高gc含量基因的pcr擴(kuò)增緩沖液及其擴(kuò)增方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液。所述高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液包括如下組分：Tris?Hcl150mmol/L、(NH4)2SO440mmol/L、一水甜菜堿2.6mol/L、乳化劑Tween 20 0.02％、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑20％，配置后，過濾去菌，?20℃保存。本發(fā)明還公開一種基于高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液的擴(kuò)增方法及應(yīng)用。本發(fā)明使用了(NH4)2SO4替代了KCL，以增加引物與模板結(jié)合的特異性，并能兼容更廣譜的Mg2+范圍。
【專利說明】
高GC含量基因的PCR擴(kuò)増緩沖液及其擴(kuò)増方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液 及其擴(kuò)增方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外 核酸擴(kuò)增技術(shù)。PCR過程一般分為變性、退火、延伸3個(gè)階段，首先DNA在高溫條件下發(fā)生變性 解鏈，在溫度降至55 °C左右時(shí)引物與模板DNA單鏈結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行DNA 合成。與之前常用的細(xì)菌擴(kuò)增靶基因相比，它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易 于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。PCR技術(shù)發(fā)展到今天已經(jīng)有近30年的時(shí)間，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，使它更 適合實(shí)際應(yīng)用，但其在擴(kuò)增高GC含量序列方面仍有不足之處。堿基A、T之間形成2對(duì)氫鍵，G、 C之間形成3對(duì)氫鍵，因此高G、C含量基因解鏈所需能量高，變性困難，并且模板中容易形成 穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)妨礙DNA聚合酶在模板上進(jìn)行DNA合成而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。
[0003] 從PCR技術(shù)發(fā)明以來，人們就開始了對(duì)PCR反應(yīng)添加其它化學(xué)物質(zhì)以提高靶基因產(chǎn) 率的研究。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了許多添加劑以其各自的特點(diǎn)在不同方面對(duì)PCR反應(yīng)起著 促進(jìn)作用，例如DMSO JMSO作為一種PCR增強(qiáng)劑，它的作用原理是通過破壞了模板DNA大溝與 小溝里帶有供體和受體的互補(bǔ)氫鍵，降低DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，增加引物與模板的特異性結(jié) 合，降低非特異性擴(kuò)增。但有報(bào)道稱當(dāng)DMSO濃度過高時(shí)會(huì)影響DNA聚合酶活性，因此在使用 時(shí)，要平衡模板、引物、酶的用量。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，PCR擴(kuò)增緩沖液對(duì)引物與模板的特異性結(jié)合作用小，擴(kuò)增出目的條帶 的機(jī)會(huì)小，只能采用有機(jī)溶劑如乙二醇、乙酸乙酯、正戊烷等增高GC含量DNA片段擴(kuò)增效率 的方法，但是由于采用了有機(jī)溶劑，對(duì)人體有害，使用不便。因此，有必要提供一種新的高GC 含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液解決上述技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述現(xiàn)有PCR擴(kuò)增緩沖液對(duì)引物與模板結(jié)合的特異性作用小，擴(kuò)增出目 的條帶的機(jī)會(huì)小的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種對(duì)引物與模板結(jié)合的特異性作用明顯，擴(kuò)增 出目的條帶的機(jī)會(huì)大的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液及其擴(kuò)增方法。
[0006] 本發(fā)明提供一種高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液，所述緩沖液包括如下組分： Tris-Hcl 150 mmol/L (NH4)2SO4 40 mmol/L
[0007] 一 水甜菜減 2.6mol/L 乳化劑 Tween 20 0.02% PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑 20%。
[0008] 在本發(fā)明提供的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液的一種較佳實(shí)施例中，所述TriS- He 1的PH值為8.8。
[0009] 在本發(fā)明提供的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液的一種較佳實(shí)施例中，所述PCR反 應(yīng)增強(qiáng)劑為DMS0、甘油、甲酰胺及硫酸銨中的任意一種。
[0010] 在本發(fā)明提供的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液的一種較佳實(shí)施例中，所述高GC 含量基因中GC含量高達(dá)80%，所述PCR擴(kuò)增緩沖液適用于人類和動(dòng)物的基因擴(kuò)增。
[0011] 本發(fā)明提供一種高GC含量基因的PCR擴(kuò)增方法，包括以下步驟：
[0012] 步驟一、準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系：包括DNA聚合酶、高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液、 dNTP、上游引物、下游引物、DNA模板和雙蒸水；
[0013] 步驟二、進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序：
[0014] 預(yù)處理:95°C 變性 5min;
[0015] PCR 反應(yīng)：95°C 變性40-60s，50-65°C 退火40-60s，72°C 延伸 50-120s，共 25-35 個(gè)循 環(huán)；
[0016] 延伸:72°C 延伸 IOmin;
[0017]擴(kuò)增結(jié)束后溫度降至4°C保存。
[0018]本發(fā)明還提供一種高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液在高GC含量基因 PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn) 中的應(yīng)用。
[0019]相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液及其擴(kuò)增方法具 有以下有益效果：
[0020] -、本發(fā)明用(NH4)2S〇4替代現(xiàn)有PCR擴(kuò)增緩沖液普遍使用的KCL，可以增加引物與 模板的特異性結(jié)合，并能兼容更廣譜的Mg2+范圍。
[0021] 二、本發(fā)明加入了適量的DMSO等協(xié)效制劑，用以對(duì)復(fù)雜的如"GC-rich"的模板的擴(kuò) 增，降低DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，增加引物與模板的特異性結(jié)合，降低因引物設(shè)計(jì)不夠理想而 無法擴(kuò)增出目的條帶的機(jī)會(huì)。
[0022]三、本發(fā)明使用Tween-20作為乳化劑，其具有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識(shí) 別能力，可以封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)降低抗體的非特異性結(jié)合，而不替換膜上的靶蛋白、不 結(jié)合靶蛋白的標(biāo)位、也不與抗體或檢測(cè)試劑發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0023]四、本發(fā)明加入了Tris-Hcl，用以在PCR擴(kuò)增緩沖液中與甘氨酸構(gòu)成緩沖體系，穩(wěn) 定擴(kuò)增過程中的PH值。
[0024]五、本發(fā)明使用了一水甜菜堿來避免高濃度鹽對(duì)DNA聚合酶活性的毒害。
[0025] 六、本發(fā)明初步的實(shí)驗(yàn)表明該緩沖液對(duì)一些困難的PCR擴(kuò)增有很好的增強(qiáng)作用，比 甲酰胺等經(jīng)典的PCR擴(kuò)增添加試劑具有更多的優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)增出的條帶更亮。
【附圖說明】
[0026] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖，其中：
[0027] 圖1是本發(fā)明提供的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液的一較佳實(shí)施例的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于 本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] NKX3 · 1 基因 ORF 的 PCR 擴(kuò)增
[0031] NKX3.1基因 ORF全長(zhǎng)為705bp，在其前200多個(gè)堿基，GC含量高達(dá)80%，是一種典型 的局部高GC含量基因。
[0032] 1、模板制備
[0033] 應(yīng)用市售基因組DNA提取試劑盒，提取DNA的濃度為lOOng/μΙ，260/230值大于2.0， 260/280值大于1.8。
[0034] 2、引物設(shè)計(jì)
[0035] 根據(jù)NKX3.1基因序列，采用01ig〇6.0軟件設(shè)計(jì)引物如下：
[0036] 上游引物：5 ' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAG-3 '
[0037] 下游引物：5 ' -AGCCCCGCACTTCCACCACC-3 '
[0038] 3、PCR 反應(yīng)
[0039] PCR擴(kuò)增體系1:
[0040] 10\811打6『，541;(1町？8(2.5111111〇1/1)441;上游引物（1(^111〇1/1)叫1 ;下游引物（1(^ mol/L) ΙμL; DNA300ng; DNA聚合酶（2 · 5UAU) 2μ1; CldH2O補(bǔ)足至50μ1。
[0041 ] PCR擴(kuò)增體系2:
[0042] 10\811打6『，541;(1町？8(2.5111111〇1/1)441;上游引物（1(^111〇1/1)叫1 ;下游引物（1(^ mol/υ?μL; 10%DMS01yl ;DNA300ng;DNA聚合酶（2· 5υ/μ1)2μ1 ;ddH20補(bǔ)足至50μ1。
[0043] PCR擴(kuò)增體系3:
[0044] 10\811打6『，541;(1町？8(2.5111111〇1/1)441;上游引物（1(^111〇1/1)叫1 ;下游引物（1(^ mol/L) ΙμL; 10% 甲酰胺ΙμL;DNA300ng;DNA聚合酶（2 · 5UAU)2μ1; CldH2O補(bǔ)足至50μ1。
[0045] PCR擴(kuò)增體系4:
[0046] 2 X Buffer，5μ1; dNTPs (2 · 5mmoI/L)4μ1;上游引物（1 ΟμπιοI/L) ΙμL;下游引物（10μ mol/L) ΙμL; DNA300ng; DNA聚合酶（2 · 5υ/μ1) 2μ1; CldH2O補(bǔ)足至50μ1。
[0047] 其中，卩〇財(cái)廣增體系1-3中，811打61包括：30〇11111^8-!1(：1(口!18.8)，2〇11111((：1 ;
[0048] PCR擴(kuò)增體系4中的2 XBuff er緩沖液包括如下組分： Tris-Hd 150 inmol/L (NH4)2SO4 40 mmol/L
[0049] 一水甜菜堿 2.6mol/L 乳化劑 Tween 20 0.02% PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑 20%
[0050] 配置后，過濾去菌，-20°c保存。
[0051] 具體地，所述PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑為DMS0、甘油、甲酰胺及硫酸銨中的任意一種，本實(shí)施 例中優(yōu)選DMSO。
[0052] PCR擴(kuò)增程序：
[0053] ①預(yù)處理：95Γ變性5min。
[0054] ②PCR反應(yīng):95 °C變性50s，62 °C退火40s，72 °C延伸Imin，共30個(gè)循環(huán)。
[0055] ③延伸：72°C10min。
[0056] ④擴(kuò)增結(jié)束后溫度降至4°C保存。
[0057] 4、核酸電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
[0058] 1.5 %瓊脂糖電泳，加入EB，紫外檢測(cè)PCR產(chǎn)物約為705bp ICR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖結(jié) 果見圖1。從圖1中可以看出，本實(shí)施例的擴(kuò)增體系4能夠擴(kuò)增GC含量80%的目的基因，且PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高，條帶單一。
[0059] 請(qǐng)參閱圖1，是本發(fā)明提供的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液的一較佳實(shí)施例的電 泳圖。第一道為常規(guī)擴(kuò)增，使用promega的擴(kuò)增試劑，擴(kuò)增用buffer為promega的PCR 10 X buffer。第二道為在常規(guī)擴(kuò)增試劑基礎(chǔ)上加入10%DMS0(sigma)，擴(kuò)出非常淡的條帶。第三 道為在常規(guī)擴(kuò)增基礎(chǔ)上加入10%甲酰胺（sigma)，未擴(kuò)增出明顯條帶。DMSO與甲酰胺均是常 用的協(xié)效制劑，但在擴(kuò)增一些相當(dāng)高GC含量基因時(shí)仍存在一定問題。第四道使用了所述高 GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液，用該buffer替代promega的10 X buffer，余試劑及擴(kuò)增程序 不變，擴(kuò)增出目的條帶。
[0060] 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液可應(yīng)用于高GC含量基因擴(kuò) 增等困難PCR擴(kuò)增中，擴(kuò)增出的條帶更亮。
[0061] 本發(fā)明提供的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液及其擴(kuò)增方法和應(yīng)用具有以下有益 效果：
[0062] -、本發(fā)明用(NH4)2S〇4替代現(xiàn)有PCR擴(kuò)增緩沖液普遍使用的KCL，可以增加引物與 模板的特異性結(jié)合，并能兼容更廣譜的Mg 2+范圍。
[0063]二、本發(fā)明加入了適量的DMSO等協(xié)效制劑，用以對(duì)復(fù)雜的如"GC-rich"的模板的擴(kuò) 增，降低DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，增加引物與模板的特異性結(jié)合，降低因引物設(shè)計(jì)不夠理想而 無法擴(kuò)增出目的條帶的機(jī)會(huì)。
[0064]三、本發(fā)明使用Tween-20作為乳化劑，其具有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識(shí) 別能力，可以封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)降低抗體的非特異性結(jié)合，而不替換膜上的靶蛋白、不 結(jié)合靶蛋白的標(biāo)位、也不與抗體或檢測(cè)試劑發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0065]四、本發(fā)明加入了Tris-Hcl，用以在PCR擴(kuò)增緩沖液中與甘氨酸構(gòu)成緩沖體系，穩(wěn) 定擴(kuò)增過程中的PH值。
[0066] 五、本發(fā)明使用了一水甜菜堿來避免高濃度鹽對(duì)DNA聚合酶活性的毒害。
[0067] 六、本發(fā)明初步的實(shí)驗(yàn)表明該緩沖液對(duì)一些困難的PCR擴(kuò)增有很好的增強(qiáng)作用，比 甲酰胺等經(jīng)典的PCR擴(kuò)增添加試劑具有更多的優(yōu)勢(shì)，擴(kuò)增出的條帶更亮。
[0068] 以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技 術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液，其特征在于，所述緩沖液包括如下組分： Tris-Hcl 150 mmol/L (NH4)2S04 40 mmol/L 一水甜菜堿 2.6mol/L 乳化劑 Tween 20 0.02% PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑 20%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液，其特征在于，所述Tris-Hcl 的PH值為8.8。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液，其特征在于，所述PCR反應(yīng)增 強(qiáng)劑為DMS0、甘油、甲酰胺及硫酸銨中的任意一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液，其特征在于，所述高GC含量 基因中GC含量高達(dá)80%，所述PCR擴(kuò)增緩沖液適用于人類和動(dòng)物的基因擴(kuò)增。5. -種基于權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液的PCR擴(kuò)增方 法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一、準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系：包括DNA聚合酶、所述高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液、 dNTP、上游引物、下游引物、DNA模板和雙蒸水； 步驟二、進(jìn)行PCR擴(kuò)增程序： 預(yù)處理:95°C變性5min; PCR 反應(yīng):95 °C 變性40-60s，50-65 °C 退火40-60s，72 °C 延伸 50-120s，共 25-35個(gè)循環(huán)； 延伸:72°C延伸lOmin; 擴(kuò)增結(jié)束后溫度降至4°C保存。6. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述高GC含量基因的PCR擴(kuò)增緩沖液在高GC含量基因 PCR擴(kuò) 增實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105861491SQ201610250347
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月21日
【發(fā)明人】馬琪, 程躍, 俞鑫, 王平, 郁芮, 虞碧霞
【申請(qǐng)人】馬琪