專利名稱：番茄環(huán)斑病毒的rt-lamp檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及番茄環(huán)斑病毒的檢測技術(shù)，具體涉及番茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
背景技術(shù)：
番爺環(huán)斑病毒(Jomato ring spot virus, ToRSV)屬于5[豆花葉病毒科(Comoviridae)線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)的RNA病毒，為我國對外公布的禁止進境檢疫性有害生物，其寄主范圍廣，據(jù)報道可侵染35科105屬157種以上的植物。它是侵染百合、葡萄、蘋果、玫瑰、唐菖蒲、水仙、大麗花、蘭花番茄、菜豆、黃瓜和煙草等經(jīng)濟作物的重要致病病原。目前，國內(nèi)外針對ToRSV的檢測方法，包括鑒別寄主反應(yīng)(生物學(xué)方法)、電鏡觀察、血清學(xué)試驗和核酸雜交以及PCR檢測等分子生物學(xué)手段，PCR檢測復(fù)雜，檢測慢至少要3.5 h，靈敏度較低，檢測結(jié)果判斷較難。由于番茄環(huán)斑病毒的癥狀變化多樣，常有隱癥現(xiàn)象，均給常 規(guī)診斷帶來困難，甚至出現(xiàn)漏檢，需要更加準(zhǔn)確和靈敏的檢測方法。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)作為一種新穎的核酸擴增方法，同樣具有檢測速度快、操作簡單和靈敏度高等優(yōu)點；該技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴增的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速和特異地擴增靶序列。由于LAMP呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高；同時，LAMP識別靶序列上的6 8個特異性位點，其特異性也很強；LAMP只在60°C 65°C進行恒溫擴增，只要水浴鍋即可，無需特殊的儀器，操作非常簡單；而且LAMP的整個檢測反應(yīng)只需1h 2.5 h，檢測周期非常短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測速度快、操作簡單、檢測結(jié)果判斷容易和靈敏度高的番茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:番茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，其步驟如下:
a、總RNA提取:檢測樣品經(jīng)液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進行；
b、RT-LAMP擴增:20μ L的RT-LAMP擴增反應(yīng)體系為2 X反應(yīng)緩沖液10 μ L，濃度5 U/μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量為ddH20，該擴增反應(yīng)體系中，引物F3和B3的終濃度各為0.2 μ M，引物L(fēng)oopl和Loop2的終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP的終濃度各為1.6μΜ,其中引物F3的核苷酸序列為cagggctcga atggcact,引物B3的核苷酸序列Scctctaaaaa ggaggttgct gc,引物 Loopl 的核苷酸序列為 tggcgcaacg ataataaaag g,引物L(fēng)oop2的核苷酸序列為attttggctg acggacaagg,引物FIP的核苷酸序列為ctccaatgtgagactcggca tctttttggg acagcactta caacctgttc,引物 BIP 的核昔酸序列為 cgcatatcaaaggccccatt ttttggtaga aattggtaat gaaaaagcc,反應(yīng)條件為 60 65°C 的恒溫水浴鍋中擴增0.5 I h，得到擴增產(chǎn)物；
C、在擴增產(chǎn)物中加入0.1ii L的熒光染料SYBR green I，若呈綠色則樣品中感染有番茄環(huán)斑病毒，若呈橙紅色則樣品中無番茄環(huán)斑病毒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于番茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，通過樣品RNA提取，RT-LAMP擴增，就可以得到檢測結(jié)果，整個檢測反應(yīng)只需I h 2.5 h，又由于LAMP呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高，靈敏度是RT-PCR檢測的100倍，且無需復(fù)雜的檢測儀器和檢測過程，操作簡單，可現(xiàn)場實時檢測，因此本發(fā)明是一種檢測速度快、操作簡單、檢測結(jié)果判斷容易和靈敏度高的番茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例1
1、根據(jù)GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中已登錄的番爺環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因序列(D12477)，采用Blast程序進行同源性比較，在序列的保守區(qū)，使用PrimerExpress 3.0軟件，設(shè)計得到F3、B3、FIP、BIP、Loopl和Loop2共6條引物，其分別識別外殼蛋白編碼基因的8個位點；引物F3、B3、FIP、BIP、Loopl和Loop2由上海英駿生物技術(shù)公司合成，引物F3的核苷酸序列為cagggctcga atggcact,引物B3的核苷酸序列為cctctaaaaaggaggttgct gc,引物 Loopl 的核苷酸序列為 tggcgcaacg ataataaaag g,引物 Loop2 的核苷酸序列為 attttggctg acggacaagg,引物 FIP 的核苷酸序列為 ctccaatgtg agactcggcatctttttggg acagcactta caacctgttc,引物 BIP 的核苷酸序列為 cgcatatcaa aggccccattttttggtaga aattggtaat gaaaaagcc ；
2、RT-LAMP擴增反應(yīng)體系建立:2X反應(yīng)緩沖液10 u L，濃度5 U/ y L的Bst DNA聚合酶1.5 ii L，濃度5 U/ ii L的AMV RNA聚合酶I y L，樣品總RNAl y L，引物F3和B3終濃度各為0.2 ii M，引物L(fēng)oopl和Loop2終濃度各為0.8 y M，引物FIP和BIP終濃度各為1.6 y M，ddH20補充至20 ii L ; Bst DNA聚合酶和AMV RNA聚合酶均購于北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司；
3、反應(yīng)條件優(yōu)化:用上述RT-LAMP擴增反應(yīng)體系對番茄環(huán)斑病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品(購于美國Agdia公司)進行擴增，擴增反應(yīng)時間分別設(shè)定為:30 min、60 min和90 min，結(jié)果都可以看到沉淀，擴增產(chǎn)物加0.1 ii L的熒光染料SYBR green I (購自上海生物工程公司)，都呈綠色，因此選取30 60 min的反應(yīng)時間；擴增反應(yīng)水浴溫度分別設(shè)定為60°C、63°C和65°C，結(jié)果都可以看到沉淀，擴增產(chǎn)物加0.1 ii L的熒光染料SYBR green I，擴增產(chǎn)物亮度在三個不同溫度之間沒有明顯的差異，所以擴增反應(yīng)溫度優(yōu)選較低60°C ；
4、RT-LAMP特異性試驗:用上述RT-LAMP擴增反應(yīng)體系分別對番茄環(huán)斑病毒二個樣品、煙草環(huán)斑病毒一個樣品(TbAacco ringspotTRSV)、香石竹環(huán)斑病毒一個樣品(.Carnation ringspot virus, CRSV)、黃瓜綠斑駁病毒一個樣品green mottlemosaic Firw1S, CGMMV)、南 芥菜花葉病毒一個樣品 ClraW1S mosaic Firw1S, ArMV)和馬鈴薯V病毒一個樣品virus K, PVV)進行擴增,上述樣品均購于美國Agdia公司，反應(yīng)時間60min，水浴溫度為60°C，結(jié)果番茄環(huán)斑病毒二個樣品都可以看到沉淀，擴增產(chǎn)物加0.1 y L的熒光染料SYBR green I，都呈綠色，其它樣品無沉淀，SYBR green I染色后為橙紅色，說明RT-LAMP擴增反應(yīng)體系對番茄環(huán)斑病毒特異。實施例2
1、2克煙草環(huán)斑病毒陽性百合葉樣品(樣品由上海檢驗檢疫局提供)經(jīng)約50毫升液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑(購自上海生物工程公司)提取總RNA，得到樣品總RNA ;具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進行；
2,RT-LAMP靈敏性試驗:用RT-PCR反應(yīng)體系和上述RT-LAMP擴增反應(yīng)體系分別對樣品總RNA進行擴增反應(yīng)，RT-PCR反應(yīng)體系引物為F3和B3，試劑盒為One-st印RNA PCR kit(購自大連TaKaRa公司)，PCR反應(yīng)條件如下:50°C cDNA合成30 min，94°C預(yù)變性2 min ；94°C變性30 s，58°C復(fù)性30 s，72°C延伸I min，35個循環(huán)；最后72°C延伸5 min。樣品總RNA濃度分別為原液，原 液的10 — \ 10 —2、10 —3、10 —4和10 —5稀釋液，RT-LAMP擴增反應(yīng)時間60min，水浴溫度為60°C，結(jié)果原液及原液的10 — 1和10 —2稀釋液看到沉淀，擴增產(chǎn)物加0.1y L的熒光染料SYBR green I，原液及原液的10 —\ 10 —2、10 —3稀釋液都呈綠色；RT-PCR只有原液有熒光反應(yīng)，因此RT-LAMP擴增靈敏度是RT-PCR的100倍以上，也說明百合葉中感染有番茄環(huán)斑病毒。實施例3
上述RT-LAMP擴增反應(yīng)體系分別對葡萄、蘋果、玫瑰、和水仙葉樣品進行檢測；檢測方法同實施例2，只是水浴溫度為65°C，結(jié)果蘋果葉擴增產(chǎn)物有沉淀，0.1 u L的熒光染料SYBRgreen I后呈綠色，水仙葉擴增產(chǎn)物混濁，0.1 u L的熒光染料SYBR green I后呈綠色，葡萄和玫瑰擴增產(chǎn)物無沉淀，0.1 u L的熒光染料SYBR green I后呈橙紅色，說明蘋果葉和水仙葉中感染有番茄環(huán)斑病毒，葡萄和玫瑰葉中未感染番茄環(huán)斑病毒。
權(quán)利要求
1.茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，其特征在于步驟如下: a、總RNA提取:檢測樣品經(jīng)液氮處理后研碎成粉末狀，用Trizol核酸提取試劑提取總RNA，得到樣品總RNA，具體提取方法依Trizol核酸提取試劑的說明書進行； b、RT-LAMP擴增:20μ L的RT-LAMP擴增反應(yīng)體系為2 X反應(yīng)緩沖液10 μ L，濃度5 U/μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，濃度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，樣品總RNAl μ L，弓丨物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量為ddH20，該擴增反應(yīng)體系中，引物F3和B3的終濃度各為0.2 μ M，引物L(fēng)oopl和Loop2的終濃度各為0.8 μ M，引物FIP和BIP的終濃度各為1.6μΜ,其中引物F3的核苷酸序列為cagggctcga atggcact,引物B3的核苷酸序列Scctctaaaaa ggaggttgct gc,引物 Loopl 的核苷酸序列為 tggcgcaacg ataataaaag g,引物L(fēng)oop2的核苷酸序列為attttggctg acggacaagg,引物FIP的核苷酸序列為ctccaatgtgagactcggca tctttttggg acagcactta caacctgttc,引物 BIP 的核昔酸序列為 cgcatatcaaaggccccatt ttttggtaga aattggtaat gaaaaagcc,反應(yīng)條件為 60 65°C 的恒溫水浴鍋中擴增0.5 I h，得到擴增產(chǎn)物； C、在擴增產(chǎn)物中加入0.1 μ L的熒光染料SYBR green I，若呈綠色則樣品中感染有番茄環(huán)斑病毒，若呈橙紅色則樣品中無番茄環(huán)斑病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了番茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法，通過樣品RNA提取，RT-LAMP擴增，就可以得到檢測結(jié)果，整個檢測反應(yīng)只需1h～2.5h，又由于LAMP呈瀑布式擴增，因此其擴增效率非常高，靈敏度是RT-PCR檢測的100倍，且無需復(fù)雜的檢測儀器和檢測過程，操作簡單，可現(xiàn)場實時檢測，因此本發(fā)明是一種檢測速度快、操作簡單、檢測結(jié)果判斷容易和靈敏度高的番茄環(huán)斑病毒的RT-LAMP檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK103088161SQ20131001218
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月14日
發(fā)明者張吉紅, 顧建鋒, 余澍瓊, 聞偉剛 申請人:寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院