉片畸形、皺縮；7級(jí)，重花葉，多數(shù)葉片畸形、皺縮；9級(jí)，重花葉，葉片明顯畸形， 植株矮化，甚至死亡。同時(shí)為了檢測接種植株中病毒的含量，在調(diào)查后，采用了酶聯(lián)免疫吸 附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)方法對(duì)黃瓜植株的心葉中的病毒含量 進(jìn)行檢測。根據(jù)調(diào)查及ELISA檢測結(jié)果判斷植株對(duì)PRSV是否有抗性，然后使用Microsoft E XCel2003及SAS8. 0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，判斷分離比。
[0038] 結(jié)果顯不：后代Fl均表現(xiàn)感??；由F2:3豕系鑒定結(jié)果，可推斷在F2群體中，感病 植株有114株，抗病植株有30株。經(jīng)卡方檢測，符合3:1比例，表明在該群體中PRSV抗性 是受一對(duì)隱性基因控制。
[0039] 步驟2. DNA提取和分子標(biāo)記分析
[0040] 取黃瓜植株的嫩葉，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）法提取親本及群體 各單株的基因組DNA。
[0041] PCR反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體系IOyL, 3μ L DNA(5. Ong · μ L-1)，正向和反向引物 (50ng · μ L-1)各 1 μ L，5 μ L Go Taq? Green Master Mix (Promega 公司產(chǎn)品）。
[0042] 引物使用黃瓜全基因測序開發(fā)的SSR引物（Ren et al. ,2009 ;Cavagnaro et al.， 2010)。
[0043] PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，35 個(gè)循環(huán)；72°C保溫 5min，16°C forever。
[0044] 擴(kuò)增產(chǎn)物用6 %非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳緩沖液為0. 5 X TBE，150V恒功 率電泳分離I. 5h，電泳后銀染顯色，統(tǒng)計(jì)帶型。
[0045] 步驟3.初步定位的SSR分子標(biāo)記篩選、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及連鎖圖構(gòu)建
[0046] 共顯性標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)方法：與母本（65G) -致的帶型記為a，與父本（02245) -致的 帶型記為b，雜合的帶型記為h。顯性標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)方法：若母本為顯性標(biāo)記，則分離群體中和 母本帶型一致的單株記為d，和父本帶型一致的記為b ;若父本為顯性標(biāo)記，則分離群體中 和母本帶型一致的單株記為a，和父本帶型一致的記為c，未擴(kuò)增出的或模糊不清的記為u。
[0047] 結(jié)果顯示：
[0048] 用1288對(duì)SSR引物對(duì)Pl (65G)和P2 (02245)進(jìn)行篩選，其中在兩個(gè)親本間表現(xiàn)多 態(tài)的引物有296對(duì)，多態(tài)率23. 0%。
[0049] 結(jié)合BSA法建池，進(jìn)一步篩選得到了 10個(gè)SSR多態(tài)性標(biāo)記。
[0050] 利用篩選出的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)65GX02245組合的F2群體進(jìn)行分析，結(jié)合調(diào)查性狀 數(shù)據(jù)利用J〇inmap4. 0構(gòu)建連鎖圖。結(jié)果10個(gè)標(biāo)記和目標(biāo)性狀（抗PRSV)基因 prsv被定 位在同一連鎖群上（L0D = 8)。
[0051] 將本試驗(yàn)得到的連鎖圖與已發(fā)表的黃瓜遺傳圖譜（Zhang et al.，2012)比較，發(fā) 現(xiàn)本連鎖群的10對(duì)標(biāo)記均分布在第6染色體，據(jù)此將prsv基因定位在第6染色體上。
[0052] 步驟4. Indel標(biāo)記開發(fā)及prsv連鎖群分子標(biāo)記加密
[0053] 針對(duì)初定位的染色體區(qū)段，結(jié)合黃瓜基因組序列和兩親本重測序的數(shù)據(jù)，利用 primer3. 0軟件在目標(biāo)區(qū)段（約3. 4M)共設(shè)計(jì)了 41對(duì)SSR標(biāo)記引物和9對(duì)Indel標(biāo)記引 物，對(duì)連鎖群進(jìn)行分析標(biāo)記加密。用雙親篩選出有多態(tài)性的有6對(duì)標(biāo)記。上群體后得到一個(gè) 總產(chǎn)度為42. 7cM包含16個(gè)標(biāo)記的連鎖群，獲得與黃瓜抗PRSV基因 prsv連鎖距離為I. 6cM 的 Indel 標(biāo)記 prsvlndel2。
[0054] 步驟5. PCR擴(kuò)增所得差異片段的回收純化及測序
[0055] (1)目的片段的回收
[0056] 采用煮沸法。具體操作為：先從膠上將目標(biāo)條帶挖下來裝入I. 5mL的Eppendorf 管內(nèi)，向管內(nèi)加入100 μ L超純水，加水量視膠帶顏色深淺而定；常溫下浸泡24h，轉(zhuǎn)入95°C 水浴鍋（或PCR儀）中煮30min后，5000rpm離心3min。產(chǎn)物即可取上清3 μ L做模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，剩余產(chǎn)物置-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0057] (2)目的片段的純化
[0058] 用PCR產(chǎn)物直接純化方法。在PCR產(chǎn)物中加入2倍體積的無水乙醇，_20°C過夜放 置，1，2000rpm離心5min就可以得到純化產(chǎn)物。
[0059] (3)目的片段與載體的連接
[0060] 反應(yīng)體系為 10 μ L :PMD18_T VectorL 0 μ L ;Ligation buffer I 5. 0 μ L ;目的片 段 4· Ομ L。
[0061] 在超凈工作臺(tái)上加樣，混勻反應(yīng)物，短暫離心，16°C連接約lh，過夜也不影響連接 效率。
[0062] (4)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0063] 1)取出感受態(tài)細(xì)胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；
[0064] 2)感受態(tài)（50 μ L) +5 μ LSolutionA+4 μ LSolutionB+46 μ L 預(yù)冷去離子水；
[0065] 3)用冷卻的無菌槍頭將上述懸浮液分裝到I. 5mL離心管，每管加入105 μ L，再加 入5 μ L的目的DNA，輕旋混勻；
[0066] 4) 42°C水浴熱激90s，注意不要晃動(dòng)離心管；
[0067] 5)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3?5min ;
[0068] 6)加入500 μ L LB液體培養(yǎng)基。在37°C，150rpm搖床上預(yù)培養(yǎng)Ih ;
[0069] 7)將菌液涂布到含有 100 μ g · mL-lAmp、25 μ g · mL-lIPTG 和 40 μ g · mL-lX-GAL 的LB固體培養(yǎng)基上，用一無菌的彎頭玻棒輕輕的將菌液均勻涂開，置于室溫直至液體被吸 收；
[0070] 8)倒置平板，37°C培養(yǎng)12?16h。
[0071] (5)重組質(zhì)粒的藍(lán)白斑篩選
[0072] 經(jīng)37°C培養(yǎng)后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出現(xiàn)少量藍(lán)色菌落和較多的白色 菌落，其中白色菌落為重組克隆子。挑取白色單菌落涂抹在劃好方格的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C，150rpm過夜培養(yǎng)。
[0073] (6)菌落PCR的檢測
[0074] 吸取1 μ L菌液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取4 μ L PCR產(chǎn)物，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳檢測，與PCR Marker標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較檢測插入片段的大小，與插入目的片段大小一致 的克隆即為陽性克隆。
[0075] (7)克隆后載體的測序與分析
[0076] 取3個(gè)陽性克隆菌液在甘油（330 μ L甘油中加入1000 μ L菌液）中各保存兩份， 一份-20°C保藏，一份送去測序。
[0077] 其中prsvlndel2標(biāo)記引物prsvInde2_F/prsvInde2-R擴(kuò)增出的與黃瓜感PRSV基 因 PRSV連鎖的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示；與黃瓜抗PRSV基因 prsv連鎖 的特征片段的核苷酸序Seq ID No. 2所示。
[0078] 實(shí)施例2.與黃瓜prsv基因連鎖的prsvlndel2標(biāo)記的驗(yàn)證
[0079] 用對(duì)實(shí)施例1獲得的與prsv基因連鎖的Indel標(biāo)記prsvlndel2對(duì)親本、Fl及123 份F2材料以及35份不同遺傳背景的黃瓜材料（表1)進(jìn)行驗(yàn)證，以確定該標(biāo)記用于分子標(biāo) 記輔助選擇的準(zhǔn)確性。驗(yàn)證采用實(shí)施例1中步驟2中的PCR擴(kuò)增和檢測方法。
[0080] 經(jīng)和所選材料的田間表現(xiàn)型相比，該prsVIndel2標(biāo)記驗(yàn)證123份F2材料，結(jié)果顯 示，共有113個(gè)F2株系的帶型反映的表型數(shù)據(jù)與田間調(diào)查結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為91. 9% (部 分PAGE膠電泳檢測結(jié)果示于圖1)。
[0081] 另夕卜，采用現(xiàn)有已知的35份不同遺傳背景的黃瓜品種材料重復(fù)驗(yàn)證該 prsvlndel2標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這35份材料中共有30個(gè)株系的帶型反映的表型數(shù)據(jù)與田間 調(diào)查結(jié)果一致，經(jīng)計(jì)算準(zhǔn)確率為85. 7%，其中的24份抗性材料驗(yàn)證的準(zhǔn)確率高達(dá)95. 8%。 見圖2。
【權(quán)利要求】
1. 一種與黃瓜中抗番木瓜環(huán)斑病毒基因prsv連鎖的Indel標(biāo)記，其特征在于：所述標(biāo) 記的引物的核苷酸序列如下： prsvInde2-F/prsvInde2-R： CTTCCCCATCATCATACATC/AAGCAGGAGAATGAAACAAC； 所述引物擴(kuò)增的與黃瓜中感番木瓜環(huán)斑病毒基因PRSV連鎖的特征條帶為176bp，其核 苷酸序列如SeqIDNo. 1所示； 所述引物擴(kuò)增的與黃瓜中抗番木瓜環(huán)斑病毒基因prsv連鎖的特征條帶為170bp，其核 苷酸序列如SeqIDNo. 2所示。
2. 權(quán)利要求1所述Indel標(biāo)記在篩選具有抗番木瓜環(huán)斑病毒基因prsv的黃瓜種質(zhì)資 源中的應(yīng)用，其步驟如下： (1) 采用上述Indel標(biāo)記的引物對(duì)待選黃瓜材料的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2) 對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測； (3) 從檢測結(jié)果中篩選出現(xiàn)與抗番木瓜環(huán)斑病毒基因prsv連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶 一致的材料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：I. 5ng/ulDNA模板，所述 引物正向和反向各5ng/ul，0.5yL/ulGoTaq?:GreenMasterMix,其余為雙蒸水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性 15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C保溫5分鐘，16°C保存。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的應(yīng)用：所述凝膠電泳檢測指，采用6%的非變性聚丙烯 酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104313017SQ201410508930
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】顧興芳, 張圣平, 苗晗, 田桂麗, 王燁, 謝丙炎, 楊宇紅 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所