番茄斑萎病毒分子標準樣品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種番茄斑萎病毒分子標準樣品及其制備方法，具體包括TSWV的原料選取、標準樣品的制備、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、定值等過程。所述標準樣品的制備方法包括：由TSWV病毒液中提取病毒RNA、RT?PCR反應擴增并純化目的基因片段、目的片段的連接轉(zhuǎn)化；回收質(zhì)粒的步驟。本發(fā)明的番茄斑萎病毒標準樣品穩(wěn)定性高、均勻性好，適用于對番茄斑萎病毒進行快速檢測確證，為番茄斑萎病毒的檢測研究、農(nóng)藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，可廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境中的疫情監(jiān)控及進出口貿(mào)易中該類病毒的監(jiān)測及檢測。使用本發(fā)明的標準樣品可以實現(xiàn)不同實驗室結(jié)果的比對，從而保證實驗室的質(zhì)量控制。
【專利說明】
番茄斑萎病毒分子標準樣品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于檢測用病毒標準品及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及番茄斑萎病毒標 準樣品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，番前斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)以其廣泛的寄主范圍 和造成的巨大經(jīng)濟損失已被列為世界危害最大的十種植物病毒之一。在20世紀60~80年 代，該病毒曾在歐美及非洲的煙草和番茄上大流行，每年的發(fā)病率為20%~50%，造成高達 數(shù)10億美元的損失。在美國夏威夷、巴西、意大利和南非，TSWV在20世紀80~90年代的流行 曾導致番茄、萵苣等作物近乎絕產(chǎn)。近年來，番茄斑萎病毒屬病毒特別是TSWV，已成為全世 界引起多種經(jīng)濟作物和觀賞植物極大經(jīng)濟損失的重要因子。
[0003] 我國目前種植的辣椒、洋蔥、生菜等蔬菜種子很多來自于世界各地，尤其是番茄種 子基本依賴進口，進口國別包括美國、日本、荷蘭、泰國等國，這些進口國目前都有番茄斑萎 病毒的發(fā)生與報道，我國口岸曾于2012年在進境的種子中截獲TSWV病毒。而傳統(tǒng)的TSWV檢 測及確證方法一般通過生物寄主、形態(tài)學試驗判定植株是否具有植物病毒，這些方法費時， 操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要。
[0004] 系統(tǒng)內(nèi)送檢種苗的樣品通常眼觀來看都比較健康，而番茄斑萎病毒通常只有在適 宜的條件下才能發(fā)病，而且現(xiàn)在用的PCR方法只能從重度感染表現(xiàn)出癥狀的植物中檢出病 毒，無法檢測潛在的病毒。隨著進出口貿(mào)易的增大，檢驗流程時限要求縮減，植物病毒疫病 多數(shù)要進行分子生物學檢測，現(xiàn)行的國家和行業(yè)標準，都需要標準陽性毒株或陽性對照質(zhì) 控物進行實驗質(zhì)控，這些陽性毒株的引進需要辦理復雜的審批手續(xù)，購置費用昂貴，難度較 大，因此普通的植物疫病實驗室很難得到該病毒，對實驗室的質(zhì)量控制及研究帶來了極大 的挑戰(zhàn)。
[0005] 為了幫助實驗室建立規(guī)范的質(zhì)量保證，植物病毒及類病毒的標準樣品研制工作一 直在開展中。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于該種植物病毒標準樣品的研究。我們將首次開發(fā)可用 于快速檢測番茄斑萎病毒的分子標準樣品及制備技術(shù)。本標準樣品的研制成功，不僅為檢 測研究、醫(yī)藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，同時為檢驗檢疫機構(gòu)技術(shù)指導、服務(wù) 出口企業(yè)提供技術(shù)上的支持。該發(fā)明成果將有望成為植物疫病分子診斷領(lǐng)域的突破性產(chǎn)品 及技術(shù)，是植物流行病學檢測技術(shù)體系的進一步完善和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定性高、均勻性好的番茄斑萎病毒分子標準樣品及 其制備方法。
[0007] 為了得到所述番茄斑萎病毒分子標準樣品，根據(jù)番茄斑萎病毒(TSWV)N基因全序 列，設(shè)計全序列及特異性引物，其堿基序列如下：
[0008] SEQ ID N0：1：TKAAGCAAGTTCTGYMAGTTTTG
[0009] SEQ ID NO：2:ATGTYYffAGGTTAAGCTCACT
[0010] SEQ ID N0：3：GGCTTGAATCAGAGGGTGAGA
[0011] SEQ ID N0：4:TTGGAGCCACTGACATGACC
[0012] 本發(fā)明的番茄斑萎病毒分子標準樣品，采用如下方法制備：
[0013] (1)采集感染番茄斑萎病毒的植物組織，液氮研磨；
[0014] (2)步驟(1)得到的植物組織中提取得到病毒RNA;
[0015] (3)步驟⑵的病毒RNA作為PCR反應模板，進行RT-PCR擴增反應，其中PCR反應的正 反引物分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2;
[0016] (4)將步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至PGEM-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感 受態(tài)細胞后，LB平板培養(yǎng)，篩選得到陽性克?。?br>[0017] (5)陽性克隆中提取得到質(zhì)粒，即為番茄斑萎病毒的標準樣品；
[0018] (6)取制備的核酸標準樣品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作為模板使用，經(jīng)采用特異性引 物SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4進行PCR定性分析，確認所制備的核酸標準樣品為目的核酸 樣品。
[0019 ]上述制備方法中，在步驟(4)中篩選陽性克隆的方法為RT-PCR方法，其中RT-PCR反 應的正反引物分別為SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2
[0020]本發(fā)明的番茄斑萎病毒分子標準樣品穩(wěn)定性高、均勻性好，為番茄斑萎病毒的檢 測研究、醫(yī)藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，同時為檢驗檢疫機構(gòu)技術(shù)指導、服務(wù) 出口企業(yè)提供技術(shù)上的支持。使用本發(fā)明的標準樣品可以實現(xiàn)不同實驗室結(jié)果的比對，從 而保證實驗室的質(zhì)量控制。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為實施例1中T SWV目標基因的PCR擴增反應產(chǎn)物的電泳圖，其中M : DL2000Marker，l~5:PCR擴增產(chǎn)物擴增出781bp大小的片段。
[0022]圖2是TSWV特異性引物擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖，其中1、3為陰性對照毒株cDNA、2為目 的DNA，4為空白對照;PCR擴增產(chǎn)物擴增出13 Ibp大小的片段。
[0023] 圖3是本發(fā)明標準樣品靈敏度檢測結(jié)果圖，其中由左到右，依次是 10-4,10-5,10-6。
【具體實施方式】
[0024] 下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。番茄斑萎病毒分子標準樣品及其制備方法按如下步驟進行：
[0025] 實施例1番茄斑萎病毒分子標準樣品的制備
[0026] (1)采集感染番茄斑萎病毒的植物組織，液氮研磨；
[0027] 采集0.1 g感染番茄斑萎病毒的植物組織加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入 1.5mL離心管中，加入ImL Trizol Reagent，顛倒混勾，2°C~8°C，12000g，離心10min0
[0028] (2)步驟(1)得到的植物組織中提取得到病毒RNA;
[0029]取上清，15 °C~30 °C，放置5min;加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩（勿渦旋振蕩）， 15S(315°C ~30°C，放置 2min ~3min;2°C ~8°C，12000g，離心 15min。小心吸取約為 600yL 的上 層水相，勿擾動中間相和下層相。加500yL異丙醇混合上清液，15°C~30 °C，放置IOmin。2°C ~8 °C，12000g，離心10min。去除上清液，沉淀中加入ImL 75 %乙醇，洗滌；2°C~8 °C，7500g， 離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30yL~50yL無 RNase的水中，即為提取得 到的病毒RNA。
[0030] (3)步驟(2)的病毒RNA作為PCR反應模板，進行RT-PCR擴增反應
[0031]步驟（2)的病毒RNA作為PCR反應模板，本發(fā)明自行設(shè)計引物，進行RT-PCR擴增反 應，擴增番茄斑萎病毒N基因全序列，大小為781bp的片段，其中PCR反應的正反引物序列如 下：
[0032] SEQ ID NO：I：TKAAGCAAGTTCTGYMAGTTTTG
[0033] SEQ ID NO：2:ATGTYYffAGGTTAAGCTCACT
[0034] 擴增溶液中加入2 X RT-PCR buffer(10倍聚合酶鏈式Mix反應液）12 · 5yL, IOpmol/ yLSEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2各0.5yL，將提取的待測樣品RNA加入反應體系中，DEPC水補 足體積至25yL，PCR循環(huán)條件為：48 ￡€3〇11^11，94°(：預變性51^11后，進入94°(：變性3〇8,53°(：退 火40s，72°C延伸45s，共循環(huán)35次;然后72°C再延伸lOmin。
[0035] 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，取2g瓊脂糖，于IOOmL電泳緩沖液中加熱，充分溶 化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5yg/mL，制膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面 剛剛沒過凝膠;將3yL~6yL PCR擴增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣;9V/cm恒壓電 泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部;紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果，待檢田間樣品能夠擴 增出預期條帶，擴增條帶為781bp，電泳結(jié)果見圖1。
[0036]目標基因的序列測定：
[0037] 將PCR擴增產(chǎn)物送寶生物（大連)有限公司進行測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO. 5。將 所得序列通過NCBI在線nucleotide blast分析，結(jié)果表明：該核苷酸序列與番前斑萎病毒 (TSWV)的核酸序列相似性最高達99%，為番茄斑萎病毒N基因全序列。
[0038]目標基因的純化：
[0039] 將PCR擴增產(chǎn)物采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑 盒(貨號DV805A)，并按其操作說明回收目標分子DNA片段，即SEQ ID NO.5所示的TSWV N基 因全序列。
[0040] (4)將步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至PGEM-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感 受態(tài)細胞后，LB平板培養(yǎng)，篩選得到陽性克??；
[0041 ]在步驟（3)中純化得到的目的片段4yL，2XRapid ligation buffer 5yL，PGEM-T 載體0.5yL，T4DNA Ligase 0.5yL，用無菌水補充至10yL，室溫連接lh。將連接產(chǎn)物加入到制 備好的感受態(tài)細胞E. col i JM109中，輕輕用移液器混勻，冰浴20min，42°C熱應激Imin，冰浴 2min，加入800yL SOC培養(yǎng)基，150g搖菌1 · 5h，1000 g離心10min，棄去培養(yǎng)液，加入新鮮的SOC 培養(yǎng)基200yL，混勻后涂在含有Amp+的LB平板上，風干后，37°C倒置培養(yǎng)12h-16h。
[0042] 挑取單克隆菌在LB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，用PCR方法進行陽性克隆的篩選，PCR體系 及反應條件見步驟3。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果獲得了與預期大小一致的 781bp片段。
[0043] (5)陽性克隆中提取得到質(zhì)粒，即為番茄斑萎病毒的標準樣品；
[0044] 應用Omega公司質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit I(IOOtest)，提取純化上述步 驟中篩選得到的陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒PGEM-T-TSWV，每支EP管分裝成IOOyL，每支重組質(zhì) 粒含量為Iyg，即為番前斑萎病毒分子標準樣品。
[0045] (6)標準品的鑒定
[0046]取制備的核酸標準樣品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作為模板使用，經(jīng)采用特異性引物 SEQ ID Ν0:3和SEQ ID Ν0:4進行PCR定性分析，擴增產(chǎn)物131bp，確認所制備的核酸標準樣 品為目的核酸樣品。
[0047] SEQ ID NO：3：GGCTTGAATCAGAGGGTGAGA
[0048] SEQ ID NO：4:TTGGAGCCACTGACATGACC
[0049] 擴增溶液中加入2 X PCR buffer(10倍聚合酶鏈式Mix反應液）12 · 5yL, IOpmolAiL SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4各0.5yL，將TSWV標準品DNA加入反應體系中，DEPC水補足體積 至25yL，PCR循環(huán)條件為：94°C預變性5min后，進入94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸 30s，共循環(huán)35次;然后72°C再延伸IOmin.。
[0050] 實施例2番茄斑萎病毒分子標準樣品的均勻性實驗
[0051] 番茄斑萎病毒分子標準樣品的均勻性測定是將如實施例1的方法制備的TSWV分子 標準樣品隨機分成兩個樣品組，即樣品組A和樣品組B，每個樣品組各有15個標準樣品，每個 樣品按照如下反應條件進行PCR擴增，測定PCR產(chǎn)物濃度(ng/yL )，通過比較PCR產(chǎn)物的濃度 變化，按照統(tǒng)計學方法評價標準樣品的均勻性，
[0052] PCR反應體系:反應管中加入番茄斑萎病毒分子標準樣品IyL(含I X HT2yg DNA)，2 XPCR buffer(10倍聚合酶鏈式Mix反應液）12.5yL, IOpmolAiL SEQ ID N0:3和SEQ ID NO: 4各0.5yL，DEPC水補足體積至25yL。
[0053] PCR反應條件:94°C預變性5min后，進入94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s， 共循環(huán)35次;然后72°C再延伸lOmin。
[0054] 結(jié)果如表1，2和3。
[0055] 表1番茄斑萎病毒分子標準樣品均勻性測定結(jié)果
[0059] 表3番前斑萎病毒分子標準樣品均勾性檢測
[0061] 從表1及其統(tǒng)計結(jié)果(表2和表3)的結(jié)果可知，兩個樣品組之間不存在顯著差異，可 以認為樣品是均勻的。
[0062] 實施例3番茄斑萎病毒分子標準樣品的穩(wěn)定性實驗
[0063] 將實施例1的方法制備的番茄斑萎病毒分子標準樣品隨機分組，每個樣品按照實 施例2所述的PCR反應體系和PCR反應條件下進行PCR擴增，測定PCR產(chǎn)物濃度(ng/yL )，通過 比較PCR產(chǎn)物的濃度變化，按照統(tǒng)計學方法評價標準樣品的穩(wěn)定性。
[0064]采用兩種類型的穩(wěn)定性試驗：
[0065] -種是在_20°C下的穩(wěn)定性試驗，隨機取番茄斑萎病毒分子標準樣品24份，每個月 檢測2份，連續(xù)12個月，結(jié)果如表4。
[0066] 另一種是在較高的溫度20°C下的穩(wěn)定性試驗，隨機取番茄斑萎病毒分子標準樣品 12份，每周檢測3份，連續(xù)4周，測試結(jié)果如表5。
[0067] 表4.穩(wěn)定性檢驗實驗(-20 °C)

[0070] 對表4結(jié)果的F檢驗結(jié)果為F = 2.149，F(xiàn)勃.Q5 = 4.284，F(xiàn)<FCr[Q.()5,5,5]，即樣品間無顯 著性差異。
[0071] 表5.穩(wěn)定性檢驗實驗(20°C)結(jié)果
[0075] 對表6結(jié)果方差分析結(jié)果為？ = 0.843，巧動.〇5 = 3.066^<?時().()5,5,5]，即樣品間無 顯著性差異。
[0076]實施例4定值方法
[0077] 由實施例1的方法制備的番茄斑萎病毒分子標準樣品隨機選15個，每個樣品按照 實施例2所述，用番茄斑萎病毒聚合酶鏈反應方法進行定值試驗，結(jié)果完全一致，均為番茄 斑萎病毒核酸陽性。
[0078] 本番茄斑萎病毒分子標準樣品經(jīng)福建檢驗檢疫局、煙臺檢驗檢疫局、甘肅檢驗檢 疫局、廣東檢驗檢疫局等協(xié)作試驗定值結(jié)果統(tǒng)計見表7。
[0079]表7.協(xié)作試驗定值結(jié)果表
[0082]應用番茄斑萎病毒聚合酶鏈反應方法對本標準樣品的定值實驗結(jié)果均為番茄斑 萎病毒核酸陽性。
【主權(quán)項】
1. 一種番茄斑萎病毒標準樣品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 采集感染番茄斑萎病毒的植物組織，液氮研磨； (2) 步驟(1)得到的植物組織中提取得到病毒RNA; (3) 步驟(2)的病毒RNA作為PCR反應模板，進行RT-PCR擴增反應，其中PCR反應的正反引 物分別為SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2; (4) 將步驟(3)的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至PGEM-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài) 細胞后，LB平板培養(yǎng)，篩選得到陽性克隆； (5) 陽性克隆中提取得到質(zhì)粒，即為番茄斑萎病毒的標準樣品； 其中所述感受態(tài)細胞為E.coli JM109。2. -種利用權(quán)利要求1所述方法制備的番茄斑萎病毒標準樣品。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861497SQ201610333917
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】吳興海, 陳長法, 李明哲, 王有福, 文朝慧, 栗智平, 李建勇, 宋濤, 王英超
【申請人】山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心