專利名稱：：命名為番茄枯萎病毒的新型植物病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物疾病領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及分離自番茄的新型植物病毒，以及用于檢測所述病毒的方法，檢測抗性植物的方法和用于生產(chǎn)抗性植物的方法。
背景技術(shù)：
：番爺(Solanumlycopersicum)(以前口L]普通番爺(Lycopersiconesculentum))易受大量的病毒物種感染。一些最為突出的番茄病毒包括番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus)(TSWV；番茄斑萎病毒屬(Tospovirus))；鳳果花葉病毒(Pepinomosaicvirus)(PepMV；馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus))，和番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus)(TYLCV；菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus))。這些疾病對植物造成的傷害的范圍從葉子褪色和壞死損傷，到嚴重的收成減少和植物死亡。能夠提供抗性植物的能力對于商業(yè)化的育種是最重要的，并且對于一些經(jīng)濟上最具破壞性的病毒，已經(jīng)生產(chǎn)出了抗性植物的變體。然而，隨著時間的推移，出現(xiàn)了對農(nóng)作物造成相當大損失的新型病毒。在1996年報道了一種新的番茄病毒從1993年開始就已經(jīng)感染了美國和意大利的番茄植物，這種病毒被命名為番茄褪綠傳染性病毒(TICV;毛形病毒屬(genusCrinivirus)；Duffusetal.，1996)。1998年報道了另一種同屬的新型西紅柿病毒。這種病毒已經(jīng)證明，自從1989年以來在美國就已經(jīng)感染了番茄植物，并命名為番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus)(ToCV；Wisleretal.，1998)。已經(jīng)證實這兩種新型病毒通過粉虱傳播，這種昆蟲是一種影響非常大的疾病傳播媒介。一般認為，已知病毒的地理分布將會增加，且新的病毒將會繼續(xù)出現(xiàn)，這部分是由于不同的病毒重組而形成新的菌株或新的病毒?？剐栽耘喾N的發(fā)展能夠在這些疾病的成功管理中發(fā)揮重要作用。
發(fā)明內(nèi)容近來，已經(jīng)在西班牙的番茄植物上發(fā)現(xiàn)了新病毒，這種病毒導致的癥狀并不能歸因于任何已知的病毒。植物的葉上表現(xiàn)出壞死損傷并在果實上出現(xiàn)褐色圓圈，并顯示出生長降低。血清學檢驗(ELISA)表明存在鳳果花葉病毒(PepMV)。電子顯微鏡研究實際暴露出典型的馬鈴薯X病毒屬的桿狀顆粒。然而，在所感染的葉組織中還發(fā)現(xiàn)了球形病毒顆粒。本發(fā)明人暫且將其命名為番茄灼燒病毒(Tomatotorradovirus,ToTV)0在發(fā)現(xiàn)ToTV病毒之后，接著也從墨西哥的Sinaloa州的番茄植物中分離出了新的且相關(guān)性較強的病毒。這種植物顯示出的癥狀在當?shù)乇环Q為“枯萎病”，包括嚴重的葉壞死，在小葉的基部開始并在果實上出現(xiàn)壞死環(huán)。(不應(yīng)將這種疾病與另一種已知在墨西哥被稱為“番茄枯萎病(marchitezmanchadadeltomate)”病的病毒混淆，后者的致病因子是西紅柿斑萎病毒(TSWV)或西紅柿斑萎病毒(VirusdelamarchitezManchadadelTomate,VMMT),[參見例如DeLaTorre-Almarazetal.Agrociencia36:211-221.2002])。從感染的植物中分離出來的病毒顆粒的直徑為約28nm。病毒基因組由7221個(RNAl)和4906個核苷酸(RNA2)的兩個(+)ssRNA分子構(gòu)成。病毒殼體分別含有35、26和24kDa的三種外殼蛋白。以上提及的特征、癥狀、形態(tài)、外殼蛋白的種類數(shù)和大小，以及RNA的數(shù)目，都類似于前述的番茄灼燒病毒(ToTV)。對整個病毒基因組的序列分析表明，這種新型病毒與ToTV相關(guān)但又不同于ToTV，其與ToTV均屬于新的植物病毒基因。對于這種新病毒，建議將其命名為番前枯萎病毒(tomatomarchitezvirus，ToMarV)。為了追尋其來源，監(jiān)控其流行病學并防止可能發(fā)生的疾病傳播，最重要的是能夠在早期階段識別這種疾病。而后僅采取足夠的措施隔離植物并開始采取控制植物病害的預(yù)防措施。這時，還沒有可以使用診斷工具。因此，對于開發(fā)針對這種疾病的診斷工具是有需要的。而且，目前還沒有對這種新病毒具有特異性抗性的植物，從而對于開發(fā)出這種抗性植物也是有需要的。本發(fā)明在第一方面提供了一種暫命名為番茄枯萎病毒(ToMarV)的植物病毒，其于2007年7月10日保藏在位于德國不倫瑞克的德國微生物及細胞保藏中心(DeutschSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),保藏號為PRI-TMarV0601(DSM19656)。ToMarV是植物病毒新型基因的一部分，其中ToTV就是這種類型的菌株。在本文中是指“ToTV”時，除非另外指出，在本文中傾向于是指具有同源水平的病毒的廣譜屬(broadgenus)。該廣譜屬包括ToTV-EOl(DSM16999)以及PRI_TMarV0601，其由根據(jù)布達佩斯條約于2007年7月10日保藏在位于德國不倫瑞克的國際保藏單位德國微生物及細胞保藏中心(DeutschSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)。所保藏材料的的登記號為DSM19656。該病毒在番茄植物中以及其他植物中引起疾病癥狀，而且會由其自身引起癥狀，或與其他病毒或疾病一起引起組合癥狀。第一種系統(tǒng)癥狀包括從小葉的葉片基部開始在植物的頂部出現(xiàn)壞死斑。壞死斑擴展并被淡綠或黃色區(qū)域包圍(參見圖1)。并非在所有系統(tǒng)感染中葉子都會表現(xiàn)出癥狀，然而，能夠在這些葉片中例如通過電子顯微鏡檢測出該病毒。被ToTV感染的果實顯示出壞死環(huán)。與未被感染的植物相比，被感染的植物的生長會出現(xiàn)下降。以上描述涉及被分離出的病毒新近感染的植物，而并不一定反映出本領(lǐng)域中所遇到的準確癥狀。例如植物的種屬或變種、發(fā)育階段、其他疾病壓力和非生物因素(例如，溫度和相對濕度)之類的因素將會實際上決定癥狀的表達和特征。病毒顆粒是球形的(二十面體)，直徑為約28nm(參見圖2)。病毒顆粒由約23kDa、26kDa和35kDa的至少3種衣殼蛋白組成(參見圖3)。經(jīng)純化后，該病毒在硫酸銫梯度中顯示出至少2個可見的條帶。上方的可見條帶(病毒的頂部分)含有約5.5kb(更精確地是5.2kb)的RNA分子，而下方的可見條帶(底部部分)含有約8kb(更精確地是7.7kb)的RNA分子(參見圖4)。在煙草植物上組合接種兩條條帶就會導致感染。ToTV可自動傳播到幾種煙草屬(Nicotiana)物種。標準的接種緩沖液(例如，pH為7.7的0.03M磷酸緩沖液)是合適的。對于ToTV的繁殖，優(yōu)選心葉煙(N.glutinosa)、普通煙(N.tabacum)和本珊煙(N.benthamina)。煙草種香花芥屬(N.hesperis)‘67A，和西方煙(N.occidentalis)‘P1，對于ToTV非常敏感并且34天后表現(xiàn)出系統(tǒng)癥狀。這些煙草物種短時間內(nèi)就出現(xiàn)非常嚴重的壞死，因此比增殖宿主更適合用作指示植物。心葉煙表現(xiàn)出褪綠病局部壞死和系統(tǒng)性褪綠并出現(xiàn)葉子輕微變形。本珊煙并不表現(xiàn)出局部癥狀，而反映出系統(tǒng)褪綠和葉片變形。本發(fā)明進一步提供了一種病毒，其包含至少一種選自由SEQIDNO:1和SEQIDNO2以及與之具有至少30%、優(yōu)選至少40%、優(yōu)選至少50%、優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更加優(yōu)選至少90%、更加優(yōu)選至少95%，更加優(yōu)選至少98%，且最優(yōu)選至少99%的同源性的核苷酸序列的序列組成的組的核酸序列。這些病毒也由本文中所使用的術(shù)語“ToTV”所涵蓋。在具有以上所指序列同源性的本發(fā)明病毒的優(yōu)選實施方式中，所述病毒與已知名為“灼燒病”、“枯萎病”和/或“巧克力斑病”的番茄疾病有關(guān)，和/或與任何其他可由公眾收集物獲得的病毒分離物相比，所述病毒基于基本由表1定義的分類學描述法以數(shù)字表示的分類分析而顯示出與根據(jù)權(quán)利要求1所限定的病毒更加緊密相關(guān)，并且所述病毒具有與在番茄中引起壞死損傷的疾病相關(guān)的基本特征。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的或重組的核酸，包含選自由SEQIDNO=USEQIDNO:2、與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有至少50%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更加優(yōu)選至少90%、更加優(yōu)選至少95%，更加優(yōu)選至少98%，且最優(yōu)選至少99%核苷酸序列同源性的序列，和它們的互補鏈組成的組的核酸序列以及ToTV特異性片段。這種核酸可以從根據(jù)本發(fā)明的病毒獲得。在另一方面，本發(fā)明提供了一種能夠在嚴格條件下雜交到上文所述的本發(fā)明的分離或重組核酸中的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了從根據(jù)本發(fā)明的病毒中分離或重組的多核苷酸，或它們的ToTV-特異性片段。在優(yōu)選的實施方式中，所述多核苷酸選自由ToTV的23、26和35kDa衣殼蛋白和它們的ToTV-特異性片段組成的組。在另一方面，本發(fā)明提供了一種抗原，其包含根據(jù)本發(fā)明的多肽或它們的ToTV-特異性片段。在另一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，其特異性地針對根據(jù)本發(fā)明的抗原。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生抗ToTV的抗體的方法，包括以下步驟a)提供ToTV病毒，或其(重組)蛋白或肽片段；b)用所述病毒、蛋白或肽片段免疫合適的脊椎動物宿主；和c)從所述脊椎動物宿主的血液(包括血清)或脾細胞收獲抗所述病毒、蛋白或肽片段的抗體。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述方法進一步包含以下步驟d)選擇一種產(chǎn)生抗體的脾細胞，e)將所述脾細胞融合到永生化雜交瘤細胞系，和f)使得所述雜交瘤融合物產(chǎn)生單克隆抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，其可通過根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生抗ToTV的抗體的方法獲得。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于識別作為ToTV病毒的病毒分離物的方法，包含使將所述病毒分離物或其組分與根據(jù)本發(fā)明的抗體進行反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒別作為ToTV病毒的病毒分離物的方法，包含使所述病毒分離物或其組分與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸進行反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中是否存在ToTV的方法，包括通過使所述樣品與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或抗體反應(yīng)來確定所述樣品中是否存在ToTV病毒或其組分。在另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒別ToTV抗性植物的方法，包括以下步驟a)使植物或植物部件暴露于感染劑量的ToTV，以及b)當所述暴露之時，和暴露之后，只要是以下情況之一就可以將所述植物鑒別為ToTV抗性植物i)在所述植物或植物部件中保持不存在疾病癥狀或延遲表達疾病癥狀或相對易感對照植物疾病癥狀的嚴重程度至少有所降低，和/或ii)ToTV病毒或ToTV基因組序列并不存在于所述植物或植物部件中，或相對于易感對照植物ToTV病毒的存在至少數(shù)量上降低。步驟a)包括持續(xù)足夠長的培養(yǎng)期以使得在暴露于相當感染劑量病毒的易感對照植物中產(chǎn)生可檢測的疾病癥狀。通過實施這種方法，可以識別植物中的所有形式的抗性，包括全抗性、部分抗性、超敏性和耐性。為了證實耐性，必須證實植物(細胞)中(系統(tǒng))存在病毒。步驟b)可以涉及實施檢測所述植物或植物部件的樣品中根據(jù)本發(fā)明的ToTV的存在的方法，其中在標準方法中使用根據(jù)本發(fā)明的抗體或多肽用于核苷酸雜交分析或免疫分析，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的?？商娲兀襟Eb)可以包含使所述暴露的植物的一部分與易感指示植物接觸。這樣，人們就可以通過觀察指示植物中或甚至是與所述第一種接觸的指示植物接觸的植物中是否出現(xiàn)疾病來檢測是否存在系統(tǒng)或局部感染。在另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生ToTV抗性植物的方法，包含以下步驟通過實施以上根據(jù)本發(fā)明的鑒別ToTV抗性植物的方法中的一種來鑒別ToTV抗性供體植物，將所述ToTV抗性供體植物與受體植物雜交(其中，受體植物可以是ToTV易感的或ToTV抗性的，但是當抗性表現(xiàn)型由隱性基因帶來時，則ToTV抗性植物是合適的)，以及通過在上述植物中實施鑒別ToTV抗性的方法而從后代植物(例如，F(xiàn)1,F2和自花受粉的植物)中選出抗性植物。在抗性性狀是隱性性狀的情況下，可以在F1或&或更進一步的后代自花授粉的后代植物中發(fā)現(xiàn)抗性植物。在這方面優(yōu)選的實施方式中，所述ToTV抗性供體植物和受體植物是茄科或葫蘆科的植物。在這方面其他優(yōu)選實施方式中，所述受體植物是番茄、茄子、胡椒、甜瓜、西瓜或黃瓜，更優(yōu)選番茄種(Solanumlycopersicum)的植物，最優(yōu)選具有所需商業(yè)特性的番茄類織物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種ToTV抗性植物，優(yōu)選番茄、茄子、胡椒、甜瓜、西瓜或黃瓜，或它們的一部分，如種子，它們可通過根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)生ToTV抗性植物的方法獲得。在另一方面，本發(fā)明提供了一種診斷試劑盒，用于檢測樣品中是否存在ToTV或確定包含本發(fā)明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原和/或抗體的植物中的ToTV抗性。在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原或抗體用于生產(chǎn)診斷組合物的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的病毒、多核苷酸、多肽、抗原或抗體的診斷組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了ToTV或ToTV病毒基因組的部分作為表達載體的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了ToTV或ToTV病毒基因組的部分用于在植物中產(chǎn)生病原體弓I發(fā)抗性(pathogen-derivedresistance)的用途。在另一方面，本發(fā)明涉及ToTV病毒，或其基因組或它們的部分的減毒形式用于植物傳染免疫的用途。圖1示出了由ToTV-EOl引起的番茄植物的葉上的ToTV-疾病癥狀的照片。圖2示出了純化的ToTV-EOl顆粒的電子顯微照片。顆粒直徑約為28nm。圖3示出了指示約23kDa、26kDa和35kDa的三種衣殼蛋白的純化ToTV-EOl病毒頂部(TAgV-T)和底部(TAgV-B)組分的銀染色PAGE凝膠的結(jié)果。圖4示出了變性瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。片段的大小以千堿基(kb)表示。利用鄰甲苯胺藍對凝膠進行染色。M分子尺寸標準。TAgV:1μg分離的ToTV-EOlRNA。圖5示出了ToTV-EOlRNA2分子的完整序列(SEQIDNO1)。圖6示出了ToTV-EOlRNA1分子的完整序列(SEQIDNO2)。圖7示出了指示如實施例2中用于RNA2的各種引物組退火位點的ToTV-EOl病毒的一般結(jié)構(gòu)。圖8示出了PRI-TMarV0601RNA1分子的完整序列(SEQIDNO:15)。圖9示出了PRI-TMarV0601RNA2分子的完整序列(SEQIDNO:16)。圖10示出了番茄枯萎病在番茄的葉和果實中的典型癥狀A(yù))番茄葉子被黃色或亮綠色區(qū)域圍繞的壞死，從小葉基部開始，和B)番茄果實壞死圈和壞死斑。圖11示出了在板A)上ToMarV衣殼蛋白變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的結(jié)果。蛋白通過銀染色而可見。1)分子量標記(Bio-RadPrecisionPlusProteinStandards(注意預(yù)染色的37kDa和50kDa標準在所使用的銀染色法中并未染色))，2)Cs2SO4浮力密度梯度離心后ToMarV純化的病毒體；在板B)上從ToMarV病毒體提取并用鄰甲苯胺藍染色的RNA變性瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。1分子尺寸標準(Invitrogen0.249.5kbRNALadder)；2從ToMarV病毒體純化的RNA。箭頭指示3.5_kb和7.5_kbRNA條帶的位置。圖12示出了ToMarV基因組的組織化。圖13示出了ToMarV(PRI_TMarV0601)和相關(guān)病毒(例如，ToTV-EOl)基于以下比對的種系發(fā)育分析A)RNA1的蛋白酶CG基因座和GDDRdRp基因座之間的區(qū)域；和B)RNAl基因座A和C之間的解旋酶區(qū)域。具體實施例方式定義本文中所使用的術(shù)語“ToTV”應(yīng)該解釋為是指具有本文中所指出的RNA同源性水平的新病毒屬，除非另外表達性陳述或?qū)Ｖ?例如當比較ToMarV和ToTV時，術(shù)語ToTV應(yīng)該解釋為是指病毒種ToTV-EOl)。這種廣譜屬包括至少ToTV-EOl種(DSM16999)以及PRI-TMarV0601o該屬是通過病毒基因組的RNA序列(或被翻譯為DNA序列)之間的同源性水平，或病毒基因組中的開放讀碼框的氨基酸序列之間的同源性水平來定義的。本文中所使用的術(shù)語“ToTV抗性”，應(yīng)該解釋為是指植物的抗性，尤其是番茄對發(fā)生感染的抗性，或?qū)τ捎诒疚闹兴傅木哂蠷NA同源性水平的新病毒屬所引起的疾病的抗性，除非另外表達性地陳述或?qū)Ｖ?。本文中所使用的術(shù)語“ToTV-特異性片段”是指具有特異于包含本文中描述的ToTV和ToMarV的病毒的屬的序列的核酸片段。關(guān)于術(shù)語“特異的”是指核酸能夠在嚴格的雜交條件下特異性地雜交至所述病毒的核酸中。本文中所使用的術(shù)語“ToMarV”應(yīng)該解釋為意指具有本文中所指的RNA同源性水平的新ToTV病毒屬中的一個種，除非另外指出或?qū)Ｖ?例如，當本文中比較ToMarV和ToTV時，術(shù)語ToMarV應(yīng)該解釋為是指種rai_TMarV0601)。術(shù)語“ToMarV”也應(yīng)該解釋為是指屬于新ToTV病毒屬中的這種新種的病毒，所述新種具有指示病毒學家們一般接受的屬于同一個種的不同分離群(菌株)的核苷酸或氨基酸序列水平上的同源性水平。這種種內(nèi)特異性同源性水平通常超過80%至90%，例如，對于核苷酸序列同源性水平超過93%，而對于氨基酸序列可能更高。本文中所使用術(shù)語“植物部件”是指植物的某部位，包括單細胞和細胞組織如植物中完整的植物細胞，植物能夠由其再生的細胞簇和組織培養(yǎng)物。植物部件的實例包括，但不限于，來自花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實、莖干和種子的單細胞和組織；以及花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根尖、花藥、花、果實、莖、芽、接穗、根莖、種子、原生質(zhì)體、愈傷組織等。術(shù)語“樣品”包括來自植物、來自植物部件或來自傳播載體的樣品，或土壤、水或空氣樣品。本文中所使用的術(shù)語“傳播載體”是指傳播疾病的媒介物或物質(zhì)。在本領(lǐng)域中的ToTV傳播載體可以包括，但不限于，動物如節(jié)肢動物(尤其是分類學上的昆蟲綱和蛛形綱)、線蟲類(尤其是腺綱)，以及更大的動物如鳥類、兔子和老鼠、真菌(即真菌門，尤其是藻狀菌綱的真菌)、(寄生的)植物(包括菟絲子科的成員)、花粉、種子、水、土壤顆粒，以及甚至人手、裝備和鞋。術(shù)語“后代”植物是指任何由一種或多種親本植物或其后代無性生殖或有性生殖的子代獲得的任何植物。例如，后代植物可以通過親本植物的克隆或自花授粉，或通過兩種親本植物雜交而獲得，并且包括自花授粉的后代以及作為F1或F2或更下一代的后代。F1是由第一次作為性狀供體的至少之一的親本產(chǎn)生的第一代后代，而第二代后代(F2)或后續(xù)后代(F3,&等)都是從F/，F(xiàn)2'等的自授粉產(chǎn)生的樣本。因此，F(xiàn)1可以是(通常就是)來自兩個實際繁育親本(實際繁殖時性狀純合的)之間的雜交產(chǎn)生雜種，而F2可以是(通常就是)由所述F1雜種的自授粉產(chǎn)生的后代。本文中所使用的術(shù)語“抗性”是指植物被所述病毒感染后能夠抵抗病毒在其細胞中的復(fù)制和/或(系統(tǒng))遷移到其他細胞和/或疾病癥狀的發(fā)展，其中病毒能夠在所述植物的相應(yīng)非抗性或易感性變種中感染和倍增。所使用的該術(shù)語包括將這種可識別的抗性形式區(qū)分為“全抗性”、“免疫”、“部分抗性”、“超敏性”和“耐性”?！叭剐浴笔侵赣捎诓《靖腥竞笸耆荒芊庇?，并且這可能是由于病毒不能進入細胞(無初始感染)引起的，或者是由于病毒在細胞內(nèi)不能繁殖并感染繼后細胞(無潛在感染，未傳播)而引起的。全抗性的存在可以通過，將所述植物暴露于感染劑量的病毒之后(即“感染”之后)確定在植物細胞中的不存在病毒顆?；虿《綬NA，以及在植物細胞中不存在任何疾病癥狀來確定。在育種中，這種表現(xiàn)型經(jīng)常被稱為“免疫”。因此本文中所使用的“免疫性”是指由病毒即使是在例如通過電穿孔而活性地轉(zhuǎn)移到細胞中時也不存在病毒復(fù)制來表征的的抗性形式?！案腥緞┝俊倍x為能夠感染植物的病毒顆?；虿《竞怂岬膭┝?，該劑量在植物之間和所試驗的ToTV分離物之間是不同的。理論上，所述病毒的病毒顆?；蚱浜怂岬牧繛榧s110到約500500是足夠的。按照這種方式的感染可以通過在植物中機械性培育純化的病毒顆粒或病毒核酸來實現(xiàn)。“部分抗性”是指病毒在細胞中的增殖減少，這是由于病毒的(系統(tǒng))遷移降低，和/或由于感染后癥狀發(fā)展減少。部分抗性的存在可以通過將所述植物暴露于感染劑量的病毒之后確定植物中存在病毒顆?；虿《綬NA的低滴度或所述植物中存在疾病癥狀的較少或延遲來確定。病毒滴度可以通過采用定量檢測方法(例如，ELISA方法或定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)RT-PCR)來確定。在育種中，這種表現(xiàn)型經(jīng)常被稱為“中等抗性”。術(shù)語“超敏性”是指其中感染保持局部性的而并不系統(tǒng)地傳播，這例如是由于被感染組織的局部壞死或缺乏培育組織之外的系統(tǒng)遷移所致。超敏性植物表現(xiàn)出局部的且嚴重的疾病癥狀，而能夠在這種植物中確定病毒的局部存在。本文中所使用的“耐性”是指植物的表現(xiàn)型，其中將所述植物暴露于感染劑量的病毒之后仍然不存在疾病癥狀，由此能夠確定存在系統(tǒng)的或局部的病毒感染、病毒增殖，在所述植物的細胞中至少存在病毒基因組序列和/或它們的基因組整合。因此，耐性植物對于除了病毒的無癥狀載體之外的癥狀表達具有抗性。有時，病毒序列可以存在于植物中或甚至在植物中增殖而不會導致疾病癥狀。這種現(xiàn)象也稱為“潛伏性感染(或潛在性感染，latentinfection)”。有些DNA和RNA病毒可以在初期感染之后會變得不可檢測，而僅在后來再出現(xiàn)并產(chǎn)生急性疾病。在潛伏性感染中，病毒可以以實際潛伏性非感染隱藏形式存在，其可以是作為整合的基因組或游離基因物質(zhì)(印isomalagent)(以至于在細胞質(zhì)中不能發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，同時PCR方案可以指示病毒核酸序列的存在)或作為感染的連續(xù)地復(fù)制物質(zhì)。再活化的病毒可以在易感接觸物中傳播并開始流行。對植物中存在的“潛伏性感染”與存在“耐性”表現(xiàn)型很難加以區(qū)分。本文中所使用的術(shù)語“易感的”是指植物對病毒無抗性以導致該病毒進入到植物細胞中并進行增殖和系統(tǒng)傳播病毒，導致疾病癥狀。因此，術(shù)語“易感的”等于“無抗性的”。易感植物在感染后在其細胞中表現(xiàn)出正常的病毒滴度。因此，易感性可以通過將所述植物暴露于感染劑量的病毒之后，確定植物細胞中存在病毒顆粒和病毒RNA的正常滴度(即，相對于植物中其他病毒感染)以及在所述植物中確定正常疾病癥狀(即，相對于按照本文中所述的首先從中分離出ToTV的植物的疾病癥狀)的存在來確定。術(shù)語“敏感的”反映了易感植物對病毒感染的癥狀反應(yīng)。該反應(yīng)或癥狀嚴重與否取決于植物的敏感性水平。如果植物受傷或甚至被病毒致死，所述植物就是“敏感的”。植物用減毒病毒菌株人工培養(yǎng)，隨后保護其以避免靠近相關(guān)的毒性病毒。作為保護性的病毒，天然存在的溫和菌株或減毒菌株(人工誘導的溫和突變)都可以使用。優(yōu)選地，為了獲得針對ToTV的植物的傳染免疫，相對于ToTV毒性菌株，可以使用ToTV的減毒菌株，其是無癥狀的或至少顯示出在感染植物中癥狀表達降低。產(chǎn)生減毒病毒的方法可以例如包括ToTV基因組的隨機誘變和篩選癥狀減弱的菌株。生產(chǎn)減毒植物病毒的方法的參考文獻在論文Takeshitaetal.，2001；Luetal.，2001；Hagiwara,etal.，2002；禾口Hirataetal.，2003中進行了描述。本文中所使用的術(shù)語“番茄”是指番茄屬或茄屬的任何植物、種系或群(population)，包括但不限于以下列表中所列出的那些。近來，番茄屬植物的命名已經(jīng)發(fā)生了變化。以下列表中提供了番茄屬的新命名(源自Peralta，Knapp&Spooner,unpublishedmonograph(參JAL:http://www.sgn.comell.edu“GuidetorevisedSolanumnomenclature"))。番茄專著中的名稱^(Peraltaetal.，在SystematicBotany相當于番前屬中的名稱Monographs中準備用于出版)Lycopersiconjuglandifolium(Dunal)SolanumjuglandifoliumDunalJ.Μ.H.ShawSolanumochranthumDunalLycopersiconochranthum(Dunal)J.Μ.H.ShawSolanumsitiensI.Μ.Johnst.Lycopersiconsitiens(I.M.Johnst.)J.M.H.ShawSolanumlycopersicoidesDunalLycopersiconlycopersicoides(DunalinDC.)A.ChildexJ.M.H.ShawSolanumpennelliiCorrellLycopersiconpennellii(Correll)D'ArcySolanumhabrochaitesS.Knapp&D.MLycopersiconhirsutumDunalSpooner被Peralta描述為Solanum‘Nperuvianum'(4個地理禾中群Lycopersiconperuvianum(L.)的一部分humifusum,lomas,Marathon,Miller(包括var.humifusum禾口MarathonChotano-Yamaluc)races)由Peralta描述的Solanum'CallejondeLycopersiconperuvianum(L.)Miller的Huaylas'一部分(源自Ancash，alognRioSanta)SolanumneorickiiD.Μ.Spooner，G.J.LycopersiconparviflorumC.M.Rick，Anderson&R.K.JansenKesicki，F(xiàn)obes&M.Holle“表達載體”被定義為含有基因，通常為異源性基因的核酸分子，其在宿主細胞中表達。典型地，該基因包含編碼的蛋白序列?；虮磉_始終置于啟動子控制之下，而這種基因據(jù)說是“可操作地連接于”啟動子。術(shù)語“異源性的”是指DNA分子，或DNA分子群在所給的宿主細胞中并不是天然存在的。本文中所使用的術(shù)語“多核苷酸”可以與術(shù)語“核酸”互換，它們是指具有任何數(shù)目的核苷酸的核苷酸多聚體或核苷酸聚合物形式，例如，脫氧核糖核酸或核糖核酸，或合成產(chǎn)生的化合物(例如，美國專利第5，948，902號及其引用的參考文獻中描述的PNA)，且能夠是雙鏈的或單鏈的。多核苷酸能夠與天然存在的多核苷酸以類似于兩種天然存在的多核苷酸的序列特異性模式進行雜交，例如能夠參與Watson-Crick堿基配對相互作用。該術(shù)語也包括，例如通過甲基化和/或帽化而修飾的多核苷酸，以及未經(jīng)修飾的多核苷酸。本文中所使用的術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。本文中所使用的術(shù)語“脫氧核糖核酸”和“DNA”是指由脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。術(shù)語“寡核苷酸”是指核苷酸單體通過磷酯鍵(例如，磷酸二酯鍵、磷酸烷基酯鍵和磷酸芳基酯鍵、硫代磷酸酯鍵)，或非磷酯鍵(例如，肽鍵、氨基磺酸酯鍵等)而連接的短序列(通常為6至100個核苷酸)。寡核苷酸可以含有具有修飾的堿基(如，5-甲基胞嘧啶)和修飾的糖基(如，2'-O-甲基核糖基、2'-O-甲氧基乙基核糖基、2'-氟代核糖基、2'_氨基核糖基等)的修飾的核苷酸。寡核苷酸可以是天然存在的或合成的雙鏈和單鏈DNA分子以及雙鏈和單鏈RNA分子，其可以是環(huán)形的、支鏈的或直鏈的形狀，并且可選地包括能夠形成二級結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域(例如，莖環(huán)，偽結(jié)和接吻環(huán)結(jié)構(gòu))。本文中所使用的術(shù)語“核苷酸序列同源性”是指兩個多核苷酸之間存在的同源性。如果兩個序列中的核苷酸序列的最大對應(yīng)比對相同，則多核苷酸就具有“同源”序列。兩個或多個多核苷酸之間的序列對比通常是通過比較比對窗口之上兩序列的部分以識別和對比局部區(qū)域的序列形似性來實施。比對窗口一般為約20至200個相鄰的核苷酸。多核苷酸的“序列同源性的百分比”，50%,60%,70%,80%,90%,95%,98%,99%^100%的序列同源性，可以通過比較比對窗口之上的兩個最佳比對序列來確定，其中當與比對最佳對齊的兩個序列的基準序列(其并不包含添加和刪除)時，在比對窗口內(nèi)的多核苷酸序列部分可以包括添加和刪除(即，空位)。百分比通過以下步驟進行計算(a)確定在兩個序列中出現(xiàn)相同的核苷酸堿基的位置數(shù)以獲得匹配位置的數(shù)目；(b)匹配位置數(shù)除以比對窗口中的總位置數(shù)；和(c)結(jié)果乘以100而獲得序列同源性百分比。比對序列的最佳對齊可以通過計算機執(zhí)行已知算法或通過可視檢查來進行。易于獲得的序列比對和多倍序列比對算法分別為BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschuletal.，1990；Altschuletal.,1997)和ClustalW程序，它們都可以從因特網(wǎng)上獲得。其他合適的程序包括，但不限于，GAP、BestFit、PlotSimilarity、以及WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的FASTA(GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,WI,USA)(Devereuxetal.,1984)。正如在本文中所使用的，“基本上互補”是指兩個核苷酸序列彼此具有至少約65%，優(yōu)選約70%，更優(yōu)選約80%，更加優(yōu)選90%，且最優(yōu)選約98%的序列互補性。這就意味著，引物和探針必須分別對它們的模板和靶核酸展示出足夠的互補性，從而在嚴格條件下進行雜交。因此，引物和探針序列不需要反映模板上結(jié)合區(qū)域的精確互補序列并且可以使用的簡并的引物。例如，非互補核苷酸片段可以連接到引物的5'_端，引物序列的其余部分與該鏈互補?？商娲?，非互補堿基序列或更長的序列能夠散布在引物中，條件是引物與將要被擴增的鏈之一具有足夠的互補性而與之雜交，并由此而形成能夠通過聚合方式延伸的雙鏈體結(jié)構(gòu)。引物的非互補性核苷酸序列可以包括限制酶位點。將限制酶位點附加到(一個或多個)靶序列的端部，這特別有助于靶序列的克隆?；旧匣パa的引物序列對擴增模板具有足夠的序列互補性，從而導致引物結(jié)合和第二條鏈的合成。技術(shù)人員對于引物對擴增模板具有足夠序列互補性的要求是熟知的。本文中核酸的術(shù)語“雜種”是指由互補的核苷酸堿基之間的氫鍵形成的雙鏈核酸分子，或雙鏈體。術(shù)語“雜交”或“退火”是指通過互補堿基之間的氫鍵使單鏈核酸序列形成雙螺旋片段的過程。本文中植物育種的術(shù)語“雜種”是指通過不同種系或品種或種的雜交植物而產(chǎn)生的遺傳上不同的親本的后代植物。術(shù)語“探針”是指識別并與靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互補序列形成氫鍵鍵合的雙鏈體的單鏈寡核苷酸序列。本文中所使用的術(shù)語“引物”是指能夠退火以容許DNA聚合酶附著從而使靶標擴增的寡核苷酸，由此當其被置于引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導的條件下，即，存在核苷酸和諸如DNA聚合酶的聚合試劑以及合適的溫度和pH條件下時，起到DNA合成初始點的作用。(擴增)引物優(yōu)選是的單鏈化的以使其中擴增中具有最大效率。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長才能在聚合試劑存在下啟動延伸產(chǎn)物的合成。引物的準確長度將取決于許多因素，包括溫度和引物的組成(A/T和G/C含量)。一對雙向引物是由一個正向引物和一個反向引物組成，如通常在DNA擴增
技術(shù)領(lǐng)域：
如PCR擴增中所使用的那些。應(yīng)該理解，本文中所使用的“引物”可以是指多于一種引物，特別是在有關(guān)被擴增靶區(qū)域的端序列的信息中存在一些錯讀(ambiguity)的情況下更是如此。因此，“引物”包括含有表示在序列中可能變化的序列的引物寡核苷酸收集物或包括容許典型堿基配對的核苷酸。寡核苷酸引物可以通過任何合適的方法制備。制備寡核苷酸特異性序列的方法是本領(lǐng)域已知的，包括例如合適序列的克隆和限制，以及直接化學合成。化學合成法可以包括，例如，磷酸二酯法或磷酸三酯法、氨基磷酸二乙基酯(diethylphosphoramidate)法和公開于例如美國專利第4，458，066號中的固體負載法。如果需要的話，引物可以通過以例如光譜、熒光、光化學、生物化學、免疫化學或化學方式檢測的結(jié)合方法來標記。寡核苷酸引物的模板依賴性的延伸是在足量的四種脫氧核糖核苷酸三磷酸酯(dATP、dGTP、dCTP和dTTP，即dNTPs)或類似物的存在下，在由合適的鹽、金屬陽離子和pH緩沖系統(tǒng)組成的反應(yīng)介質(zhì)中由聚合試劑催化的。合適的聚合試劑是已知催化引物-和模板_依賴性DNA合成的酶。已知的DNA聚合酶包括，例如，大腸桿菌DNA聚合酶I或其Klenow片段、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶。用DNA聚合酶催化DNA合成的反應(yīng)條件是本領(lǐng)域中公知的。合成產(chǎn)物是由模板鏈和引物延伸鏈組成的雙鏈體分子，其包括靶序列。由此這些產(chǎn)物又作為另一輪復(fù)制的模板。在第二輪復(fù)制中，使第一次循環(huán)的引物延伸鏈與其互補引物一起退火；合成以產(chǎn)生的“短”產(chǎn)物，其通過引物序列或它們的互補物結(jié)合于5'-端和3'-端。變性、引物退火和延伸的重復(fù)循環(huán)導致由引物限定的靶區(qū)域呈指數(shù)累積。執(zhí)行足夠次數(shù)的循環(huán)而達到含有核酸靶區(qū)域的所需數(shù)量的多核苷酸。所需數(shù)量可以是不同的，這由產(chǎn)物多核苷酸將要起到的功能決定。在手冊中已經(jīng)詳細地描述了PCR方法，這是技術(shù)人員已知的。通過PCR擴增后，可以通過用在嚴格到中等嚴格的雜交和沖洗條件下，使靶多核苷酸與靶序列的多核苷酸形成穩(wěn)定雜種的探針多核苷酸雜交來檢測該靶多核苷酸。如果預(yù)期探針將基本上與靶序列完全互補(即約99%或更大)，則采用嚴格條件。如果預(yù)期會發(fā)生一些錯配，例如，如果變種株預(yù)期具有探針將不會完全互補的結(jié)果，則雜交的嚴格性就會降低。然而，條件的選擇會排除非特異性/偶然性結(jié)合。在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，影響雜交的條件，以及排除非特異性結(jié)合的條件的選擇在例如文獻Sambrooketal.,(2001)中有描述。一般而言，較低的鹽濃度和較高的溫度會使結(jié)合的嚴格性增加。例如，通常認為嚴格條件是在含有約0.1XSSC，0.1%SDS的溶液中于65°C的培養(yǎng)/沖洗溫度下進行培養(yǎng)，而中等嚴格的條件是在含有約12XSSC，0.1%SDS的溶液中于5065°C的培養(yǎng)/沖洗溫度下進行培養(yǎng)。低嚴格性條件是2XSSC和約3050°C.術(shù)語“嚴格性”或“嚴格的雜交條件”是指影響雜種穩(wěn)定性的雜交條件，例如，溫度、鹽濃度、PH、甲酰胺濃度等。這些條件經(jīng)過經(jīng)驗上的優(yōu)化而使得引物或探針對其靶核酸序列的特異性結(jié)合最多并使得非特異性結(jié)合最少。所使用的術(shù)語包括參照在將探針或引物將雜交到其靶序列中，從而使得可檢測的程度超過其他序列(例如，超過背景至少2倍)的條件。嚴格條件是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境下是不同的。較長序列的特異性地雜交要在較高的溫度下進行。一般而言，嚴格條件選擇為比特異性序列的熱熔點(Tm)低約5°C的溫度、確定的離子強度和pH。Tm是(在確定的離子強度和pH下的)溫度，在該溫度下50%的互補靶序列雜交到最優(yōu)匹配的探針或引物。典型地，嚴格條件為，其中鹽濃度低于約1.OMNa+離子，典型地為約0.01至1.OMNa+離子濃度(或其他的鹽)，pH7.0至8.3，而對于短探針或引物(例如，10至50個核苷酸)溫度為至少約30°C，對于長探針或引物(例如，超過50個核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴格條件也可以采用加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實現(xiàn)。低嚴格條件或“降低嚴格性的條件”的實例包括采用30%甲酰胺、lMNaCl、l%SDS的緩沖溶液在37°C下雜交并在40°C于2XSSC中沖洗。雜交步驟和過程在本領(lǐng)域中是眾所周知的，例如，在文獻Ausubeletal.，1998和Sambrooketal.，2001中進行了描述。術(shù)語“抗原”是指能夠引發(fā)脊椎動物中的免疫應(yīng)答，從而導致作為防御所述物質(zhì)的部分產(chǎn)生抗體的物質(zhì)?？乖梢允悄軌蛘T使例如血液細胞、淋巴結(jié)細胞和脊椎動物的脾臟中產(chǎn)生抗體的病毒蛋白。術(shù)語“抗體”包括抗原結(jié)合肽，以及是指抗體、單克隆抗體，其是指整個免疫球蛋白或免疫球蛋白分子的抗體或任何抗體片段。這樣的肽的實例包括完整抗體分子、抗體片段，例如Fab、F(ab')2、互補決定區(qū)(⑶R)、VL(輕鏈可變區(qū))、VH(重鏈可變區(qū))以及它們的任意組合或抗體肽的任何其他功能部分。術(shù)語“抗體”是指基本上由一種或多種免疫球蛋白基因，或其特異性結(jié)合并識別分析物(抗原)的片段編碼的多肽。然而，盡管能夠根據(jù)完整抗體的降解來定義各種抗體片段，但是技術(shù)人員應(yīng)該理解，這樣片段可以通過化學方法重新合成或通過利用重組DNA方法來重新合成。因此，本文中所使用的術(shù)語抗體也包括抗體片段，例如單鏈Fv、嵌合抗體(即，包含來自不同物種的恒定區(qū)和可變區(qū))、人源化抗體(即，包含來自非人源的互補決定區(qū)(CDR))和異源偶聯(lián)抗體(例如，雙特異性抗體)。術(shù)語“基本上純的”和“分離的”可以互換使用，它們均描述了基本上從其他與其天然存在的(亞)細胞組件分離出來的蛋白、肽或核酸。該術(shù)語涵蓋了從其天然存在環(huán)境提取出的核酸或蛋白，包括重組或克隆的DNA分離物和化學合成的類似物或通過異性體系(或異種體系，heterologoussystem)生物合成的類似物。一般而言，該術(shù)語是指具有純度為至少約75wt%，例如，85wt%、95丨％或98wt%的純化蛋白和核酸。小的改變或化學改性一般共有相同的多肽或核酸序列。基本純的蛋白或核酸將典型地包含純度為85%至100%(w/w)的蛋白或核酸樣品，更常見的是約95%，且優(yōu)選純度超過約99%。蛋白或核酸純度或同源性能夠通過本領(lǐng)域眾所周知的許多種方法來指征，如蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著進行染色后就能夠在聚丙烯酰胺凝膠上可視觀察到單個多肽的條帶，或通過核酸樣品的瓊脂糖凝膠電泳，接著進行染色后就能夠在瓊脂糖凝膠上可視觀察到單個多核苷酸的條帶?！叭旧笨梢允侵咐锰禺愋噪幕蚝怂徇M行染色，例如銀染和考馬斯亮藍染，或溴乙啡啶知SYBR染色，或者可以是指是利用特異性肽或核酸進行染色，例如對于蛋白或肽的情況，采用標記的次級抗體(例如，與堿性磷酸酶配對的)使肽與抗體接觸并使該抗體可見，或使核酸與標記的互補探針接觸以可視觀察核酸和探針之間的雜交的存在。出于某些目的，通過采用高效液相色譜(HPLC)或類似的純化方法能夠取得更好的分離效果。這樣的方法是本領(lǐng)域中公知的一般知識(參見例如，Katz,etal.，1998)。鑒別和分類學本發(fā)明提供了一種包含根據(jù)SEQIDN0:1和/或SEQIDNO:2的核酸序列和與它們具有至少30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%或優(yōu)選65%核苷酸序列同源性的序列中的至少一種的分離病毒。如上所述，如果兩個序列中的核苷酸序列在最大對應(yīng)性比對時是相同的，則多核苷酸具有“同源性”序列。采用先前由ToTV病毒分離物獲得的核苷酸序列而進行的BLAST搜索表明，在GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中與任何已知的病毒或非病毒序列沒有顯著的同源性。由此，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于具有其他植物病毒解旋酶基因座的ToTVRNAl的SEQIDNO2上ORF1中的解旋酶基因座之間的最高同源性百分比為46.5%(參見以下實施例)。ToMarV共有病毒體特性和其與ToTV-EOl共有基因組組織，但是基于核苷酸和氨基酸序列的水平，兩種病毒的特性是相關(guān)的但是有區(qū)別的。近來，在GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中的BLAST搜索表明了與另一種近來分離的病毒具有顯著的同源性。在ToMarVRNAl和RNA2以及于2006年10月16日保存在NCBI數(shù)據(jù)庫中的名稱為番茄頂點壞死病毒(Genbank編號為EF063641和EF063642；此后稱為ToANV)的RNAl和RNA2的部分序列之間觀察到相當高水平的同一性。這種病毒也可以從Culiacan地區(qū)(Sinaloa，墨西哥)獲得。關(guān)于來源于這些部分序列的病毒沒有其他數(shù)據(jù)可以利用。然而，在RNAl和RNA2的3’-NTR(分別為88.5%和85.6%)中的相對低水平核苷酸序列特性(低于90%)，以及在ToMarV和ToANV之間的最大假定CP(Vp36)中低于90%的aa同一性(89%)，間接表明兩種病毒并不是完全相同的，而是相同病毒的菌株或分離物。要確定其與ToMarV的精確關(guān)系，就需要關(guān)于ToANV序列衍生的病毒的其他生物學和分子數(shù)據(jù)。實施基于RNAl-ORF中的CG蛋白酶基因座[BazanJF,FletterickRJ(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:7872-7876]和GDDRdRp活性位點[ArgosP(1988)NucleicAcidsRes16:9909-9916]之間aa區(qū)域的種系發(fā)育分析，來確定番茄枯萎病毒、ToTV和來自溫州蜜柑矮縮病毒屬(Sadwavirus)、櫻桃銼葉病毒屬(Cheravirus)和隨伴病毒科(Sequiviridae)、豆工豆壤嵌病毒禾斗(Comoviridae)、二順反子病毒禾斗(Dicistroviridae)和微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的種系發(fā)育之間的關(guān)系。該區(qū)域的提出是一種分類仿小核糖核酸病毒(picorna-likevirus)的良好分類預(yù)測因子[IkegamiM，etal.(2002)豇豆花葉病毒科中的公認和推定種的分類(TaxonomyofrecognizedandputativespeciesinthefamilyComoviridae).XIIthIUMSVirologymeetingParis,法國，2002年7月27日到2002年8月12日]。所得到的樹狀圖(圖13)表明，ToMarV病毒與ToTV和ToANV成簇，并確認了這些來自櫻桃銼葉病毒屬的病毒各自的分類學位置?；诨蜃鵄和C之間的解旋酶區(qū)域的類似種系發(fā)育分析[GorbalenyaAE,KooninEV,WolfYI(1990)FEBSLett262145-148](aa397-494)證實了ToMarV的分類學位置(圖13)。對于該基因座，這些病毒似乎與溫州蜜柑矮縮病毒屬和隨伴病毒屬更加緊密相關(guān)。番茄枯萎病毒(ToMarV)是一種新型的仿小核糖核酸植物病毒，其與番茄灼燒病毒(ToTV)相關(guān)但有區(qū)別。ToMarV和ToTV明顯不同于其他植物仿小核糖核酸病毒，但是基于標準的病毒學標準，它們屬于相同的病毒屬。ToTV是植物病毒新屬(灼燒病毒屬)的暫定新種。應(yīng)該理解，當比較兩個長核苷酸序列時，由于經(jīng)常發(fā)現(xiàn)局部區(qū)域的序列相似性，因此當這兩個序列在小的比較窗口進行兩序列比對時，序列的同源性較大。然而，技術(shù)人員都知道，序列同源性需要建立序列之間的共同基因座，其中的序列同一性可以局部地高達35%至100%，但是在相同ORF的基因組序列的其他部分中可以低至10%至20%。因此，當本文中提到序列具有與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少50%的核苷酸序列同源性時，這是指其中同源性最大的共同基序中的區(qū)域之間的序列的同源性，以及兩種同源蛋白的編碼序列之間的序列同源性。需要注意的是，序列同源性在基因組中的不同基因之間可以是不同的(參見實施例)。作為新近確定的ToTV病毒分離物和其他病毒(包括要與其進行比對的病毒)之間相關(guān)性的指征，種系發(fā)育分析一般可以基于(部分的)病毒的基因組序列信息來實施。在以下實施例中提出了幾種這樣的分析。由此獲得的信息進一步指示了，ToTV顯示出于與來自隨伴病毒屬和溫州蜜柑矮縮病毒屬(隨伴病毒科)以及櫻桃銼葉病毒屬和溫州蜜柑矮縮病毒屬的病毒具有最高水平的同源性。來自這些屬中的病毒是有區(qū)別的，基于病毒RNAs的數(shù)目-隨伴病毒科具有1種RNA，而櫻桃銼葉病毒屬和溫州蜜柑矮縮病毒屬具有兩種RNA，以及基于衣殼蛋白的數(shù)目-溫州蜜柑矮縮病毒屬具有兩種CP，櫻桃銼葉病毒屬具有三種CP。這些標準間接表明，番茄灼燒病毒最可能是櫻桃銼葉病毒屬中的族(group)。然而，采用來自推定的RdRp和解旋酶蛋白的幾種不同基因座的種系發(fā)育分析，ToTV的定位(position)明顯不同于櫻桃銼葉病毒屬和溫州蜜柑矮縮病毒屬，而實際上暗示了其與隨伴病毒科更加緊密相關(guān)。遺憾的是，目前能夠獲得的只有來自僅有一種櫻桃銼葉病毒屬(CRLV)和兩種溫州蜜柑矮縮病毒屬(SDV和SMoV)的全序列。關(guān)于載體傳播的初步數(shù)據(jù)表明，ToTV可能是通過粉虱傳播的，而CRLV和溫州蜜柑矮縮病毒屬的天然載體還是未知的?；谀壳翱衫玫男畔?，包括序列信息以及在以下表1中提出的另外的分類學信息，新發(fā)現(xiàn)的病毒最有可能是一種新品種。表1對于新發(fā)現(xiàn)的ToTV病毒的分類學描述(如按照國際可接受方法的手冊“Matthew，sPlantVirology"(“Matthew，sPlantVirology”，第四版，RogerHull(編)AcademicPress，圣地亞哥，第15頁，其中的表2.1中所列出的)(在Matthews，的表中的編號被附加于以下表1中)本發(fā)明人近來發(fā)現(xiàn)，在中美洲(例如，墨西哥和危地馬拉)被命名為“巧克力斑病(Chocolatespotdisease)”、“巧克力病(Chocolate)”或“枯萎病(Marchitez)”的番茄疾病的相關(guān)病毒的基因組序列與本文中描述的ToTV相同(參見實施例2)。因此，與這些疾病相關(guān)的病原物(causalagent)是本發(fā)明的一個方面。由于更多的病毒序列可以獲得利用，從與其緊密相關(guān)或不緊密相關(guān)的非ToTV病毒，或從與其緊密相關(guān)的病毒或基本類似的ToTV病毒這兩方面，種系發(fā)育分析將會證明一種基于分離物之間的種系發(fā)育親緣關(guān)系來確定ToTV的分類單位或分化單位的有價值的方法。種系發(fā)育親緣關(guān)系可以例如基于病毒基因組的RNAl和/或RNA2中的任一種或所有核苷酸序列或衣殼蛋白(基因)序列數(shù)據(jù)來確定。種系發(fā)育分析對于技術(shù)人員而言是眾所周知的，例如可以包含通過基于的距離-樹形重構(gòu)法(例如，相鄰連接法)、通過采用ClustalX(Thompsonetal.,1997),PAUP(Swofford,2000)或PHYLIP(Felsenstein，1989)這種程序的最大可能性或簡約分析的方法。為了進行新型分離物、按照本文中提供的ToTV序列和源于例如GenBank、EMBL或DDBJ數(shù)據(jù)庫的病毒株的參考序列之間的種系發(fā)育親緣關(guān)系的分析，可以直接從被感染的植物中提取來自于所述新型分離物的基因組RNA，并且基因組序列可以由其擴增。采用PCR擴增法(RT-PCR)的逆轉(zhuǎn)錄，可以例如采用簡并寡核苷酸引物來實施，這樣的引物例如能夠?qū)τ趤碜园l(fā)散(divergent)的ToTV分離物的基因組以及與病毒種的基因組緊密相關(guān)的核酸序列的擴增起到擴增引物作用。優(yōu)選地，但并非必需地，全長基因組擴增產(chǎn)物由此可以從參照菌株(例如，發(fā)散分離物)、試驗菌株(ToTV易感分離物)和緊密相關(guān)的種獲得。優(yōu)選地，為了比較而對所感興趣的特異性基因區(qū)域進行擴增。然后就可以利用RT-PCR中所使用的簡并寡核苷酸引物，通過例如熒光標記雙脫氧核苷酸終止子的直接雙鏈核苷酸測序法(Smithetal.,1986)對擴增產(chǎn)物(DNA)進行測序。核苷酸序列編輯、分析、氨基酸序列的可選預(yù)測和比對，可以采用可用的軟件包，例如采用LaserGene序列分析軟件包第5版(DNASTAR,Inc.，Madison,Wis.)和IntelliGeneticsGenefforks2.5.1版(IntelliGenetics,MountainView,Calif.)軟件完成。然后，種系發(fā)育分析可以采用例如具有采用按照啟發(fā)式搜索的絕對距離和1，000次自展法重復(fù)分析(bootstrapreplicate)的相鄰連接算法的最大簡約性(PAUP)軟件的種系發(fā)育分析來進行，而種系發(fā)育樹通過對齊的臨近核苷酸或氨基酸序列的簡約性分析來產(chǎn)生，由此在這種分化樹中的數(shù)目一般表示引導置信度水平。1，000次復(fù)制之后，種系發(fā)育樹中的置信度水平超過60%，優(yōu)選超過70%，更優(yōu)選超過80%，90%，95%或98%，就會被認為是種系發(fā)育推論(在某一分化單位中分離物的定位)正確的足夠證據(jù)，條件是該分化樹足夠分支化，由此可選地分支化可以通過追根至合適的外族(out-group)的種而得以改進。這樣，就能夠確定哪種分離物與本文中提供的ToTV序列是最緊密相關(guān)的。親緣關(guān)系一般根據(jù)序列相似性百分數(shù)表示，在本文中稱之為序列同源性。盡管種系發(fā)育分析提供了當核酸具有足夠同源性時鑒別病毒的一種方便方法，但是本文中也提供了采用已知的病毒從所述病毒中鑒別所述病毒或病毒蛋白或核酸的幾種其他可能的更直接但稍顯粗糙的方法。作為主要(拇指，thumb)的規(guī)則，能夠與根據(jù)測序在本文中鑒別的病毒蛋白或核酸相比較，通過待識別的病毒蛋白或核酸的同源性百分比來鑒別ToTV病毒。病毒種，尤其是RNA病毒物種，經(jīng)常構(gòu)成類似的種，其中一簇所述病毒展示出其成員中的異質(zhì)性一般是已知的。因此，預(yù)期每一種分離物可以與本文中提供的分離物序列的同源性百分數(shù)稍有不同。由此，可以認為表現(xiàn)出與ToTV具有足夠序列同源性(例如，超過30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，95%，98%，或99%的序列同源性)的其他病毒分離物屬于相同的病毒。因此，本發(fā)明的ToTV病毒與本文中所提供的蛋白或核酸序列具有至少50%或60%的同源性，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更加優(yōu)選至少90%，更加優(yōu)選至少95%，更加優(yōu)選至少98%，且最優(yōu)選至少99%的同源性，并且會在茄科(Solanaceae)，更特別地是在茄屬(Solanum)和煙草屬(Nicotiana)中引起ToTV-誘發(fā)的疾病癥狀，這種疾病癥狀可以相似于或不相似于本文所描述的癥狀。在葫蘆科(Cucurbitaceae)中，該病毒看起來并未引起可觀察到的癥狀，但是該病毒能夠在該植物中繁衍。當人們期望將單獨的病毒分離物與本文描述的蛋白或核酸序列進行比較時，本發(fā)明通過測定所述單獨的病毒分離物的蛋白或核酸序列并確定所述的蛋白或核酸序列與本文中所列出的序列具有至少60%，優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更加優(yōu)選至少90%，更加優(yōu)選至少95%，更加優(yōu)選至少98%，且最優(yōu)選至少99%的百分數(shù)的序列同源性而提供了在種系發(fā)生學上可鑒定為對應(yīng)于ToTV的分離病毒(ToTV)。含有比這些所提及的最大值具有更高同源性的單個蛋白或核酸的病毒分離物就被認為是種系發(fā)生學上的對應(yīng)并由此在分類學上對應(yīng)于ToTV病毒，一般而言，該蛋白將由結(jié)構(gòu)上對應(yīng)于本文中所列序列的核酸序列編碼。因此，本發(fā)明提供了一種在種系發(fā)生學上對應(yīng)于本文中所列序列的分離病毒的病毒。應(yīng)該注意到，類似于其他病毒，從不同來源分離的ToTV-病毒之間能夠預(yù)計發(fā)現(xiàn)某種程度的變異。而且，按照本文提供的ToTV病毒或其片段的核苷酸或氨基酸序列，例如，顯示出低于95%，優(yōu)選低于90%，更優(yōu)選低于80%，更優(yōu)選低于70%，且最優(yōu)選低于60%的核苷酸序列同源性，或與任何非-ToTV病毒或最接近相關(guān)病毒的各核苷酸或氨基酸序列具有低于95%,優(yōu)選低于90%，更優(yōu)選低于80%，更優(yōu)選低于70%，以及最優(yōu)選低于60%的氨基酸序列同源性。全世界的ToTV菌株的序列趨異(sequencedivergence)在與其他植物病毒的相似性上可以稍微高一些。本發(fā)明通過確定所述病毒基因組的合適片段的核酸序列并在種系發(fā)育分析中對其進行測試從而提供了可鑒定為與其種系發(fā)生學上對應(yīng)的分離病毒(ToTV)，其中可以利用例如1000個以上所描述的自持(bootstrap)并發(fā)現(xiàn)其是種系發(fā)育學上比其相關(guān)于非ToTV對照菌株最接近相關(guān)菌株更為接近地相關(guān)于包含如本文中所列出的ToTV的SEQIDNO1或SEQIDNO:2序列的病毒分離物來產(chǎn)生最大似然樹?？梢杂糜谶@種種系發(fā)育分析的合適的核酸每一個基因組片段例如是在實施例中描述的5.5kb或8kbRNA片段(本文中分別稱為RNA2和RNA1)的核酸序列的任何部分。利用所提供的這種ToTV病毒的序列信息，本發(fā)明提供了適用于檢測樣品中的ToTV病毒的診斷方式和方法。優(yōu)選地，利用對ToTV病毒最具特異性的試劑來實施ToTV病毒的檢測。然而，這絕不意味著排除替代使用的特異性較差但具有充分的交叉反應(yīng)性的試劑的可能性，例如，因為它們是更易于獲得并且足以解決進行中的工作。例如，本發(fā)明提供的方法用于檢測植物，優(yōu)選番茄，更優(yōu)選番茄種植物中ToTV的存在。所述方法可以，例如，包含根據(jù)本發(fā)明通過將所述樣品與ToTV特異性核酸或抗體反應(yīng)而檢測所述樣品中ToTV病毒或其組分的存在。但是指示劑植物的接觸感染對于檢測所測試植物中病毒存在也是適合方法。本發(fā)明提供了新型分離的病毒(本文中也稱為ToTV病毒)和ToTV病毒特異性的組分或它們的合成類似物的部分核苷酸序列。對本文中提供的那些ToTV病毒的其他基因組序列可以通過技術(shù)人員已知的測序方法進行檢測。現(xiàn)在，基因組序列測定是技術(shù)人員充分認知的范圍，本發(fā)明提供了ToTV病毒，及其部分染色體組序列。這些方法包括，例如在以下實施例中描述的方法。一般而言，這樣的測序方法包括通過核酸分離方法來分離病毒基因組核酸，以及例如可選地通過將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA之后而通過雙脫氧鏈終止方法(Sangeretal.,1977)來檢測所分離核酸的核苷酸序列。本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明從病毒中可獲得的一種分離的或重組核酸或其病毒特異性功能片段等。分離的或重組的核酸包含本文中所列的序列或同源的序列，其能夠與那些在嚴格條件下的序列進行雜交。具體而言，本發(fā)明提供了適用于識別ToTV病毒核酸的引物和/或探針。能夠雜交到ToTV病毒的核酸序列中的其他探針和引物可以通過技術(shù)人員已知的方法進行開發(fā)。表達載體和病毒編碼基因的表達此外，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸的表達載體。首先，表達載體，如含有ToTV病毒基因組的(部分)雙鏈序列的質(zhì)粒載體、含有ToTV的(部分)基因組的病毒載體(例如，但不限于疫苗病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒)，或含有其他病毒或其他病原的(部分)基因組的ToTV病毒，是本發(fā)明的部分。表達載體可以包含在諸如啟動子的調(diào)控元件控制之下或可操作地連接到該調(diào)控元件的ToTV基因組序列或其部分。被稱為啟動子的DNA的片段的主要作用是將DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的調(diào)控。表達載體可以包含適用于表達植物細胞中、真菌細胞中、細菌細胞中、酵母細胞中、昆蟲細胞中或其他真核細胞中的基因，優(yōu)選適用于表達病毒蛋白-編碼基因的一種或多種啟動子。本發(fā)明的表達載體非常適用于提供基因表達系統(tǒng)中的病毒的抗原。而且，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的核酸或表達載體的宿主細胞。含有編碼ToTV病毒蛋白組分的核酸的質(zhì)?；虿《据d體，可以在用于在相關(guān)細胞類型(植物細胞、真菌細胞、細菌、昆蟲細胞、植物細胞或其他真核細胞)中表達該組分的真核細胞的中產(chǎn)生。含有ToTV病毒基因組的全長或部分復(fù)制體的質(zhì)粒和病毒載體可以在體內(nèi)或體外表達病毒核酸的真核細胞中產(chǎn)生。分離和純化ToTV的方法可以從被感染的植物或其他來源通過任何可用的方法來分離ToTV病毒。分離可以包含從合適的來源純化或部分純化ToTV病毒。許多種方法都可以用于病毒的分離和純化(例如，參見Dijkstra和DeJager,1998)。ToTV的純化可以例如通過利用例如用于線蟲傳多面體病毒組或大麥黃矮病毒組的標準方法(輔以有機溶劑)來實施(參見，例如Walker,2004)。盡管這種方案會導致病毒感染力損失，但是這些方法仍然可以用于獲得用于其他目的的病毒物質(zhì)。為了維持病毒的完整性，優(yōu)選使用溫和的純化方法來純化ToTV。這樣的溫和純化方法可以例如包含在均質(zhì)化緩沖液(包含例如0.IMTRIS-HCl緩沖劑pH約8、約20mM亞硫酸鈉[Na2SO3]、約IOmM二乙基二硫代氨基甲酸鈉[Na-DIECA]和約5mM乙二胺四乙酸鈉(Na-EDTA))中的均質(zhì)化的植物(例如，葉)的感染物質(zhì)，通過離心(例如，在49，OOOg時，離心30min)分離碎片，將上清液置于合適的蔗糖墊(sucrosecushion)(例如，20%)上并對病毒顆粒造粒(例如，通過以70，OOOg離心1.5h)。此后，可以使包含病毒顆粒的小球(pellet)再懸浮于合適的緩沖液(例如，TRIS-HCl，pH8)中，并將含病毒的部分通過采用在蔗糖梯度中的密度離心(例如，10%40%蔗糖均質(zhì)化緩沖劑以110，OOOg離心2h)從懸浮液的其余部分分離出來。含病毒的部分可以通過使用感染實驗來測定。進一步的純化可以通過利用在硫酸銫梯度中的密度離心(例如，在TRIS-HCl中的10-40%硫酸銫梯度，pH8，在125，OOOg下離心16h)。然后，從梯度收集富含病毒的條帶并通過離心或滲析(例如，針對0.IMTRIS-HCl,pH8)進一步濃縮。純化后，可以通過在敏感植物(例如，香花芥屬(N.hesperis)‘67A’)上接種來檢驗ToTV的感染力。towm^m&muam^mmmmTi^已經(jīng)制備了純化的或部分純化的ToTV病毒，就可以制備病毒相關(guān)蛋白(病毒編碼蛋白)的基本純凈的制備物。盡管許多可用于蛋白純化的方法和策略是本領(lǐng)域中已知的，但純化ToTV病毒蛋白如病毒衣殼蛋白的最方便的方法是通過采用例如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或通過親合色譜法的純化方法。這些方法中的每一種將在以下進行描述。所關(guān)心的ToTV的蛋白可以通過電泳采用例如兩性離子緩沖劑三(羥甲基)甲基甘氨酸-SDS-PAGE(Tricine-SDS-PAGE)(Schagger和VonJagow,1987)或甘氨酸-SDS-PAGE(Laemmli，1970)進行分離。當然也可以利用能夠解析包含于病毒分離物中的各種蛋白，從其基因組轉(zhuǎn)錄并在適合的表達系統(tǒng)中表達的其他電泳體系，例如，非變性凝膠電泳。包括靶蛋白的PAGE凝膠的面積，可以例如利用Elutrap儀(Schleicher&Schuell，Dassel，德國)來切除，而靶多肽可以從其中洗脫?？梢酝ㄟ^其相對于對照蛋白在凝膠中的流動性來鑒別靶蛋白。為了增加純度，可以使洗脫出的蛋白經(jīng)歷第二次SDS-PAGE凝膠電泳并第二次進行洗脫。然后可以再次洗脫在切除的凝膠片段中所含有的蛋白或肽，其適用于免疫或蛋白測序。所關(guān)心的ToTV的蛋白也可以利用特異性地結(jié)合于ToTV蛋白的抗體(例如單克隆抗體)通過親合色譜來純化?？贵w可以利用與載體上的官能團和抗體分子上的官能團(即，反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈)反應(yīng)的雙官能偶聯(lián)劑而共價耦合于固體載體，例如纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)右旋糖苷、微球瓊脂糖凝膠或受控的微孔玻璃。這種方法對于技術(shù)人員而言是方便可用的。所得的含抗體固體相抗體在利用PH、離子強度、溫度和容許所關(guān)心蛋白結(jié)合至固定抗體的保留時間減少的條件下與純化的或部分純化的病毒接觸。病毒或蛋白通過柱利用解離氫鍵的洗脫液而被從柱上洗脫下來。特定PH的緩沖液或超過約2M的NaCl溶液常用作洗脫液。利用抗體實施的親合色譜的方法以及利用其他蛋白(如病毒衣殼蛋白)實施的免疫親合純化的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(參見，例如Harlow和Lane，1988)。在本文提供的教導之下，技術(shù)人員能夠分離出ToTV的病毒特異性蛋白，確定例如所述蛋白N-端部分的氨基酸序列，設(shè)計出一組簡并探針(用于遺傳代碼的簡并)從而與用于編碼所述蛋白的一個區(qū)域的DNA雜交，在由病毒產(chǎn)生的基因文庫中的基因陣列上使用這些探針，獲得陽性雜交作用并定位對應(yīng)的基因。然后技術(shù)人員就能夠識別基因的結(jié)構(gòu)區(qū)域以及可選地能夠識別其上游和下游序列。此后，技術(shù)人員就能建立形成該蛋白的氨基酸殘基的正確序列?？贵w的牛產(chǎn)抗體，無論單克隆抗體還是多克隆抗體，都能夠以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法生成ToTV病毒的純化的或部分純化的蛋白或肽片段，這些方法包括在動物體內(nèi)作為抗原而注射該蛋白，通過雜交瘤融合和通過設(shè)計細菌或噬菌體系統(tǒng)的重組方法(參見，Marksetal.,1992a；Marksetal.,1992b；Lowmanetal.,1991；Lerneretal.,1992,其中每一篇參考文獻都公開了合適的方法)。針對抗病毒顆粒、病毒的蛋白或肽的抗體都可以通過單獨使用該顆粒、蛋白或肽或結(jié)合佐劑來免疫合適的脊椎動物宿主，優(yōu)選哺乳動物宿主，例如兔子、山羊、白鼠、家禽和老鼠來生產(chǎn)。通常涉及兩種或多種免疫，并在最后一次注射后的幾天內(nèi)收獲血液或脾。對于多克隆抗血清，免疫球蛋白可被沉淀、分離和(親合性)純化。對于單克隆抗體，脾細胞將一般與永生化淋巴細胞，例如骨髓系，在雜交瘤的選擇性條件下進行融合。然后就可以在有限稀釋條件下克隆雜交瘤，而篩分其上清液以使得抗體具有所需的特異性。生產(chǎn)(單克隆)抗體的技術(shù)和用于其制備和在各種方法中所使用的方法在文獻中是眾所周知的(參見，例如美國專利4，381，292，4，451，570和4，618，577；Harlow和Lane，1988；Ausubel,etal.，1998；Roseetal.，1997；Coliganetal.，1997)。典型地，針對病毒相關(guān)蛋白的抗體將具有至少1XIO51XIO7M.1的結(jié)合親合性。來自于ToTV病毒的重組蛋白，如可以通過在合適表達系統(tǒng)中表達病毒的編碼蛋白的基因組序列而獲得，其優(yōu)選作為抗原。然而，也可以使用純化的蛋白。適用于抗體檢測的抗原包括與任何暴露于或用ToTV病毒感染的哺乳動物的任何ToTV特異性抗體組合的任何ToTV蛋白。本發(fā)明優(yōu)選的抗原包括那些在暴露于ToTV的哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原，因此其典型地最易被哺乳動物的抗體識別。特別優(yōu)選的抗原包括ToTV的衣殼蛋白。來自純化病毒的結(jié)構(gòu)蛋白是最優(yōu)選的?？寺』蚪M序列，向表達載體并從表達載體處理染色體組序列，以及在異質(zhì)宿主中表達由基因組序列編碼的蛋白的方法是眾所周知的，并且這些技術(shù)能夠用于提供表達載體、宿主細胞和編碼抗原的克隆基因組序列，這些序列將在宿主中被表達以產(chǎn)生用于診斷分析的抗體(參見，例如Sambrooketal.，2001和Ausubel，etal.，1998)。各種表達系統(tǒng)都可用于生產(chǎn)ToTV抗原。例如，已經(jīng)描述了各種適用于在大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、酵母、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞中產(chǎn)生蛋白的表達載體，其中的任一種都可以用于生產(chǎn)適用于生產(chǎn)抗-ToTV抗體或其片段的ToTV抗原。當然，ToTV自身也可以用作這種目的的表達載體。本發(fā)明抗體的一種用途是篩選用于識別含編碼所關(guān)心的或結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白，免疫-交叉-反應(yīng)活性蛋白的cDNA插入物的克隆的cDNA表達文庫。這樣的cDNA表達文庫的篩選是本領(lǐng)域是公知的(參見，例如，Young和Davis，1983)，在本文中引用它和其他公開出版的來源作為參考。這些抗體的另一種用途是用于純化ToTV蛋白的親合色譜。這些抗體也適用于ToTV感染的分析。因此，本發(fā)明提供了ToTV-特異性病毒蛋白或其片段，此后稱之為蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子(proteinaceousmolecule)。有用的蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子例如是來自于可衍生自根據(jù)本發(fā)明病毒的任何基因組序列或其片段。這種蛋白質(zhì)分子，或其抗原片段，如本文中提供的適用于例如診斷方法或試劑盒以及診斷組合物。尤其有用的是那些由用于誘發(fā)ToTV病毒特異性抗體而識別的重組核酸片段編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子，無論是體內(nèi)的(例如，用于提供診斷抗體)還是體外的(例如，通過噬菌體展示技術(shù)或適用于產(chǎn)生合成抗體或其部分的其他技術(shù))。本文中也提供了抗體，其是天然的多克隆抗體或單克隆抗體，或合成抗體(例如，來自(噬菌體)文庫的結(jié)合分子)，其特異性地與包含蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子或其ToTV病毒特異性功能片段(如根據(jù)本發(fā)明的衣殼蛋白)的抗原發(fā)生反應(yīng)。作力ToTV病毒的iR勘丨病毒分離4勿的方法除了檢測ToTV病毒之外，還涉及診斷方法，本發(fā)明也涉及用于識別ToTV，即證實分離物是ToTV的方法。這種方法可以基于如上所述的種系發(fā)育推論，并確定未識別的病毒分離物與一種或多種經(jīng)證實的ToTV病毒和非ToTV病毒的參照菌株之間的核苷酸或氨基酸序列同源性水平。這種方法可以例如包含對病毒分離物或質(zhì)粒蛋白的(部分)基因組測序，并比較該序列與本文中為ToTV提供的序列之間的同源性水平。與按照本文提供的SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有超過50%的序列同源性水平的分離物就被認為是分類學上對應(yīng)于ToTV或?qū)儆赥oTV病毒分類單位。這樣的病毒是本發(fā)明的一部分。為了識別一種病毒為番茄灼燒病毒(ToTV)，也可以利用以上表1中表示的分類學描述符，并通過比較發(fā)現(xiàn)新的分離物屬于假設(shè)的新物種，其中ToTV菌株是通過本文中提供的SEQIDNO1和SEQIDNO2的核酸序列識別的，并且于2004年11月24日保藏在德國微生物及細胞保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，保藏登記號ToTV-EOl(DSM16999)，其被分配為類型種(typespecies)。因此，為了將評價病毒為ToTV而實施序列對比并不是至關(guān)重要的。相反，識別病毒為番茄灼燒病毒(ToTV)的方法可以包含評價是否存在選自由以下組成的組中的分類學描述符的組合的步驟a)形態(tài)學描述符，如球形，直徑約28nm的非包膜病毒微粒；b)基因組性質(zhì)描述符，如基于含有聚腺苷酸(poly(A))尾的兩種RNA片段具有單鏈線性正義RNA病毒性質(zhì)，它們包含分別編碼5.5kDa和SkDa聚蛋白并包含編碼區(qū)域或3種衣殼蛋白、解旋酶、蛋白酶、RdRP和假定的運動蛋白的基因座，并且其RNA片段和/或聚蛋白和/或基因座基于基本按照本文的描述的序列比對具有同源性，和c)生物學性質(zhì)描述符，如在番茄中產(chǎn)生壞死病變和灼燒樣癥狀，具有基本如本文中描述的宿主范圍、載體關(guān)系和/或地理分布，并與當?shù)匾阎麨槿缱茻?、枯萎?或巧克力斑的番茄植物疾病相關(guān)。分類學描述符的組合導致將病毒分離物正識別為番茄灼燒病毒(ToTV)，即該組合顯示出該分離物比另外的病毒更接近地相關(guān)(基于熟練技術(shù)人員所熟知的數(shù)字分類方法)于如本文中描述的ToTV，并且其中所述分離物優(yōu)選在番茄中產(chǎn)生如本文中描述的灼燒類型的疾病癥狀。因此，基于基本如表1中所定義分類學描述符的數(shù)字分類學分析，表明病毒比本申請?zhí)峤粫r已知的其他病毒更接近相關(guān)于本文中權(quán)利要求1中所限定的病毒，并且該病毒與在番茄中引起壞死病變的疾病相關(guān)，該病毒在本文中被認為是ToTV并且屬于本發(fā)明的范圍。這樣，本發(fā)明提供了利用根據(jù)本發(fā)明的方法可識別為分類學上對應(yīng)于可識別為屬于ToTV病毒分類單元的病毒的植物病毒的病毒分離物。根據(jù)種系發(fā)育相關(guān)性，或與其他病毒分類單元的區(qū)別，ToTV病毒分類單元可以是分離物、種、屬或甚至是病毒的一個科。可替代地，識別病毒分離物為ToTV病毒的方法可以基于癥狀學，即通過疾病癥狀來識別病毒。然而，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗體適用于識別病毒分離物為ToTV病毒的方法，條件是這種抗體與相關(guān)的非-ToTV菌株的交叉反應(yīng)性已經(jīng)被有效地排除。這種方法包含使所述病毒分離物或其組分與本文中提供的抗體反應(yīng)的步驟。本文中的反應(yīng)是指使得抗體-抗原發(fā)生結(jié)合。例如，這能夠通過利用純化的或非純化的ToTV病毒或其部分(蛋白、肽)來實現(xiàn)。優(yōu)選地，利用任何合適的免疫學方法使用感染的細胞或細胞培養(yǎng)物來識別病毒抗原。在這方面，特別有用的是針對ToTV病毒衣殼蛋白而產(chǎn)生的抗體。識別病毒分離物為ToTV病毒的其他優(yōu)選方法包含使所述病毒分離物或其組分與根據(jù)本發(fā)明的病毒特異性多核苷酸發(fā)生反應(yīng)，這種多核苷酸能夠在嚴格條件下雜交至選自由SEQIDNO1,SEQIDNO:2、與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2具有至少60%核苷酸序列同源性的序列和它們的互補鏈以及它們的ToTV提議性片段組成的組中核酸序列。這樣的雜交反應(yīng)可以技術(shù)人員可利用的任何形式實施，并且一般會涉及組織印漬(tissueprinting)法、斑點印跡方法、DNA/RNA印跡法或雜交、原位雜交法、PCR、RT-PCR等。免疫學檢測方法本發(fā)明的檢測抗原的方法原則上能夠通過利用任何免疫學方法來實施，例如經(jīng)典的免疫熒光(IF)法、免疫組織化學技術(shù)或相當?shù)目乖瓩z測分析格式。優(yōu)選的基于病毒衣殼蛋白的檢測的ToTV檢測方法，可以例如包括這樣的方法沉淀和凝集試驗、放射免疫分析(RIA)、免疫金標記、免疫吸附電鏡(ISEM)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法和免疫印跡法。這些能夠利用本發(fā)明抗體的免疫分析的實例以直接或間接的方式進行競爭性和非競爭性的免疫分析。抗體能夠用于液相中的或結(jié)合于固相載體的免疫分析中。另外，這些免疫分析中的抗體能夠可檢測地以各種方式進行標記。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過度實驗就能夠知曉或能夠易于分辨合適的免疫分析方式。分析方式在文獻中是眾所周知的，例如，描述于文獻Harlow和Lane(1988)中。各種免疫分析方式可以用于選擇與根據(jù)本發(fā)明的具體多肽如ToTV病毒外殼蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫分析常規(guī)上就是用于這個目的。參見用于描述能夠用于確定選擇性結(jié)合的免疫分析方式和條件的文獻Harlow和Lane(1988)。抗體能夠結(jié)合于許多不同的載體并被用于檢測靶分子的存在?？商娲兀乖梢越Y(jié)合于許多不同的載體并被用于檢測抗體的存在。公知的載體實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龍、淀粉酶、天然的和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。載體的性質(zhì)對于本發(fā)明的目的能夠是可溶的或不可溶的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解結(jié)合抗體的其他合適載體，或能夠知曉這種常規(guī)使用的實驗載體。蛋白質(zhì)印跡分析法一般在文獻Harlow和Lane(1988)中描述。根據(jù)這種方法，病毒蛋白(和病毒制劑中的其他蛋白)通過凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至固相(即，膜，如硝基纖維)中。隨后使固定的抗原與抗體和檢測體系(如堿性磷酸酶-偶聯(lián)的二抗)反應(yīng)。這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，在分析中包含合適的陰性和陽性對照物質(zhì)(如基本純化的抗原或ToTV病毒)是有利的。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)—般描述于文獻Harlow和Lane(1988)中。該分析涉及病毒組分(例如，衣殼蛋白)與抗體的反應(yīng)。在一種實施方式中，樣品可以包含種植在土地中的植物組織并與已經(jīng)涂覆到固相如測試板上的抗體反應(yīng)。如果樣品中存在病毒，則酶標記的特異性抗體就會結(jié)合成抗體_病毒復(fù)合物，并通過產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶底物反應(yīng)進行檢測。ELISA分析的優(yōu)選方法是直接雙抗體夾心(DAS)ELISA(Clark和Adams，1977)、DAS間接ELISA(Velaetal.1986)或TAS-ELISA。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在ELISA或任何其他類型的分析中，有時需要例如通過將兩種或多種具有不同特異性的抗體混合并分析本發(fā)明的某種或所有保護性衣殼有關(guān)蛋白而再一個反應(yīng)中確定超過一種病毒衣殼蛋白的存在是顯而易見的?；诤怂岬臋z測方法ToTV由至少兩個核糖核酸(RNA)構(gòu)成。對于存在三種保護性衣殼蛋白具有強烈的指示。以上描述的方法主要集中于用于病毒檢測的病毒蛋白免疫學檢測。通過重組DNA技術(shù)，是可以生產(chǎn)直接或間接雜化于病毒RNA(或它們的互補體)或通過反轉(zhuǎn)錄由其生產(chǎn)的cDNA的探針，并且它們能夠用于檢測該病毒的分析中。核酸擴增技術(shù)使得可以以非常低的量存在的病毒核酸片段發(fā)生擴增。為了開發(fā)給予核酸的檢測方法，必須確定病毒特異性序列，然后就可以開發(fā)引物或探針。為了通過核酸擴增和/或探針雜交來檢測ToTV，可以對ToTV的衣殼蛋白進行測序或，可替代地，可以從純化的病毒中分離出病毒基因組RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA并直接克隆和/或進行測序。利用所克隆的核酸作為雜交探針，利用來自于該克隆的序列信息，或通過設(shè)計基于ToTV蛋白的氨基酸序列的簡并引物，核酸雜交探針和/或核酸擴增引物可以設(shè)計為用于檢測樣品中是否存在本文所提供的病毒的檢測分析。本發(fā)明的檢測核酸的方法原則上能夠通過利用任何核酸擴增方法來實施，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；Mullis和Faloona,1987；美國專利第4，683，195號；第4，683，202號；以及第4，800，159號)或通過利用擴增反應(yīng)如連接酶鏈反應(yīng)(LCR;Barany，1991；EPO320308)、自主序列復(fù)制(3SR;Guatellietal.，1990)、鏈置換擴增(SDA;Walkeretal.，1992；美國專利第5，270，184號和第5,455,166)號、轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(TAS；Kwohetal.，1989)、Q-β-復(fù)制酶(Lizardietal.，1988)、滾環(huán)擴增(RCA；美國專利第5，871，921號)、基于核酸序列的擴增(NASBA；Compton,1991)、裂解酶片段長度多態(tài)性(美國專利第5，719，028號)、從核酸的等溫嵌合引物開始的擴增(ICAN)、分支延伸擴增法(Ramification-extensionAmplificationMethod)(RAM;美國專利第5,719,028號和第5，942，391號)或其他核酸擴增的合適方法。由于該病毒是RNA病毒(S卩，圖5和圖6的序列是病毒RNA基因組的DNA等價物)，因此合適的檢測方法可以包括從樣品，例如從被感染的植物中通過利用技術(shù)人員本身已知方法(例如，Chomczynski和Sacchi，1987；Boometal.，1990)或可商購的系統(tǒng)(例如，RNeasy總RNA分離試劑盒或RNeasy植物RNA分離試劑盒，QIAGENGmbH,Hilden，德國，或High-Pure-RNA-Isolation-.Kit,RocheDiagnostics,F.Hoffmann-LaRocheLtd的分公司，巴塞爾，瑞士)中分離出病毒核酸?？梢岳鐝娜~物質(zhì)或植物細胞的原生質(zhì)體提取總RNA，然后就可以利用例如禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶或莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV)反轉(zhuǎn)錄酶將總RNA，或具體地是病毒的基因組RNA，或它們的部分反轉(zhuǎn)錄成cDNA。合適的方法可以包括例如將合適用量的總RNA(例如，1至5yg)、合適用量(例如，IOpmol)的反轉(zhuǎn)錄引物、合適用量的dNTP和反轉(zhuǎn)錄酶混合于合適的含水緩沖系統(tǒng)(例如，商購的RT緩沖液)中，通過煮沸Imin使核酸變性，并在冰上冷卻，接著通過在例如45°C下按照所使用的推薦使用的特異性反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄持續(xù)lh，以獲得病毒序列的cDNA復(fù)本。可以使用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸作為反轉(zhuǎn)錄引物，例如，包含ToTV基因組序列的互補核苷酸序列的18-25-mer寡核苷酸或優(yōu)選至少能夠在嚴格條件下雜交于SEQIDNO1或SEQIDNO:2核酸序列，或它們的ToTV-特異性片段。可替代地，可以使用特異性聚T引物(寡dT引物)來啟動從多聚腺苷酸RNA基因座開始的反轉(zhuǎn)錄。在RT-步驟之后，所獲得的cDNA可以通過利用例如特異于病毒染色體組cDNA序列的Pfu和TaqDNA聚合酶和擴增引物進行PCR擴增。而且，完全商購系統(tǒng)可以用于RT-PCR(例如，Promega[MadisonWI,USA]的AccessandAccessQuickRT-PCRSystems，或由RocheDiagnostics[F.Hoffmann-LaRocheLtd的分公司，瑞士巴塞爾]提供的TitanOneTubeRT-PCRSystem或兩步RT-PCR系統(tǒng))。為了對一個或多個擴增引物擴增核酸而僅產(chǎn)生少量的錯配，擴增反應(yīng)可以在降低嚴格程度的條件下進行(例如，采用38°C的退火溫度，或存在3.5mMMgCl2的PCR擴增)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇合適的嚴格程度條件。本文中所選擇的引物是“基本”互補(即至少65%，更優(yōu)選至少80%的完全互補)于其在待擴增的每一特異性序列的不同鏈上的靶區(qū)域。可以利用含有例如肌醇殘基或多義堿基的引物序列，或者甚至是當與靶序列進行比較時含有一種或多種錯配的引物。一般而言，序列表現(xiàn)出與靶DNA或RNA寡核苷酸序列具有至少65%，更優(yōu)選至少80%的同源性就被認為適用于本發(fā)明的方法。當采用低嚴格度的雜交條件時，序列錯配也并不是關(guān)鍵性的。擴增產(chǎn)物的刪除原則上能夠通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法完成。擴增片段可以直接染色或用放射性活性標記物、抗體、發(fā)光染料、熒光染料或酶制劑進行標記。直接DNA染色包括例如嵌入染料如吖啶橙、溴乙菲啶、疊氮溴化乙錠或赫斯特熒光染料(Hoechstdye)0可替代地，DNA或RNA片段可以通過將標記的dNTP堿基引入到合成的片段中來進行檢測。與核苷酸堿基相關(guān)檢測標記，包括例如，熒光素、花青染料、異羥基洋地黃毒甙元(DIG)或溴脫氧尿苷(BrdUrd)。當采用探針基檢測系統(tǒng)時，本發(fā)明中所使用的合適檢測方法可以例如包含酶免疫分析(EIA)方式(Jacobsetal.，1997)。對于通過EIA方法的方式實施檢測，在擴增反應(yīng)中采用的正向或反向引物可以包含捕獲基團，諸如在例如用于隨后靶DNA-擴增子的EIA檢測的涂覆了抗生蛋白鏈菌素的微量滴定板孔的上或涂覆了抗生蛋白鏈菌素的Dynabeads(DynalBiotech，奧斯陸，挪威)的固定靶DNAPCR擴增子的生物素基團。普通技術(shù)人員將理解，在EIA方式中用于固定靶DNAPCR擴增子的其他基團也可以采用。用于檢測本文中公開的靶核酸序列的探針，優(yōu)選僅僅結(jié)合于按照核酸擴增方法擴增的至少一部分核酸序列區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要進行本文披露以外的過度實驗就能夠制備用于基于靶核酸的核苷酸序列進行檢測的合適探針。而且，靶核苷酸的互補核苷酸序列，無論是DNA或RNA或是化學合成類似物，都可以合適地用作本發(fā)明方法中的類型特異性檢測探針，條件是這樣的互補鏈在所采用的擴增反應(yīng)中進行擴增。本文中適用的合適檢測方法可以例如包含擴增子固定和通過例如RNA印跡法和DNA印跡法檢測其核酸序列。其他方式可以包含上文描述的EIA方式。為了便于檢測結(jié)合作用，特異性擴增子檢測探針可以包含標記部分，如熒光基團、發(fā)色團、酶或放射標記，以使得便于監(jiān)控探針結(jié)合于擴增反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物。這種標記是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括例如，異硫氰酸酯熒光素(FITC)、半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、抗生蛋白鏈菌素、生物素、異羥基洋地黃毒甙元、35S、14C、32p或1251。其他實例對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。檢測也可以通過所謂的反向線性印跡(reverselineblot,RLB)分析來實施，例如由文獻VandenBruleetal.(2002)中描述的。為此目的，RLB探針優(yōu)選采用5'-氨基合成以用于隨后將其固定于例如羧基涂覆的尼龍膜上。RLB方式的優(yōu)點是該系統(tǒng)的便利性和其速度，由此使得能夠?qū)崿F(xiàn)高處理量的樣品處理。核酸探針用于檢測RNA或DNA片段在本領(lǐng)域中是眾所周知的。大多數(shù)這些方法包含靶核酸與探針的雜交，接著是雜交后的沖洗。特異性典型地是雜交后沖洗的功能，關(guān)鍵因素是離子強度和最后一次沖洗溶液的溫度。對于核酸雜種，Tm能夠從Meinkoth和Wahl(1984)的方程式近似得到=Tm=81.5°C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)-0.61(%形式)-500/L；其中M是單鍵陽離子的摩爾濃度，％GC是在核酸中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分數(shù)，％形式(％form)是在雜交溶液中甲酰胺的百分數(shù)，而L是堿基對中雜種的長度。Tm是溫度(在所限定的離子強度和PH之下)，在該溫度下，50%的互補靶序列雜交至最佳匹配的探針。對于每錯配，Tm降低約1°C；因此，雜交和/或沖洗條件能夠被調(diào)節(jié)為雜交至所需同一性的序列中。例如，如果所尋找同一性為>90%的序列，就使Tm降低10°C。一般而言，選擇嚴格的條件以使得對于在所指定的離子強度和PH下的特異性序列和其互補序列比熱熔點(Tm)低大約5°C。然而，強烈的嚴格條件能夠利用在低于熱熔點(Tm)l°C、2°C、3°C或4°C的溫度下進行雜交和/或沖洗；中等嚴格條件能夠利用在低于熱熔點(Tm)6°C、7°C、8°C、9°C或10°C的溫度下進行雜交和/或沖洗；低嚴格條件能夠利用在低于熱熔點(Tm)11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C的溫度下進行雜交和/或沖洗。利用該方程，雜交和沖洗組合物，以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將會理解到，雜交和/或沖洗溶液的嚴格度變化也從本質(zhì)上進行了描述。如果所需錯配程度導致Tm低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度從而能夠使用更高的溫度。核酸雜交的廣泛指南在文獻Tijssen,1993；Ausubeletal.，1998中能夠找到。在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測ToTVRNA或cDNA的寡核苷酸探針。本文中的檢測探針經(jīng)過選擇是“基本”互補于單鏈RNA分子，或互補于由本發(fā)明擴增反應(yīng)產(chǎn)生的雙鏈核酸的兩條鏈中的一條。優(yōu)選地，該探針與由靶RNA或DNA產(chǎn)生的擴增子的可選固定的(例如，生物素標記的)反義鏈基本上互補。對于本發(fā)明的檢測探針，可以使其靶序列含有一個或多個錯配。一般而言，與靶寡核苷酸序列表現(xiàn)出至少65%，更優(yōu)選至少80%的同源性的序列，就被認為適用于本發(fā)明的方法。ToTV抗件棺物本發(fā)明進一步涉及識別ToTV抗性植物，或其部件的方法。識別ToTV抗性植物存在各種可能性。在這種方法的第一組實施方式中，可以使用活性/傳染性病毒或全長感染克隆體，而在可替代的實施方式中僅使用病毒檢測方法。利用活性/傳染性病毒識別ToTV抗性植物的方法的第一步包含將植物或植物部件如葉或莖片段暴露于感染劑量的ToTV，目的是使其發(fā)生感染?？梢栽谠S多情況下，暴露涉及發(fā)生物理接觸。所測試的植物之間和ToTV-分離物之間的感染劑量可以有所不同。理論上講，約1至10的用量至約500至5000的所述病毒顆粒或其核酸的用量是足夠的。這樣就通過在健康的植物上機械接種純化的病毒顆或病毒核酸而實現(xiàn)了感染。可替代地，感染可以通過以下步驟實現(xiàn)，例如_在感染ToTV的根莖上生長健康幼芽，或反之亦然；-將健康植物暴露于含有該病毒的傳播載體(包括感染的植物，例如寄生植物，如菟絲子屬)；_將攜帶ToTV病毒基因組編碼區(qū)域的表達載體引入到健康植物中；-使用土壤感染(agro-infectious)克隆，如含有攜帶ToTV病毒基因組編碼區(qū)域的表達載體的根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株。在本發(fā)明的上下文中，將植物或植物部件暴露于感染劑量的ToTV的方法并不限于任何特定的方法。正如所述，感染可以包含在健康植物上機械接種病毒。例如，可直接將患病的葉的部分在待感染植物的葉上摩擦。在可替代的方法中，可以例如通過采用研缽和研棒，或任何其他合適類型的均質(zhì)化器，例如在適合接種的緩沖液(例如，0.03M磷酸鹽緩沖液，pH7.7)中碾磨含病毒植物組織，優(yōu)選顯示癥狀的新葉，來制備接種物。碾磨之后，優(yōu)選對所獲得的勻漿(樹液)進行過濾，例如通過粗濾布進行過濾。然后，對該樹液進行接種，例如通過用一定量的樹液與葉子稍微接觸。優(yōu)選對葉子進行預(yù)處理以破壞下表皮并增強病毒的進入。這例如可以通過用碳化硅粉末對葉子實施預(yù)撒粉(pre-dusting)而實現(xiàn)。優(yōu)選避免過度損傷。優(yōu)選所使用的碳化硅粉末為在顯微鏡下觀察帶有角的小顆粒碳化硅(400500目)。也可以將碳化硅粉末直接加入到樹液中，在這種情況下，就可以省略預(yù)處理。樹液可以，例如，用食指、樹液浸飽的泡沫材料墊或纖維材料墊來施加，或甚至采用碾磨用的搗杵、玻璃刮鏟、硬刷、或噴槍來施加。接種后，這些葉子優(yōu)選立即用水沖洗。識別ToTV抗性植物的方法的第二步包含，在所述暴露之后，當出現(xiàn)以下情況之一時就將所述植物鑒別為ToTV抗性植物i)在所述植物或植物部件中疾病癥狀保持不存在或延遲表達或至少嚴重程度降低或相對于易感和/或敏感對照植物是局部性的，和/或ii)ToTV病毒或ToTV基因組序列并不存在于所述植物或植物部件中或所述植物中存在的ToTV病毒至少從數(shù)量上相對于易感對照植物發(fā)生了降低。本文中所使用的術(shù)語“局部化”意指僅限于接種的葉子?？梢酝ㄟ^定量方法，例如其中可辨別(例如，可見的)疾病癥狀發(fā)展所需的時間是顯著的，或通過定性方法，其中在一定時間過去之后檢查植物癥狀表達并指示出癥狀的存在或嚴重程度，來確定ToTV-誘導的疾病癥狀在感染植物中的發(fā)展。除了檢測ToTV-誘導的疾病癥狀的發(fā)展或其可替代的情況之外，根據(jù)待檢測的ToTV抗性的類型，在植物或植物部件中檢測病毒存在。為了在試驗植物中檢測不存在病毒，原則上可以使用任何方法。例如，可以使用其中采用根據(jù)本發(fā)明的ToTV特異性抗體、引物組或探針的方法?？商娲?，可以使部分試驗植物與易感指示植物(例如，香花芥屬‘67A’)接觸，以確定試驗植物上是否存在病毒。技術(shù)人員將會理解，對于這種方法，為了區(qū)別傳播載體、耐受性試驗植物和抗性的試驗植物，試驗植物表面的凈化是很重要的，因為僅僅需要確定病毒存在于植物細胞中。在實施是被ToTV抗性植物的方法的第二步驟中，可以獲得以下結(jié)果。如果在成功接種之后(例如，確定在易感和銘感對照植物中將會產(chǎn)生感染的條件下建立植物病毒接觸之后)i)疾病癥狀保持不存在；或病毒顆粒、或沒有檢測到病毒RNA該植物是抗性的；ii)疾病癥狀延遲或嚴重程度降低；或能夠檢測到的病毒顆?；虿《綬NA的系統(tǒng)滴度較低該植物是部分抗性的；iii)疾病癥狀嚴重，但保持在局部，限于接種的葉并且沒有系統(tǒng)地傳播超過接種的組織；或僅僅在局部檢測到病毒顆粒、或病毒RNA該植物是高度敏感的；iv)如果保持不存在疾病癥狀；但能夠檢測到病毒顆粒、或病毒RNA該植物是耐受性的。ν)如果植物的疾病癥狀發(fā)展，并且系統(tǒng)病毒滴度較高，則該植物是易感的和敏感性的。這樣的植物的實例是從中分離出本發(fā)明病毒的植物。這些植物在本發(fā)明的方法中可以用作合適的對照植物。出于生產(chǎn)抗性植物的目的，并從植物衛(wèi)生學的觀點來看，僅認為對產(chǎn)出i)、ii)和iii)是感興趣的。出于獲得適用于生產(chǎn)無癥狀的作物和產(chǎn)品的植物的目的，產(chǎn)出iv)也具有特殊的商品化意義。在用于鑒別ToTV抗性植物的方法的一種可替代實施方式中，僅可以使用病毒檢測方式。例如，可以通過觀察或識別在有癥狀植物中的無癥狀植物病并通過實施根據(jù)本發(fā)明的任何病毒檢測方法來確定所述植物中不存在病毒而在野外識別ToTV抗性植物。事實上，這對應(yīng)于識別ToTV抗性植物的方法，其中將植物或植物部件暴露于感染劑量的ToTV的步驟a)是被動實施的(例如自然而然地)。當實施這樣的方法時，優(yōu)選使用根據(jù)本發(fā)明檢測在樣品中存在ToTV的方法，其中ToTV病毒或其組分的存在是通過使所述樣品與本發(fā)明的多核苷酸或抗體反應(yīng)而實施的。優(yōu)選地，識別ToTV抗性植物的方法需要使用本發(fā)明的病毒或根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或抗體。本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)ToTV抗性植物或其部件的方法。在識別出ToTV抗性植物之后，該植物就可以用作遺傳物質(zhì)的供體植物，該遺傳物質(zhì)從所述供體植物傳遞至受體植物而為該受體植物提供遺傳物質(zhì)。從供體植物向受體植物的遺傳物質(zhì)傳遞可以通過本領(lǐng)內(nèi)已知的任何合適的方法進行。遺傳物質(zhì)在大多數(shù)情況下是基因組物質(zhì)。然而，至少傳遞供體植物基因組的賦予抗性的部分是很重要的。在缺少測定供體植物基因組的哪一部分賦予ToTV抗性的方法時，可以通過傳遞完整染色體而合適地進行。優(yōu)選地，使用ToTV抗性植物作為生產(chǎn)抗性后代植物的雜交中的雌性或雄性親本植物，由此后代植物接受來自抗性供體的基因組物質(zhì)而起到受體植物的作用。盡管在狹義上雜交中的易感親本并不必需是受體植物，但是這種易感親本將也包含在在本文中的術(shù)語“受體植物”中。在生產(chǎn)ToTV抗性植物的方法中，原生質(zhì)體融合也能夠用于將賦予抗性的基因組物質(zhì)從供體植物傳遞至受體植物中，即作為一種所述植物的雜交方式。原生質(zhì)體融合是一種在兩種或多種原生質(zhì)體之間(其細胞的細胞壁通過酶處理而被除去)的誘導或自發(fā)結(jié)合(spontaneousunion)，如體細胞雜交，而生產(chǎn)單個的雙核細胞或多核細胞。融合的細胞甚至可以采用在自然界不可能進行種間育種的植物物種而獲得，其經(jīng)過組織培育至展示出所需組合性狀的雜種植物。更具體而言，第一原生質(zhì)體能夠從對ToTV感染表現(xiàn)出抗性的番茄植物或其他植物種系中獲取。例如，可以使用來自ToTV抗性(番茄、茄子、胡椒、甜瓜、西瓜或黃瓜)種系的原生質(zhì)體。第二原生質(zhì)體能夠從易感的第二植物種系獲取，可選地來自另一植物物種或變體，優(yōu)選來自相同的植物物種或變體，其包含商業(yè)化所需的特性，例如，但不限于疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等。然后采用常規(guī)的原生質(zhì)融合方法來融合這些原生質(zhì)體，這在生產(chǎn)雜交體(cross)的領(lǐng)域內(nèi)是已知的?？商娲?，在將賦予抗性的基因組物質(zhì)從供體植物傳遞至受體植物的轉(zhuǎn)移之中可以采用胚胎拯救技術(shù)，即作為一種所述植物雜交的方式。胚胎拯救技術(shù)能夠用作從不能產(chǎn)生活種子的植物的雜交體中分離胚胎的方法。在這種方法中，對植物的受精子房或未成熟的種子進行組織培育以產(chǎn)生新的植物(這種方法詳細描述于文獻Pierik，1999之中)。因此，在一種實施方式中，生產(chǎn)ToTV抗性植物的方法包含根據(jù)上文中描述的識別ToTV抗性供體植物并使所述ToTV抗性供體植物與受體植物如上所述進行雜交，從而生產(chǎn)抗性后代植物的步驟。生產(chǎn)ToTV抗性植物的方法進一步包含通過按照先前描述的實施識別ToTV抗性植物的方法而從后代植物中選擇抗性植物的步驟。優(yōu)選地，所述ToTV抗性供體植物是茄科或葫蘆科的植物，更加優(yōu)選番茄、茄子、胡椒、甜瓜、西瓜或黃瓜。優(yōu)選地，所述受體植物是茄科或葫蘆科的植物，更加優(yōu)選番茄、茄子、胡椒、甜瓜、西瓜或黃瓜。更優(yōu)選地，所述受體植物是番茄(Solanumlycopersicum)，更加優(yōu)選具有商業(yè)化所需特性的番茄植物。受體植物可以是ToTV易感性植物、ToTV敏感性植物或ToTV抗性植物。如前述的解釋，植物的選擇將主要取決于抗性性狀是顯性的還是隱性的。技術(shù)人員知道可以用于解決這個問題的各種方法。而且，本發(fā)明的一個方面是可以通過本發(fā)明的方法獲得ToTV抗性植物，或其部件。如上所述，用于生產(chǎn)ToTV抗性植物的方法的一種優(yōu)選實施方式包含通過雜交使所述賦予抗性的核酸序列從ToTV抗性供體植物基因滲入到受體植物而進行的的轉(zhuǎn)移。根據(jù)該優(yōu)選實施方式培育的抗性植物能夠從受體植物有利地獲得其大多數(shù)性狀，并從供體植物獲得ToTV抗性。在一種方法中，稱為譜系培育(pedigreebreeding，)，使對ToTV表現(xiàn)出抗性的供體植物與優(yōu)選展示商業(yè)化所需性狀，例如但不限于，疾病抗性、昆蟲抗性、有價值的果實特性等的受體植物進行雜交。然后將所得植物種群(表示為F1雜種)自花授粉以產(chǎn)生種子(F2種子)。然后在由F2種子生長得到的F2植物中篩選ToTV抗性?？梢园凑赵S多不同的方式來篩選種群，優(yōu)選實施本發(fā)明的方法以進行目測檢查。首先因為ToTV抗性植物的鑒別僅僅通過本發(fā)明才是可能的，因此生產(chǎn)抗性植物的方法是本發(fā)明的一個方面。而且，本發(fā)明的另一個方面是能夠通過本發(fā)明的方法獲得的ToTV抗性植物，或其部件。本發(fā)明提供了通過提供抗性番茄植物以及排除攜帶ToTV病毒的植物來預(yù)防ToTV感染在番茄植物中傳播的方法。這些措施可以構(gòu)成改進與ToTV病毒相關(guān)的植物檢疫(phytosanitation)的一般策略的一部分。因此，耐性植物可以被識別并消除以便排除這種ToTV病毒來源。在生產(chǎn)ToTV抗性植物或其部件的方法的一種實施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)ToTV-耐性植物的方法。耐性植物可以提供有價值的作物、果實和種子，因為盡管該植物可能隱藏這種病毒，但是其并未表現(xiàn)出疾病癥狀。這種方法涉及耐性植物的鑒別，以及這種耐性植物用作所需遺傳物質(zhì)來源或供體的用途。其目的并不是提供能夠抵抗病毒侵入細胞或在細胞中復(fù)制的植物，而是提供不具有癥狀的植物。因此，本發(fā)明涉及鑒別ToTV耐性植物的方法，包含以下步驟a)將植物或植物部件暴露于感染劑量的ToTV，和b)當所述植物暴露之后，所述植物或植物部件中仍保持無疾病癥狀且ToTV存在于所述植物或植物部件中時，將所述植物鑒別為ToTV耐性植物?？梢酝ㄟ^定量方法，例如其中可辨識(例如，可見的)疾病癥狀發(fā)展所需的時間是顯著的，或通過定性方法，其中在一定時間過去之后檢查植物不存在癥狀表達并指示出癥狀的嚴重程度，來確定ToTV-誘導的疾病-癥狀感染的植物中的發(fā)展。在一種優(yōu)選的實施方式中，在步驟b)中通過實施包含通過將所述植物或植物部件與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或根據(jù)本發(fā)明的抗體進行反應(yīng)而檢測所述植物或植物部件中的ToTV病毒或其組分存在的方法，來確定在所述植物或植物部件中ToTV的存在。診斷試劑盒本文中提供的方法和裝置尤其適用于通過病毒學診斷ToTV病毒感染的診斷試劑盒。這樣的試劑盒或分析可以例如包含根據(jù)本發(fā)明的病毒、核酸、蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子或其片段、和/或抗體。本發(fā)明也提供了包含根據(jù)本發(fā)明的病毒、核酸、蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子或其片段，和/或抗體的用于診斷ToTV感染的診斷試劑盒，并且優(yōu)選用于檢測所述ToTV病毒、ToTV病毒特異性核酸、蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子或其片段，和/或抗體的裝置，所述裝置例如包含敏感的基團，如本領(lǐng)域中使用的熒光基團或酶檢測系統(tǒng)(合適的診斷試劑盒的形式的實例包括IF、ELISA、中和分析、RT-PCR分析、雜交分析)。合適的檢測分析包括直接和間接分析、夾心分析，諸如那些使用孔板或小珠等的固相分析和液相分析。合適的分析包括那些利用一抗和二抗的分析，以及那些利用諸如蛋白A的抗體結(jié)合試劑的分析。而且，本發(fā)明中可以使用各種檢測方法，包括比色法、熒光法、磷光法、化學發(fā)光法、冷發(fā)光法和放射活性法。為了確定是否還沒有鑒別出病毒組分或其合成類似物，如核酸、蛋白質(zhì)性質(zhì)的分子或其片段是否能夠被鑒別為ToTV-病毒-特異性的，通過采用所提供的ToTV病毒序列和采用已知非-ToTV病毒序列(優(yōu)選采用ToTV最接近的種系發(fā)育關(guān)系)使用例如按照本文中提供的種系發(fā)育分析進行序列同源性比對來分析核酸或所述組分的氨基酸序列，例如對于一段所述核酸或氨基酸，(分別)優(yōu)選至少10個，更優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少40個核苷酸或氨基酸是足夠的。根據(jù)與所述ToTV或非ToTV病毒序列的相關(guān)程度，就能鑒別出組分或合成類似物。根據(jù)分析的方式，用于檢測ToTV病毒的試劑盒可以包括一種或多種對蛋白具有特異性的抗體，優(yōu)選對ToTV至少一種衣殼蛋白具有特異性，并且也優(yōu)選包括適用用作陽性對照的基本上純化的ToTV蛋白或抗獨特型抗體?？共《舅巹┍景l(fā)明還提供了獲取適用于治療植物中的ToTV感染的抗病毒藥劑的方法，該方法包含建立含有根據(jù)本發(fā)明的病毒的細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒炛参?，用候選抗病毒藥劑來處理所述培養(yǎng)物或植物，以及確定所述藥劑對所述病毒或其所述培養(yǎng)物或植物的感染的影響。這種抗病毒藥劑的實例包哈ToTV-中和抗體，或其功能組分，如本發(fā)明中提供的，但是也可以是所獲得具有其他性質(zhì)的抗病毒藥劑。存在在植物中使用的不同抗病毒藥劑，例如化學產(chǎn)品、細菌、真菌、昆蟲和病毒。它們中的大多數(shù)與系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)有關(guān)。本發(fā)明設(shè)想了ToTV基因組或其一部分作為植物系統(tǒng)獲得性抗性的誘導物(inductor)的用途。系統(tǒng)獲得性抗性可以涉及ToTV或涉及其他疾病。在這方面，ToTV，其基因組，或其賦予抗性的部件都能夠用作抗病毒藥劑。本發(fā)明也提供了根據(jù)本發(fā)明的抗病毒藥劑用于制備尤其是用于治療植物中ToTV感染的治療組合物的用途，并且提供了包含根據(jù)本發(fā)明的抗病毒藥劑的適用于治療或預(yù)防ToTV病毒感染的方法的藥物組合物，所述方法包含向植物個體提供這種治療組合物。本發(fā)明還涉及適用于測試治療方法和/或組合物的植物模型。幾種煙草屬的種似乎能夠用ToTV病毒感染，從而顯示出與受到ToTV病毒感染的番茄植物中發(fā)現(xiàn)的疾病癥狀不相似的疾病癥狀。將這些煙草屬的試驗植物在用該病毒感染前或感染期間進行抗病毒治療，對于在番茄植物中施用這種抗病毒藥劑具有預(yù)測價值。本發(fā)明還涉及ToTV、或ToTV病毒基因組的部分，作為表達載體的用途，例如用于病毒誘導的基因沉默(VIGS)中。VIGS是一種探索植物中的RNA-介導的抗病毒防御機制的技術(shù)。在用未修飾的病毒感染的植物中，該機制特異性地靶向于病毒基因組。通過使用攜帶來自于宿主基因的插入物的病毒表達載體，該機制也能夠用于靶向于對應(yīng)的植物RNA。VIGS已經(jīng)被廣泛用于植物中，以用于分析基因功能，并已適用于高產(chǎn)出功能性基因組。到現(xiàn)在為止，大多數(shù)VIGS應(yīng)用已經(jīng)用于本塞姆氏煙草(Nicotianabenthamiana)。然而，本發(fā)明涉及了ToTV作為能夠用于分析在其他植物中，例如番茄或其他茄科的種，如胡椒和土豆，以及在葫蘆科的種中的基因功能的新表達向量系統(tǒng)的用途。本發(fā)明將在實施例中進一步解釋，但并非由此限制本發(fā)明。實施例t施徹丨1來自番茄棺物的ToTVWAmmK方法引言收到來自西班牙的番茄植物樣品以用于診斷研究。在番茄植物上的癥狀由葉上的壞死斑和萎黃病以及果實上的褐色圈組成。血清學試驗(ELISA)表明，存在鳳果花葉病毒(PepMV)，但是考慮到這些癥狀，有可能存在另一種還未定義的物質(zhì)。在電子顯微鏡下研究感染的葉組織中發(fā)現(xiàn)了球形病毒顆粒。隨后實施感染試驗，并且發(fā)現(xiàn)易感染ToTV的番茄成倍增加，其中幾個都與明顯的癥狀(葉壞死，從單片小葉的基部開始)有關(guān)(參見圖1)。病毒傳播和增殖按照以下描述從來自西班牙的患病植物中分離出ToTV。ToTV可機械地傳播至幾種煙草屬的種。證明了標準接種緩沖液(例如，0.03M磷酸鹽緩沖液，pH7.7)是合適的。在整個實施例中，將ToTV機械地接種到心葉煙(N.glutinosa)或本塞姆氏煙草(N.benthamiana)上并在心葉煙或本塞姆氏煙草中繁殖。接種后約14天實施病毒純化。病毒純化對于例如線蟲傳多角體病毒組或黃化病毒組已經(jīng)根據(jù)幾種標準方案作出幾種嘗試來純化ToTV(輔以有機溶劑)。但這些方案總是會導致病毒的感染力損失。而且，當在離心步驟中采用低溫(低于5°C)時，ToTV傾向于發(fā)生凝聚。實際上，非常溫和的純化方法會產(chǎn)生合理的清潔病毒制劑，以此制劑才能夠進一步實施實驗。以下實驗步驟用于純化ToTV(所有的離心步驟在6°C下實施)。心葉煙或本塞姆氏煙草的感染葉在5份0.IMTRIS-HCl(pH8)+20mMNa2SO3,5mMNa-EDTA和IOmMNa-DIECA(均質(zhì)化緩沖液)中均質(zhì)化，并將勻漿在49，000Xg下離心30min。上清液置于20%蔗糖墊(sucrosecushion)上并在70，000Xg下離心1.5h。將沉淀物(pellet)再懸浮于2mLTRIS-HCl,pH8中，并將懸浮液置于蔗糖梯度(在均質(zhì)化緩沖液中10%40%的蔗糖)上并在110，OOOXg下離心2h。由于病毒條帶不可見，梯度等分成個別的份，并在每一份中根據(jù)本文中的描述通過所述份的部分在香花芥屬(N.hesperis)‘67A’的葉上接種并觀察所發(fā)生的感染來確定病毒的存在。將含病毒的份置于10%40%硫酸銫梯度(在TRIS-HCl，pH8中)上并在125，000Xg下離心16h。收集病毒條帶并通過對0.IMTRIS-HCl，pH8進行離心或滲析而濃縮。每一純化步驟之后，通過接種到香花芥屬‘67A’上來檢查ToTV的感染力(在接種之前，硫酸銫梯度的份對TRIS-HC1，pH8進行滲析)。電子顯微鏡檢查將病毒懸液“安裝”到涂有Formvar(也被稱為聚乙烯醇縮甲醛)的載網(wǎng)(grid)上，用2%的乙酸雙氧鈾染色并在PhilipsCMl2電子顯微鏡下檢測。PAGE分析病毒蛋白通過12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，Laemmli,1970)分離并用銀染色。核酸分離和評價純化的病毒通過離心(在115，OOOXg下離心2h)濃縮。沉淀物根據(jù)QiagenRNeasyMinEluteCleanup方法(Qiagen，Hilden，德國)進行RNA提取。在UV-分光光度計(BeckmanCoulter,Inc.，F(xiàn)ullerton,USA)上測定RNA濃度。通過瓊脂糖凝膠電泳來檢查RNA完整度。在60V下電泳2h后，利用鄰甲苯胺藍(orthotoluidineblue)對RNA進行染色。cDNA合成和克隆cDNAfflcDNA☆@白勺InvitrogenSuperscriptChoice%統(tǒng)(Invitrogen,Breda，荷蘭)根據(jù)廠商說明書進行合成。第一條鏈cDNA采用寡_d(T)或隨機六聚物引物來啟動。在第二條鏈合成后，EcoRI接頭(adapter)被連接以便于克隆。在EcoRI-延接的cDNA磷酸化后，通過柱色譜除去未連接的接頭。所得的cDNA在pBluescriptIIEcoRI預(yù)消化表達載體(Stratagene，LaJolla,USA)中被連接，并且連接混合物轉(zhuǎn)化為ToplO感受態(tài)細胞(Invitrogen)。ToTV序列的5'末端采用cDNA末端快速擴增(RapidAmplificationofcDNAEnds)(LifeTechnologies)的5'RACE系統(tǒng)利用dCTP根據(jù)制造商說明書進行測定。cDNA的分析轉(zhuǎn)化之后，就利用T3和T7特異性引物通過PCR來分析重組克隆體的插入物的存在。在瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物的尺寸。含有具有約1500個核苷酸的插入物的克隆體用于進一步的序列分析。利用DNASTAR程序包分析所得的序列數(shù)據(jù)。ToTV的三種衣殼蛋白氨基酸序列的確定將純化的ToTV顆粒加載到變性PAGE凝膠上并分離衣殼蛋白。將分離的衣殼蛋白條帶從凝膠上分離，用胰蛋白酶處理，并利用串聯(lián)質(zhì)譜儀(MSMS)采用基本上根據(jù)文獻Kinter&ShermanJOOO描述的方法分析消化液(digest)。產(chǎn)生了小肽的氨基酸(AA)序列，其每一個序列都顯示出與由ToTV的RNA2核苷酸序列預(yù)測的氨基酸序列具有同源性。利用PHYLIP包的程序來完成與其他病毒序列數(shù)據(jù)的比較。MM病毒傳播和增殖對于ToTV的增殖，可以利用心葉煙(N.glutinosa)或本塞姆氏煙草(N.benthamiana)。煙草種香花芥屬(N.hesperis)‘67A，和西方煙(N.occidentalis)‘P1，對于ToTV是易感的，并在34天后顯示出癥狀。這些煙草的種在短時間內(nèi)就會產(chǎn)生非常嚴重的壞死，因此被認為相對于作為增殖宿主而言其更適合于作為指示植物。心葉煙或本塞姆氏煙草與葉子的萎黃病局部病變和系統(tǒng)性萎黃病以及葉的輕度變形有關(guān)。病毒純化從感染的葉組織中純化病毒已經(jīng)證實是相當困難的。ToTV不能耐受有機溶劑，而且在低溫下離心時傾向于發(fā)生凝聚。所使用的純化方案(參見1.2)導致在硫酸銫梯度中產(chǎn)生兩條可見的含病毒條帶。該條帶出現(xiàn)在梯度的底部，表明在Cs2SO4中存在相當高的浮力密度，等于或大于1.4g/cm2。當原料中病毒濃度較高時，ToTV的感染力會受到硫酸銫的影響，但是不會完全喪失。含有兩個病毒條帶的硫酸銫梯度的部分是具有感染力的。沒有對單個條帶的感染力進行測定。電子顯微鏡檢查通過電子顯微鏡檢查兩個條帶，兩個條帶都含有直徑約為28nm的病毒顆粒(圖2)。PAGE分析純化的病毒部分進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，接著通過凝膠的銀_染色而顯示出約23kDa、26kDa和35kDa的3種衣殼蛋白(CP)(參見圖3，指示純化的病毒頂部(TAgV-T)和底部(TAgV-B)部分)。核酸分離和cDNA的分析兩條病毒條帶的RNA分離一起顯示出兩種RNA's約5.5kb和8kb(參見圖4)。上方條帶的RNA分離僅產(chǎn)生5.5kbRNA片段。來自頂部條帶的5.5kbRNA用作cDNA合成和克隆的模板。利用正向和反向序列引物(T3/T7orM13F/M13R)在不同克隆體上實施序列反應(yīng)。實施c_DNA端(RACE)的5'快速擴增以確定準確的RNA的5'-端。利用Lasergene軟件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI,USA)對所獲得的序列的數(shù)據(jù)進行分析，得到病毒的RNA2的完整序列(SEQIDNO=I；參見圖5)。RNA的大小是除了polyA尾之外的5389個核苷酸。在RNA上發(fā)現(xiàn)了兩個開放讀碼框(ORF's)。ORFl定位于核苷酸182至742，長度上有561個核苷酸，并對187個氨基酸的蛋白進行編碼。對于該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸水平上的同源性。0RF2從核苷酸702至4298延伸，其長度為3597個核苷酸，編碼1199個氨基酸的蛋白質(zhì)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索后，發(fā)現(xiàn)與幾種病毒多蛋白同源性低。對于所發(fā)現(xiàn)的同源性，一起提供了NCBI數(shù)據(jù)庫中的登記號與病毒名和蛋白類型。核酸序列和衍生氨基酸序列在所有的三個讀碼框中都用于BLAST分析。利用Lasergene軟件包的MAPDRAW來識別ORF。兩種RNA的ORF映像RNAlRNAl含有一個具有典型解旋酶基因座的ORF(ORFl)、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。另外，用廣藿香輕性花葉病毒(Patchoulimildmosaicvirus)(PatMMV)(NP647592.1)的蛋白酶輔因子(Pro-Co)來觀察低水平的氨基酸(aa)序列同源性，對于氨基酸位置106338，具有22%的同一性。典型的解旋酶基因座A(GKS)、B(D)、C(N)在假定多肽的aa位置398_400、444和495處被識別。對于解旋酶區(qū)域，發(fā)現(xiàn)與東格魯球狀病毒(Ricetungrosphericalvirus)(RTSV；在140aa重疊中42%相同)、玉米褪綠矮縮病毒(Maizechloroticdwarfvirus)(MCDV；在137aa重疊中43%相同)、草莓斑駁病毒(Strawberrymottlevirus)(SMoV；在135aa重疊中42%相同)和歐洲防風草變黃斑點病毒(Parsnipyellowfleckvirus)(PYFV;在138aa重疊中42%相同)具有最接近的同一性。在假定VpG區(qū)域，沒有發(fā)現(xiàn)與其他病毒的序列相似性。在蛋白酶中對于aa10001100發(fā)現(xiàn)了最高的相似性，發(fā)現(xiàn)與馬鈴薯病毒V(PVV；在86aa重疊中NIa蛋白酶)具有25%的同一性。在aa1303-1554之間發(fā)現(xiàn)基因座I(KDE)至VII(FLSR)之間的RdRp區(qū)域(Koonin1991)。發(fā)現(xiàn)以下病毒與多蛋白序列具有最接近的同一性水稻東格魯球狀病毒(ricetungrosphericalvirus，RTSV)在751aa重疊中具有29%同一性、玉米褪綠矮縮病毒(Maizechloroticdwarfvirus)(MCDV)在742aa重疊中具有28%同一性、歐洲防風草變黃斑點病毒(Parsnipyellowfleckvirus)(PYFV)在501aa中具有33%同一性、蘋果潛伏性球形病毒(Applelatentsphericalvirus)(ALSV)在472aa中具有32%同一性、草莓斑駁病毒(Strawberrymottlevirus)(SMoV)在680aa中具有30%同一性以及櫻桃銼葉病毒(Cherryraspleafvirus)(CRLV)在465aa中具有33%同一性。表2.在具有其他植物病毒RdRp基因座的ToTVRNAl上的ORFl中的RdRp基因座之間的總體同一性水平(in%)。NIMV=臍橙傳染性斑駁病毒(NavelorangeInfectiousmottlingvirus)(溫州蜜柑矮縮病毒屬)；PYFV=歐洲防風草變黃斑點病毒(Parsnipyellowfleekvirus)(歐防風黃點病毒屬)；RTSV=水稻東格魯球狀病毒(Ricetungrospericalvirus)(矮化病毒屬)；SDV=Satsumaedwarfvirus(矮縮病毒屬)；SMoV=草莓斑駁病毒(Strawberrymottlevirus)(溫州蜜柑矮縮病毒屬)；ToTV-番茄灼燒病毒(所提出的屬)；ALSV=蘋果潛伏性球形病毒(Applelatentsphericalvirus)(櫻桃銼葉病毒屬)；CRLV=櫻桃銼葉病毒(Cherryraspleafvirus)(櫻桃銼葉病毒屬)；MCDV=玉米褪綠矮縮病毒(Maizechloroticdwarfvirus)(矮化病毒屬)表3.在具有其他植物病毒解旋酶基因座的ToTVRNAl上的ORFl中的解旋酶基因RNA2RNA2含有兩個可能的ORF(圖7)。ORFl編碼分子量20kDa的187aa的預(yù)測蛋白。序列分析顯示與EMBL數(shù)據(jù)庫的任何蛋白沒有同源性。該ORF是否編碼實際蛋白還不得而知。與ORFl部分重疊的第二ORF從在框中三個ATG起始密碼子開始。其編碼具有預(yù)測分子量134kDa的1198aa的假定蛋白。通過分離的外殼蛋白的質(zhì)譜分析所實施的蛋白鑒別清晰地對應(yīng)(map)了RNA2-0RF2的C-端的三種衣殼蛋白的順反子。RNA2-0RF2多蛋白的N-末端區(qū)域最可能編碼假定運動蛋白(MP)，因為在aa位置262267處發(fā)現(xiàn)了高度類似于所提出的運動蛋白共有序列LxxPxL(Mushegian，1994)的基因座LRV￡ML。在RNA20RF2的N-末端沒有發(fā)現(xiàn)其他序列同源性。0RF2假定編碼必須通過蛋白水解分裂而從多蛋白前體分裂出的四種蛋白。然而，沒能鑒別出與已知的多蛋白分裂位置的明顯同源性。這些分裂位點的精確位置仍有待確定。對于CPl多蛋白序列，我們發(fā)現(xiàn)其僅與在103aa處具有21%同一性的人雙?？刹《?Humanparechovirus)(HPeV)具有一定同源性。CP2多蛋白序列據(jù)發(fā)現(xiàn)與以下病毒具有最接近的同一性與RhPV蚜蟲病毒(Rhopalosiphumpadivirus)(RhPV)在168aa中具有25%的同一性，與禽腦脊的髓炎病毒(Avianencephalomyeliltisvirus)(AEV)在74aa中具有33%的同一性，與黑蜂王臺病毒(Blackqueencellvirus)(BQCV)在37aa中具有43%的同一性以及與紅火蟻病毒(Solenopsisinvictavirus)(SINV-I)在51aa中具有30%的同一性。與CP3多蛋白序列沒有發(fā)現(xiàn)同源性。未翻譯區(qū)域(UTR)RNAl和RNA2的3，UTR分別是1210nt和1092nt。在兩種RNA，s的最后988個核苷酸中存在98%的同一性。為了證實兩種RNA’s的UTR的3'-區(qū)域是相同的，在總病毒RNA上采用一種衍生字相同3'-UTR區(qū)域的反向引物和兩種RNA特異性正向引物來實施RT-PCR。對所得的PCR產(chǎn)物進行測序。從這些結(jié)果可以得出以下結(jié)論從番茄植物分離出并暫定命名為番茄灼燒病毒(ToTV)的病毒是直徑約為28nm的球形(二十面體)顆粒。純化之后，該病毒在硫酸銫-梯度中展示出至少兩條帶。當在煙草植物上接種時，合并的兩條帶具有感染力。病毒顆粒顯示出由約23kDa、26kDa和35kDa的至少3種衣殼蛋白構(gòu)成。病毒的硫酸銫-梯度頂部部分含有約5.5kb的RNA分子(RNA2；SEQIDNO:1)而底部部分含約8kb的RNA分子(RNA1；SEQIDNO:2)。利用病毒頂部部分的5.5kbRNA進行cDNA的合成和克隆，并隨后進行序列信息分析，導致幾個毗連群(contig)被編輯(compilation)到SEQIDNO=I中。兩個毗連群(contig)明顯含有poly-A尾，這暗示了病毒RNA具有poly-A尾。核苷酸和所衍生的氨基酸序列的BLAST分析并未顯露出與EMBL數(shù)據(jù)庫的任何已知病毒具有任何顯著的同源性。以上信息表明，ToTV是一種新的且迄今為止還沒有被描述過的病毒。所獲得的信息迄今為止還不能將該病毒分組到具體的病毒科或?qū)僦小榱瞬《緳z測和鑒別的目的，基于SEQIDNO=I的序列設(shè)計了兩組RT-PCR-引物(表4)。表4.用于檢測ToTV的RT-PCR弓丨物合適的TR-PCR方案將包含以下內(nèi)容。利用RNA純化試劑盒，例如QiagenRNA-Easy從約IOOyg感染葉的物質(zhì)分離和純化總RNA。該總RNA中，約Iyg的量用于50yLSuperscript一步法RT-PCR反應(yīng)(Invitrogen)的反應(yīng)混合物中，其中反應(yīng)混合物進一步包含25μ12χ反應(yīng)混合物、1μL(IOOng)上方引物和下方引物，1μLRT/Taq混合物和22μLMilliQ水。為了將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴增該cDNA，可以利用以下RT-PCR程序步驟130mini50°C(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；步驟2:3min@94°C(Taq聚合酶的活化)；步驟3:30s@94°C；步驟4:30s@55°C；步驟5:lmin@72°C；步驟6:重復(fù)步驟(35)40x；步驟7:10min@72°C；步驟8:10°C按需進行。PCR產(chǎn)物可以在TAE或TBE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠上進行分析。2.6.ToTV的三種衣殼蛋白的氨基酸序列的確定可將最大的外殼蛋白的片段(CPl約35kDa)與RNA2的0RF2(AA487-729)中的區(qū)域的部分進行比對。中等外殼蛋白條帶的片段(CP2約26kDa)能夠與RNA2的0RF2的AA730至983的區(qū)域進行比對?？蓪⒆钚〉耐鈿さ鞍椎钠?CP3約23kDa)與RNA2的0RF2的C-端(AA984-1195)進行比對。從這些結(jié)果能夠得出結(jié)論，三種衣殼蛋白的編碼序列位于ToTV的RNA2(5.5kb)的0RF2上，并且由此得出結(jié)論，分離的病毒RNA分子是ToTV病毒顆粒的部分。實施例2.枯萎病原物的分離和表征在2003年，發(fā)現(xiàn)了生長于中美洲(墨西哥和危地馬拉)番茄植物具有與ToTV的癥狀類似的癥狀。病原物疑似是病毒。該疾病在當?shù)匾驯幻麨椤扒煽肆Σ　薄ⅰ翱菸?病毒)病”或“巧克力斑病”。生長在這些地域的易感植物從2003以來已經(jīng)受到嚴重感染。本研究的目的是將導致“巧克力斑病”的迄今未知的病毒與實施例1中分離的ToTV序列進行比較。TffeRNA采用總RNA分離系統(tǒng)(PromegaSV96)從約100μg感染的葉物質(zhì)中分離。約2μg的該總RNA的量用于50μLSuperscript一步法RT-PCR反應(yīng)(Invitrogen)的反應(yīng)混合物中，其反應(yīng)混合物進一步含有25μ12χ反應(yīng)混合物，IyL(IOOng)正向引物和反向引物兩種，1μLRT/Taq混合物和22μLMi11iQ水。為了將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并擴增該cDNA，可以采用以下RT-PCR程序步驟1:30min@50°C(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；步驟2:3mini94°C(Taq聚合酶的活化)；步驟3:30si94°C；步驟4:30si55°C；步驟5:lmini72°C；步驟6重復(fù)步驟(35)40x；步驟7:10min@72°C；步驟8:10°C按需進行?？梢栽赥AE或TBE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠上對PCR產(chǎn)物進行分析。在RT-PCR中利用不同的引物組，這就是已知的用ToTV基因組的RNAl或RNA2在不同位置進行退火。表5.基于用于表征在實施例2中所使用和如圖7中所示的巧克力斑病病原病毒的ToTV的RNA-2序列的RT-PCR引物。MS所使用的引物組促進了ToTV序列的部分按預(yù)期擴增，但是在RT-PCR中使用基于RNA-2序列(P1048/1049、P1056/1057、P1060/1061和P1064/1065)的四個不同引物組，也導致了“巧克力斑病”基因組部分的擴增。這些引物組的退火位點如圖1中所示。對使“巧克力斑病”片段發(fā)生擴增的四個引物組RT-PCR產(chǎn)物進行測序，并顯示出與實施例1中所描述病毒的病毒基因組序列的對應(yīng)部分具有100%的同一性。實施例3.枯萎病病原物的分離與表征按照實施2中描述的實驗，研究來自墨西哥(Sinaloa)相同地點的其他患病植物物質(zhì)。該疾病在本地已知為“枯萎病(Marchitez)”，是指枯萎或枯死。因為在葉上的癥狀具有相似之處，假定枯萎病也是由ToTV引起的，并且描述于實施例2中的初始實驗也證實了這個想法。然而，試驗其他的物質(zhì)，采用ToTV特異性引物的PCR卻并未檢測到ToTV。在其他的試驗物質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)球形病毒與ToTV具有共同的特征。在該實施例中，我們描述并表征了這種新病毒，其與ToTV相關(guān)但又區(qū)別于ToTV。這種新病毒暫時命名為番茄枯萎病毒(ToMarV)。材料和方法病毒傳播和增殖ToMarV在2005年從墨西哥Sinaloa的Culiaccin的顯示嚴重壞死的番茄植物中分離出來。將分離物標識為rai-TMarV0601。利用0.03M的磷酸鈉/磷酸鉀緩沖液，PH7.7，將病毒機械地接種并保持于煙草屬心葉煙(181肚^10仰)‘PRI’、佛羅里達酸漿(Physalisfloridana)或本塞姆氏煙草(N.benthamiana)中。病毒純化所有的離心步驟在6°C下實施。在接種后約14天收獲本塞姆氏煙草(N.benthamiana)的感染葉并在5體積(W/V)提取緩沖液(0.IMTRIS-HCl(pH8)+20mMNa2SO3,5mMNa-EDTA中的IOmMNa-DIECA)中均質(zhì)化并通過粗棉布壓榨。加入3體積的氯仿/丁醇的11混合物并在混合后，將懸浮液在16，500g下離心lOmin。向水相加入TritonX-100并攪拌30min。加入5%PEG6000和2.3%NaCl并將懸浮液攪拌lh。懸浮液靜置沉降Ih并在21，500g下離心15min。將沉淀物再懸浮于總共SOmL的提取緩沖液中，在15，OOOg下離心lOmin，并將上清液置于30%蔗糖墊上。在70，500g下離心3h后，將沉淀物再懸浮于總共2mL的Tris緩沖液pH8.0中，并在14，OOOg下離心2min。將病毒懸浮液加載到10%40%硫酸銫梯度上并在126，OOOg下離心16h。收集病毒條帶并對0.IMTris-HCl，pH8.0滲析。電子顯微鏡檢查將病毒懸浮液裝到涂有聚乙烯醇縮甲醛-碳(formvar-carbon)的載網(wǎng)上，用2%乙酸雙氧鈾染色并在PhilipsCMl2電子顯微鏡下檢查。聚丙烯酰胺凝膠電泳通過使純化的病毒顆粒經(jīng)歷12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[LaemmliUK(1970)Nature277:680-685]來分離病毒蛋白，并用銀染色使其可見。核酸分離和評價純化的病毒通過離心(在115，000Xg下離心2h)進行濃縮。利用QiagenRNeasy試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商說明書從提取沉淀的病毒顆粒RNA。在BeckmarmUV-分光光度計上測定RNA濃度。在1%瓊脂糖凝膠上利用甲醛/甲酰胺/HEPES緩沖液體系檢查RNA的完整度和尺寸。在電泳后，利用鄰甲苯胺藍對RNA進行染色。利用Rneasy植物迷你試劑盒(Qiagen)從ToMarV感染的西方煙(Nicotianaoccidentalis)‘P1，植物中分離RT-PCR的總RNA。RT-PCR禾口5，RACE通過一管RT-PCR(AccessRT-PCR系統(tǒng)，Promega)獲得PCR片段。利用通用的寡dT引物[VanderVlugtetal.(1999).Phytopathology89148-155]和各種衍生于ToTVRNAl和RNA2序列的各種引物(在GenBank中的登記號分別為DQ388879和DQ388880)來啟始RT-PCR?；救缦惹拔墨I[OngusJR,etal.(2004)·JGenVirol853747-3755,VallesSM,etal.(2004)Virology328:151_157]中所述，通過重復(fù)使用5'RACE試劑盒(Roche)結(jié)合擴展的高精確度PCR系統(tǒng)(ExpandhighfielityPCRsystem)(Roche)向病毒基因組的5'端行進來確定ToMarVRNA的5'區(qū)域。5，-RACE策略的cDNA引物和其他RT-PCR反應(yīng)的引物組都是基于新近獲得的ToMarV序列數(shù)據(jù)。核苷酸測序和序列分析利用QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen)對所有的PCR產(chǎn)物(5’RACE)進行純化并直接測序。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)3100遺傳分析儀(AppliedBiosystems3100GeneticAnalyser)來實施序列分析，米用DYEnamicETTerminatorCycleSequencing試劑盒(Amersham)和用于擴增的引物。對于較長的PCR片段，利用ToMarV特異性引物作為引物行進測序。利用DNASTAR軟件包(Lasergene)對核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)進行分析和組裝。利用PHYLIP程序包的程序來實施與其他病毒的序列比對。在1000次重復(fù)分析中實施自展(bootstrapping)之后采用CLUSTALX程序來實施多重比對和種系發(fā)育分析。通過NJplot程序來觀察鄰接共識種系發(fā)育(Neighbour-joiningconcensusphylogenies)[ThompsonJD,etal.(1997)NucleicAcidsRes25:4876_4882]，并利用TreeView來打印[PageRDM(1996)ComputerApplicationsintheBiosciencesl2:357_358]。結(jié)果與討論病毒表征ToMarV易于通過機械接種而傳播到許多指示植物。在表1中概覽了所使用的指示植物和其與ToMarV和ToTV的反應(yīng)。在指示植物中，除了在佛羅里達酸漿(P.floridana)和奎奴亞藜(Chenopodiumquinoa)中的反應(yīng)之外，ToMarV和ToTV的大多數(shù)癥狀是彼此相同的。ToTV會在佛羅里達紫衫中產(chǎn)生嚴重壞死并導致死亡，而ToMarV僅會在局部感染的葉中引起偶見的壞死和系統(tǒng)性色斑。當用ToTV接種奎奴亞藜時沒有反應(yīng)，而ToMarV在接種的葉中會引起壞死針尖大的病變。在顯示出枯萎癥狀的番茄和西方煙‘P1’的系統(tǒng)性感染葉中的電子顯微鏡研究，揭示出存在直徑為2830nm的球形病毒顆粒。ToMarV顆粒在形狀和尺寸上明顯類似于ToTV顆粒。在純化ToMarV的最初努力中，采用了設(shè)計用于ToTV的純化方案(參見實施例1)。該方案并未在最后的硫酸銫(CsS04)梯度中產(chǎn)生可見的病毒條帶。梯度組分的電子顯微鏡分析表明，病毒顆粒存在于梯度的底部。然而，梯度的該部分也含有遮蔽了病毒條帶的植物組分。因此設(shè)計了另一種純化方案，其中通過利用氯仿_丁醇混合物來輔助從植物組分分離病毒。該方案在CsS04梯度中產(chǎn)生了一個擴散帶。這個結(jié)果與ToTV純化所獲得結(jié)果相反，ToTV純化在CsS04梯度中總是產(chǎn)生兩個不同的條帶。從梯度收集ToMarV條帶并通過電子顯微鏡檢查。在所收集的條帶中存在預(yù)期尺寸為28nm的病毒體，并且在機械傳播到試驗植物時具有傳染性。純化的病毒體也被機械傳播至番茄植物，其在接種后兩星期顯示出枯萎病的特征癥狀。通過電子顯微鏡和RT-PCR證實在這些植物中存在ToMarV。使純化的病毒體經(jīng)歷SDS-PAGE，檢測到估計尺寸為35kDa、26kDa和24kDa的三種病毒蛋白，分別命名為Vp35、Vp26和Vp24(圖11A)。ToMarV的病毒外殼蛋白的數(shù)目和估計的分子大小與先前發(fā)現(xiàn)的ToTV相同(參見實施例1)。番茄枯萎病毒純化的病毒制劑顯示出在變性的RNA-凝膠上具有兩種RNA分子估計尺寸為7.5kb的RNA1和估計尺寸為4kb的RNA2(圖11B)。所發(fā)現(xiàn)的RNA數(shù)目與ToTV—致，但是其估計尺寸更小(ToTV的RNA1和RNA2分別為8.5kb和5.5kb)。病毒RNA分析基于生物學和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，對于ToMarV而言如指示植物癥狀、粒子大小和形態(tài)學、外殼蛋白的數(shù)目和尺寸、以及所獲得的RNA數(shù)目，猜想可能與ToTV的有關(guān)。因此，基于ToTVRNA1和RNA2序列(DQ388879和DQ388880)的不同上游引物以及一般的寡_dT引物，均被用于實施RT-PCR反應(yīng)。這產(chǎn)生了指示在兩種病毒之間的RNA序列中可能存在差異的有限數(shù)量的PCR片段。這些片段的序列分析顯示，與ToTVRNA1和RNA2同源性水平較低?；谒@得的序列信息，產(chǎn)生了新的cDNA引物并用于獲得5’-RACE序列行進策略中的其他序列信肩、oToMarV特異性引物用于RT-PCR，以確認在兩種取向上兩種RNA的序列。RNA1RNA1(圖8)由7221個核苷酸(nts)構(gòu)成，沒有poly(A)尾，并含有一個編碼分子質(zhì)量為237kDa的2151個氨基酸(aa)的預(yù)測多蛋白的6453nts的開放讀碼框(RNA1-0RF1)(圖12)。在nt位置141143處發(fā)現(xiàn)了第一框內(nèi)AUG。0RF在位置6594-6596處具有UGA終止密碼子。假定多蛋白序列含有幾個具有蛋白酶輔助因子、解旋酶、蛋白酶和RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)典型基因座的保守區(qū)。典型的解旋酶基因座A(GKS)、B(D)、C(N)在假定蛋白的aa位置397_399、443和494處被識別。RdRp區(qū)能夠通過存在典型的基序I(KDE)VII(FLSR)而在aa1305和1553之間被識別[KooninEV(1991).JGenVirol72:2197]。0RF1編碼區(qū)在核苷酸水平(6474nts)和氨基酸水平(2158aa)上顯示出與ToTV-RNAl(DQ388879)具有65%的總體同一性。在RNA1-0RF1的C-末端部分中的基因座A和C之間的解旋酶區(qū)域[GorbalenyaAE，etal.(1990).FEBSLett262:145-148]，顯示出與ToTV對應(yīng)區(qū)域具有95.6%的aa同一性，以及與其他病毒具有顯著更低的同一性，例如玉米褪綠矮縮病毒(Maizechloroticdwarfvirus)(MCDV，水稻矮化病毒屬，AAV86083)的同一性為46.9%，急性蜜蜂麻痹病毒(acutebeeparalysisvirus)(ABPV，在二順反子病毒科中未分種，NP066241)的同一性為25.4%。在RNA1的0RF1中的RdRp基因座與ToTV的aa同一性水平相對較高(78.2%)，而與其他病毒的aa同一性水平則顯著更低，例如與禽腦脊髓炎病毒(avianencephalomyelitisVirus)(AEV，肝病毒屬，NP653151)的同一性為15.3%，與草莓潛伏環(huán)斑病毒(strawberrylatentringspotvirus)(SLRSV，矮縮病毒屬，NC_006764)的同一性為25.9%。這些同一性水平顯示，ToMarV和ToTV之間的關(guān)系更近。采用我們可以獲取的數(shù)據(jù)進行BLAST搜索，也表明與僅在我們工作期間才可以利用的番茄頂點壞死病毒(ToANV，Genbank登錄號為EF063641)的NCBI數(shù)據(jù)庫中的部分序列具有非常高的總體序列同源性水平(95%)。在RNA1編碼區(qū)域，ToMarV和ToANV之間的總體同一性水平為，在nt水平為96%而蛋白質(zhì)水平則為99%，對于RdRp和解旋酶基因座分別具有99.3%和100%aa同一性水平。這些百分數(shù)間接表明ToMarV與名為頂點壞死病毒(ToANV)提交的部分病毒序列之間關(guān)系的接近水平。RNA2RNA2(圖9)由4906nt組成，并與ToTV具有相似性，其含有兩個編碼兩種預(yù)測多蛋白的開放讀碼框(RNA2-0RF1和RNA2-0RF2)(圖12)。ToMarV和ToTV的RNA2-0RF1之間的序列總體同一性水平為62.1%。在公開的ToANV_RNA2部分序列(基因數(shù)據(jù)庫登記號EF063642)中發(fā)現(xiàn)了最高的序列同一性(80%)。在編碼區(qū)域中，nt水平的同一性為78%而蛋白質(zhì)水平的同一性為90%。在與ToTV的類似性中，RNA2-0RF1多蛋白的N_末端區(qū)域最可能編碼假定MP，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因座LRVETL高度類似于推薦的運動蛋白共有序列LxxPxL[MushegianAR(1994).ArchVirol135:437-441]。并未獲得ToANV的假定運動蛋白區(qū)域的序列。RNA2-0RF1上的番茄枯萎病毒的三種假定外殼蛋白的相對次序來自與ToTVCP的直接序列比對。與早先鑒別為ToTVCP的假定CP分解位點的區(qū)域沒有識別出明顯的同源性[VerbeekM,etal(2007).ArchVirol152:881_890]。對于ToTV，外殼蛋白經(jīng)過測序從而將外殼蛋白基因定位于RNA2序列上。對ToMarV、ToTV和ToANV的各自外殼蛋白的氨基酸序列進行比對。ToMarV-Vp35顯示出與ToANV和ToTV具有89%和72%的同一性。ToMarV-Vp26顯示出與ToANV和ToTV具有98%和86%的同一性。ToMarV-Vp24顯示出與ToANV和ToTV具有94%和71%的同一性。5，_禾口3，-未翻譯區(qū)域(UTR)RNA1的5，-UTR大小是140nt。RNA2的還未能可靠地確定。RNA1和RNA2的3，-UTR的長度分別為628nt和655nt，并共有91%的總體同一性水平。兩種RNA在最靠近3'-末端的553個核苷酸幾乎是高度保守的(同一性為99%)。在兩個3’-UTR的3'部分中的近同一性區(qū)域(nearidenticalregion)是番茄枯萎病毒與ToTV的共有特征。然而，對ToMarV和ToTV的RNA1和RNA2的3’-UTR進行直接序列比對顯示出兩種病毒之間僅分別具有49.0%和48.9%的序列同一性。ToANV的3，_UTR與RNA1和RNA2各630nts和650nts的長度比對表明了其與RNA1和RNA2具有88.5%和85.6%序列同一性。這顯著地低于在RNA1上編碼的0RF中發(fā)現(xiàn)的解旋酶和CG-GDD區(qū)域中觀察到的同一性水平。ToMarV的分類學位置番茄枯萎病毒與ToTV共有病毒體特征和其基因組組織，但基于nt和aa序列同一性水平，兩種病毒相關(guān)卻又有區(qū)別。在ToMarVRNAl和RNA2和保藏于NCBI數(shù)據(jù)庫中的名為番茄頂點壞死病毒(ToANV)的序列之間觀察到非常高水平的同一性。無法獲取關(guān)于帶有這些部分序列的病毒的其他數(shù)據(jù)。然而，在RNA1和RNA2的3’_NTR(分別為88.5%和85.6%)中相對低水平的核苷酸序列同一性(低于90%)，以及在兩種病毒之間的最大假定CP(Vp36)中低于90%的aa同一性(89%)，間接表明兩種病毒并不相同，而可以是相同病毒的菌株或分離物。需要帶有ToANV序列的該病毒的其他生物學和分子數(shù)據(jù)才能確定其與ToMarV的準確關(guān)系。通過實施基于RNA1-0RF中的CG蛋白酶基因座[BazanJF,FletterickRJ(1988).ProcNatlAcadSciUSA85:7872-7876]和GDDRdRp活性位點[ArgosP(1988)NucleicAcidsRes16=9909-9916]之間的aa區(qū)域的種系發(fā)育分析來確定番茄枯萎病毒、ToTV和來自溫州蜜柑矮縮病毒屬、櫻桃銼葉病毒屬和隨伴病毒科、豇豆鑲嵌病毒科、二順反子病毒科和微小核糖核酸病毒科的其他病毒之間的關(guān)系。該區(qū)域被認為為對仿小核糖核酸病毒進行分類的良好分類學預(yù)測因子(taxonomicpredictor)[IkegamiMetal.(2002)豇豆花葉病毒禾斗中的公認禾口推定禾中的分類(TaxonomyofrecognizedandputativespeciesinthefamilyComoviridae).XllthIUMSVirologymeetingParis，法國，2002年7月27日至2002年8月12日]。所得的樹狀圖(圖13A)顯示具有ToTV和ToANV的ToMarV病毒簇，并證實了來自櫻桃銼葉病毒屬的這些病毒的單獨分類學位置。基于基因座A和CtGorbalenyaAE，etal.(1990).FEBSLett262:145-148](aa397_494)之間的解旋酶區(qū)域的類似種系發(fā)育分析確認了ToMarV、ToTV和ToANV的分類學位置(圖13B)。對于該基因座，這些病毒看起來是更加接近于矮化病毒屬(Waikavirus)和隨伴病毒屬(Sequivirus)。我們在該實施例中提出的數(shù)據(jù)描述了作為新型仿小核糖核酸植物病毒的番茄枯萎病毒(ToMarV)，其與番茄灼燒病毒(ToTV)相關(guān)但又有所不同[VerbeekM，etal.(2007)ArchVirol152:881-890]。ToMarV和ToTV很明顯地區(qū)別于其他仿小核糖核酸病毒，并且有可能屬于還未命名的相同的新屬。參考文獻Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller,W.，Myers,E.W.，Lipman,D.J.(1990).Basiclocalalignmentsearchtool.J.Mol.Biol.,215:403-410.Altschul，S.F.，Madden，T.L，Schaffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.，Lipman，D.J.(1997).GappedBLASTandPSI-BLAST:Anewgenerationofproteindatabasesearchprograms.Nucl.AcidsRes.，25，3389—3402.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent,R.，Kingston，R.E.，Moore,D.D.，Seidman，J.G，Smith，J.A.，Struhl，K.eds.(1998)Currentprotocolsinmolecularbiology.V.B.Chanda,seriesed.NewYork:JohnWiley&Sons.Barany,F.(1991)GeneticdiseasedetectionandDNAamplificationusingclonedthermostableligase.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189—193.Boom,R.，Sol，C.J.A.，Salimans，M.M.M.，Jansen,C.L，Wertheim-vanDillen，P.M.E.，Noordaa，vanderJ.(1990)Rapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids.J.Clin.Microbiol.28:495_503.Chomczynski,P.，Sacchi，N.(1987)Single-stepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-phenol-chloroformextraction.Anal.Bio.162156-159.Clark，M.F.，AdamsA.N.(1977)Characteristicsofthemicroplatemethodofenzyme-linkedimmunosorbentassayforthedetectionplantviruses.J.Gen.Virol.34:475-483.Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，E.M.Strober，W.(Eds.)(1997)CurrentProtocolsinImmunology.JohnWiley&SonsInc.Baltimore.Compton,J.(1991)Nucleicacidsequence-basedamplification.Nature1991，350:91-92.Devereux,J.，Haaberli，P.，Smithies，0.(1984)AcomprehensivesetofsequenceanalysisprogramsfortheVAX.NucleicAcidsRes.12:387-395.Dijkstra，J.，deJager，C.(Eds.)(1998)PracticalPlantVirology-ProtocolsandExercises,SpringerDuffus，J.E.，Liu,H.Y.，Wisler,G.C.(1996)Tomatoinfectiouschlorosisvirus—anewclostero-likevirustransmittedbyTrialeurodesvaporariorum.EuropeanJournalofPlantPathology,102(3),219-226.Felsenstein,J.1989.PHYLIP-PhylogenyInferencePackage(Version3.2).Cladistics5164-166.Guatelli,J.C.，Whitfield,K.M.，Kwoh,D.Y.，Barringer,K.J.，Richman,D.D.，Gingeras，T.R.(1990)Isothermal，invitroamplificationofnucleicacidsbyamutienzymereactionmodeledafterretroviralreplication.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878.Hagiwara，K.，Ichiki，T.U.，Ogawa，Y.，Omura，T.，Tsuda，S.(2002).Asingleaminoacidsubstitutionin126—kDaproteinofPeppermildmottlevirusassociateswithsymptomattenuationinpepper；thecompletenucleotidesequenceofanattenuatedstrain,C-1421.ArchVirol147:833—340.Harlow,E.andLane，D.(1988)Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY.Hirata,H.，Lu,X.，Yamaji,Y.，Kagiwada,S.，Ugaki,M.Namba,S.(2003)AsinglesilentsubstitutioninthegenomeofApplestemgroovingviruscausessymptomattenuation.JGenVirol84:2579_2583.JacobsM.V.，SnijdersP.J.，vanderBruleA.J.(1997)Ageneralprimer(GP5+/GP6+)-mediatedPCR-enzymeimmunoassaymethodforrapiddetectionof14high_riskand8low-riskhumanpapillomavirusgenotypesincervicalscrapings.JClinMicrobiol35:791-795.Katz，E.，Eksteen，R.，Schoenmakers，P.，Miller，N.(eds.)(1998)HandbookofHPLC.MarcelDekker，NewYork.Kinter，M.，Sherman，N.E.(2000)ProteinSequencingandIdentificationUsingTandemMassSpectrometry.WileyInterscience.Koonin，E.V.(1991)ThephylogenyofRNA-dependentRNApolymerasesofpositive-strandRNAviruses.JGenVirol72:2197-2206.Kwoh,D.Y.，Davis,G.R.，Whitefield,K.M.，Chappelle,H.L.，DiMichele，L.J.，Gingeras，T.R.(1989)Transcription-BasedAmplificationSystemandDetectionofAmplifiedHumanlmmunodeficiencyVirusType1withaBead-BasedSandwichHybridizationFormat.Proc.NatlAcad.Sci.USA,86,1173-1177.Laemmli，U.K.(1970)CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227，680-685.Lerner，R.A.，Kang，A.S.，Bain,J.D.，Burton，D.R.，Barbas，C.F.(1992)Antibodieswithoutimmunization.Science258:1313—1314.Lizardi，P.M.，Guerra，C.E.,Lomeli，H.，Tussie-Luna，I.，Kramer，F(xiàn).R.(1988)ExponentialamplificationofrecombinantRNAhybridizationprobes.Biotechnology6，1197-1202.Lowman,H.B.，Bass,S.H.，Simpson,N.，Wells,J.A.(1991)Selectinghigh-affinitybindingproteinsbymonovalentphagedisplay.Biochem.30(45)10832-8.Lu,X.，Hirata，H.，Yamaji，Y.，Ugaki，M.，Namaba，S.(2001).RandommutagenesisinaplantviralgenomeusingaDNArepair-deficientmutatorEscherichiacolistrain.JVirolMethods94:37-43.Marks,J.D.，Hoogenboom,H.R.，Griffiths,A.D.，Winter,G.(1992a)Molecularevolutionofproteinsonfilamentousphage.JournalofBiologicalChemistry,267，16007-16010.Marks,J.D.，Griffiths,A.D.，Malmqvist，Μ.，Clackson,Τ.P.，Bye,J.Μ.Winter,G.(1992b).Bypassingimmunization:buildinghighaffinityhumanantibodiesbychainshuffling.Biotechnology10:779:783.MeinkothJ.，WahlG.(1984)Hybridizationofnucleicacidsimmobilizedonsolidsupports.AnalBiochem，138(2):267_284.Mullis，K.B.，F(xiàn)aloona，F(xiàn).A.(1987)SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerasecatalyzedchainreaction.Meth.Enzymol.155:335-350.Pierik，R.LM.(1999)InvitroCultureofHigherPlants，4thedition，360pages，ISBN:0-7923-5267_X.Rose,N.，DeMacrio,Ε.，F(xiàn)ahey,J.，F(xiàn)riedman,H.，Penn,G.(1997)ManualofClinicalLaboratoryImmunology.AmericanSoc.MicrobiologyPress,Washington,D.CSambrook，J.，RussellD.W.，Sambrook，J.(2001)MolecularCloning:aLaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,N.Y.Sanger,F.，Nicklen,S.，Coulson,A.R.(1977)DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74；5463-5467.SchaggerH.，vonJagow，G..(1987)Tricine-sodiumdodecy1sulfate-polyacrylamidege1e1ectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1toIOOkDa.AnalyticalBiochemistry166.368-379.Smith，LM.，Sanders，J.Z.，Kaiser，R.J.，Hughs，P.，Dodd，C.，Connel1,C.R.，Heins，C.，Kent，S.B.H.，Hood,L.Ε.(1986)FluorescentdetectioninautomatedDNAsequenceanalysis.Nature321:673_68LSwofford,D.L.(2000)·PAUP*:phylogeneticanalysisusingparsimony(^andothermethods).4thedition.SinauerAssociates,Sunderland,Mass.Takeshita，M.，Suzuki，M.,Takanami，Y.(2001).Combinationofaminoacidsinthe3aproteinandthecoatproteinofCucumbermosaicvirusdeterminessymptomexpressionandviralspreadinbottlegourd.ArchVirol146:697—711.Thompson,J.D.，Gibson，T.J.，Plewniak，F(xiàn).，Jeanmougin，F(xiàn).，Higgins，D.G.(1997)TheClustalXwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools.NucleicAcidsResearch，244876-4882.Thompson,J.R.,Perry,K.L.，DeJong,W.(2004a)Anewpotatovirusinanewlineageofpicorna-likeviruses.ArchVirol.149:2141-2154.Thompson,J.R.，Perry,K.L.，DeJong，W.(2004b)Thecharacterizationofanewpicoma-likevirusinfectingtomato.Abstractbookofthe23rdAnnualMeetingoftheAmericanSocietyforVirology,Montreal,Canada,July2004.Tijssen，P.1993.LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",Elsevier.NewYork.VandenBrule,A.J.C.,Pol,R.,Fransen-Daalmeijer,N.,Schouls,L.Μ.,Meijer,C.J.L.Μ.,Snijders,P.J.F.(2002)GP5+/6+PCRfollowedbyReverseLineBlotAnalysisEnablesRapidandHigh-ThroughputIdentificationofHumanPapillomavirusGenotypes.J.Clin.Microbiol.40:779_787.Vela,C.,Cambra,Μ.,Cortes,Ε.,Moreno,P.,Miguet,J.G.,PerezdeSanRoman,C.,Sanz,A.(1986)Productionandcharacterizationofmonoclonalantibodiesspecificforcitrustristezavirusandtheirusefordiagnosis.J.Gen.Virol.6791-96.Walker,G.Τ.,Fraiser,M.S.,Schram,J.L.,Little,M.C.,Nadeau,J.G.,Malinowski,D.P.(1992)Stranddisplacementamplification—anisothermal,invitroDNAamplificationtechniqueNucleicAcidsRes20:1691_1696.Walker.J.M.2004.PCRProtocolsonCD.HumanaPress.ffisler,G.C.，Li,R.H.，Liu,H.Y.，Lowry,D.S.，Duffus,J.Ε.(1998)Tomatochlorosisvirus:anewwhitefly-transmitted,phloem-limited,bipartiteclosterovirusoftomato.Phytopathology,88(5),402-409.YoungR.A.,Davis,R.W.(1983)Efficientisolationofgenesusingantibodyprobes.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:1194_1198。PCT打印(原件為電子形式)受理局專用國際局專用權(quán)利要求一種命名為番茄枯萎病毒(ToMarV)的植物病毒，于2007年7月10日保藏在德國不倫瑞克的德國微生物及細胞保藏中心，保藏人編號為PRI-TMarV0601，所述保藏材料的受理登記號為DSM19656。2.一種病毒，包含選自由SEQIDNO:15和SEQIDNO16以及與它們具有至少80%的核苷酸序列同源性的序列組成的組中的至少一種核酸序列。3.一種分離的或重組的核酸或其ToTV-特異性片段，以及它們的互補鏈及它們的片段，所述分離的或重組的核酸或其ToTV-特異性片段包含選自由SEQIDN0:15和SEQIDN0:16、與SEQIDN0:15和SEQIDNO:16具有至少80%的核苷酸序列同源性的序列組成的組中的核酸序列。4.一種表達載體，包含根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸。5.一種多核苷酸，能夠在嚴格條件下雜交至根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸。6.一種可由根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒獲得的分離的或重組的多肽，或它們的片段。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中，所述多肽選自由23kDa、26kDa和35kDa的衣殼蛋白、解旋酶、RNA-依賴性的RNA聚合酶和ToMarV的假定運動蛋白(MP)以及它們的片段組成的組。8.—種抗原，包含根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的多肽。9.一種特異性地針對根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗原或根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒的抗體。10.一種用于生產(chǎn)抗根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒的抗體的方法，包含以下步驟a)提供根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的ToMarV病毒，或它們的蛋白或肽片段；b)用所述病毒、蛋白或肽片段免疫合適的脊椎動物宿主；和c)從所述脊椎動物宿主的血液或脾細胞收獲抗所述病毒、蛋白或肽片段的抗體。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，進一步包含以下步驟選擇一種產(chǎn)生抗體的脾細胞，將所述脾細胞融合到永生化雜交瘤細胞系并使所述雜交瘤融合以產(chǎn)生單克隆抗體。12.一種用于鑒別病毒分離物為根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒的方法，包含使所述病毒分離物或其組分與根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體發(fā)生反應(yīng)。13.一種用于檢測樣品中是否存在根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒的方法，包含通過使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體發(fā)生反應(yīng)來確定所述樣品中是否存在根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒或其組分。14.一種用于鑒別抗根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒的植物的方法，包含以下步驟a)將植物或植物部件暴露于感染劑量的根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒，和b)當所述暴露之時，暴露之后，只要出現(xiàn)以下情況之一就將所述植物鑒別為抗性植物-在所述植物或植物部件中保持不存在疾病癥狀或延遲表達或至少是疾病癥狀的嚴重程度降低或相對于易感對照植物而言疾病癥狀是局部的，和/或-在所述植物或植物部件中不存在根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的病毒或其基因組序列，或相對于易感對照植物而言根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒的存在至少在數(shù)量上有所降低。15.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，在步驟b)中，通過實施根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法來確定所述植物或植物部件中是否存在根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒。16.一種生產(chǎn)能夠抗根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒的植物的方法，包含以下步驟a)通過實施根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法來鑒別作為供體植物的抗根據(jù)權(quán)利要求1或2所述病毒的植物，b)將所述抗性供體植物與受體植物雜交，和c)通過實施根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法從后代植物中選出抗性植物。17.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述供體植物是茄科或葫蘆科的植物。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述供體植物是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、甜瓜植物、西瓜植物或黃瓜植物。19.根據(jù)權(quán)利要求1618中任一項所述的方法，其中，所述受體植物是茄科或葫蘆科的植物。20.根據(jù)權(quán)利要求1618中任一項所述的方法，其中，所述受體植物是番茄植物、茄子植物、胡椒植物、甜瓜植物、西瓜植物或黃瓜植物。21.根據(jù)權(quán)利要求1618中任一項所述的方法，其中，所述受體植物是番茄種的番茄植物，更優(yōu)選地是具有商業(yè)所需特性的番茄種系。22.根據(jù)權(quán)利要求12中任一項所述的病毒、或其基因組、或其賦予抗性的部分作為抗病毒藥劑的用途。23.根據(jù)權(quán)利要求12中任一項所述的病毒、或其基因組、或它們的部分作為表達載體的用途。24.根據(jù)權(quán)利要求12中任一項所述的病毒、或其基因組、或它們的部分的減毒形式用于植物傳染免疫的用途。全文摘要本發(fā)明涉及病毒學領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種名為番茄枯萎病毒(ToMarV)的分離植物病毒，及其組分。本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)抗ToMarV的植物的方法，該方法包括以下步驟識別抗ToMarV供體植物，用抗ToMarV供體植物與受體植物雜交，和從后代植物中選出抗性植物。文檔編號G01N33/569GK101842383SQ200880102131公開日2010年9月22日申請日期2008年2月8日優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日發(fā)明者保盧斯·科內(nèi)利斯·馬里斯,勒內(nèi)·安德里斯·安東尼厄斯·范德弗盧特,安尼特·瑪麗亞·杜倫曼斯,約翰內(nèi)斯·弗朗西斯庫斯·約翰娜·瑪麗亞·范登霍伊維爾,馬里納斯·費爾貝克申請人:孟山都投資股份有限公司