一種含有白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，其中兩者在培養(yǎng)體系中的濃度范圍如下：白藜蘆醇1μM-100μM蠶絲絲膠蛋白1μg/ml‐100μg/ml本發(fā)明將白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白組合，添加到自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)體系中，意外的發(fā)現(xiàn)其可提高外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood monocyto,PBMC)來源的體外擴增的自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell,NK)的遷移活性和殺傷活性。
【專利說明】
一種含有白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種培養(yǎng)自然殺傷細(xì)胞的培養(yǎng)基組合物，所 述組合物中含有白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷性細(xì)胞(Natural killer cell，NK)細(xì)胞是一種廣泛存在于外周血，脾 臟，淋巴結(jié)等組織和器官中，包漿內(nèi)含有大顆粒成分的淋巴樣細(xì)胞，是參與人體天然免疫反 應(yīng)和抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。NK細(xì)胞主要通過直接和間接兩種方式發(fā)揮免疫活性。其 中直接途徑主要是NK細(xì)胞通過其表面的特異的活化性或者/和抑制性受體對體內(nèi)的"自我" 與"非我"細(xì)胞進行區(qū)分，識別后這些表面受體與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)分子進行特異性結(jié)合， 進而NK細(xì)胞釋放穿孔素，顆粒酶以及IL-2，IL-15, INF-γ等多種細(xì)胞因子對靶細(xì)胞進行殺 傷和清除。間接方式又稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity，ADCC)。該途徑主要是通過NK細(xì)胞表面的⑶16分子與IgG抗 體的Fc段結(jié)合，進而可對該抗體俘獲的靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，誘導(dǎo)已被抗體結(jié)合的靶細(xì)胞 發(fā)生凋亡或者裂解。
[0003] 隨著近年來腫瘤免疫治療技術(shù)突飛猛進的發(fā)展，NK已在免疫抗腫瘤臨床應(yīng)用中表 現(xiàn)出越來越突出的優(yōu)勢和潛力。目前，臨床上獲得NK的方法主要是從病人或者健康供者外 周血中分離PBMC，利用包括IL-2，IL-15，IL-21等在內(nèi)的多種細(xì)胞因子進行誘導(dǎo)，擴增，使 NK細(xì)胞在體外擴增到一定數(shù)量后回輸給患者，達(dá)到治療的目的（專利）。但是，依然有諸多障 礙阻礙了NK的臨床應(yīng)用：1)NK體外擴增效率低，增殖能力較弱；2)培養(yǎng)后的NK細(xì)胞純度不 高；3)NK細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中無法得到充分的刺激與活化，導(dǎo)致其進入體內(nèi)后對腫瘤細(xì) 胞的殺傷效率低下;4)NK細(xì)胞進入體內(nèi)后由于缺乏歸巢，趨化等細(xì)胞因子信號分子，無法有 效的迀移至腫瘤病灶部位，發(fā)揮其殺傷活性。
[0004]白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種廣泛存在于多種植物中的天然抗氧化物質(zhì)， 具有良好的抗氧化性，可預(yù)防血小板凝集，降低血液粘稠度，在臨床上被廣泛用于心腦血管 疾病的治療。近些年越來越多的研究還證明，RES具有良好的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。體內(nèi) 實驗證明，RES可以增強免疫抑制小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的清除能力，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(高 路等，《西安交通大學(xué)學(xué)報》2003，24: 2);體外實驗表明，RES可提高NK細(xì)胞對A549肺癌細(xì)胞 株的殺傷活性（呂小婷等，《現(xiàn)代免疫學(xué)》2014，01)。
[0005] 蠶絲絲膠蛋白（Silk Sericin,SS)是天然蠶絲中的主要成分之一，是一種包裹于 在絲素外周的球狀蛋白。絲膠蛋白是絲綢制造業(yè)中的主要副產(chǎn)物。由于絲膠蛋白的性狀和 化學(xué)成分與動物膠相似度極高，又具有一定的彈性和韌性，因此在再生醫(yī)學(xué)，組織工程，化 妝品制造領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。而近些年大量的基礎(chǔ)研究表明，絲膠蛋白除了具有物 理支撐性以外，其還具有多種生物學(xué)活性，包括抗氧化(相入麗等，《絲綢》2008,45:5)，促進 細(xì)胞體外活性維持，粘附（Pornanong Aramwit et al. Int. J.Mol. Sci .2010,11; Satoshi Terada et al .Cytotechnology 2002,11:01)，提高細(xì)胞系凍存后復(fù)蘇活率（Martina Verdanova et al.BIOPRESERVATION AND BIOBANKING 2014,12:2)等方面表現(xiàn)出了極具希 望的應(yīng)用效果。
[0006] 但將白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白組合，添加到自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)體系中對其進行擴 增培養(yǎng)并進一步用于治療的技術(shù)方案現(xiàn)有技術(shù)沒有報道。
[0007] 本發(fā)明將白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白組合，添加到自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)體系中，意外 的發(fā)現(xiàn)其可提高外周血單個核細(xì)胞來源的體外擴增的自然殺傷細(xì)胞的迀移活性和殺傷活 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種含有白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，所述組合物 含有白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白，兩者在組合物中的終濃度如下：
[0009] 白藜蘆醇 1μΜ-100μΜ
[0010] 香絲絲膠蛋白 lμg/ml-100μg/ml
[0011] 優(yōu)選的，兩者在混合物中的終濃度如下：
[0012]白藜蘆醇 1μΜ_50μΜ
[0013] 香絲絲膠蛋白 lμg/ml_50μg/ml
[0014] 最優(yōu)選的，兩者在混合物中的終濃度如下：
[0015] 白藜蘆醇 5μΜ
[0016] 蠶絲絲膠蛋白 20μg/ml
[0017] 本發(fā)明所述的組合物，其中還含有培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)，其與白藜蘆醇和蠶絲 絲膠蛋白混合在一起構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物。
[0018] 其中所述的培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)為任何一種細(xì)胞培養(yǎng)基，包括按照現(xiàn)有技術(shù)使 用時現(xiàn)用現(xiàn)配的細(xì)胞培養(yǎng)基和市場上購買的可直接使用的細(xì)胞培養(yǎng)基，這些細(xì)胞培養(yǎng)基 可以用來培養(yǎng)任何細(xì)胞，包括植物細(xì)胞，動物細(xì)胞，真菌和細(xì)菌，人的組織細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞， 重組的細(xì)胞，優(yōu)選的是培養(yǎng)NK細(xì)胞等人工制備的細(xì)胞的培養(yǎng)基，如SCGM培養(yǎng)基。
[0019] 本發(fā)明進一步包括本發(fā)明所述的組合物的制備方法，所述方法包括將白藜蘆醇和 蠶絲絲膠蛋白與培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)混合的步驟。
[0020] 本發(fā)明的制備方法，優(yōu)選的是將白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白分別或一起配制成液體 儲備液，使用時，和培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)混合即可。
[0021 ]本發(fā)明的制備方法，最優(yōu)選的是將白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白分別配制成液體儲備 液，冷凍保存，使用時，和培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)按照適當(dāng)?shù)谋壤旌霞纯伞?br>[0022]本發(fā)明進一步提供一種體外NK細(xì)胞培養(yǎng)方法，所述方法包括使用本發(fā)明的組合物 在體外培養(yǎng)NK細(xì)胞。
[0023]優(yōu)選的，本發(fā)明的體外NK細(xì)胞培養(yǎng)方法，步驟如下：
[0024]分離PBMC，接種于含有本發(fā)明的組合物的培養(yǎng)體系中，使用0KT-3,和IL-2刺激細(xì) 胞3-5天后;每2-3天補加 IL-2,至培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)周為14-21天。其中PBMC細(xì)胞初始接種密度 為I X 106/ml-5 X IOfVml，優(yōu)選的比例為I X IOfVml。加入0KT-3的終濃度為lng/ml-1000ng/ ml，加入IL-2的終濃度為50IU/ml-3000IU/ml;幾天后，補加 IL-2的終濃度為50IU/ml-1000IU/ml。本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明的培養(yǎng)方法可以提高NK細(xì)胞的體外擴增能力， 提高細(xì)胞得率;可以增強NK細(xì)胞的活化性受體表達(dá)，提高NK細(xì)胞的殺傷能力；提高NK細(xì)胞趨 化性受體的表達(dá)，提高NK細(xì)胞在體內(nèi)的迀移能力。
[0025]本發(fā)明的有益效果包括：
[0026] 1.提高了NK細(xì)胞的體外擴增能力；
[0027] 2.提高了NK細(xì)胞在細(xì)胞終產(chǎn)品中的純度；
[0028] 3 .提高了NK細(xì)胞表面活化性受體的表達(dá)水平，增強了NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷能 力；
[0029] 4.提高了NK細(xì)胞表面趨化性受體的表達(dá)水平，增強了NK細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢能力；
[0030] 5、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，將將白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白聯(lián)合用于NK細(xì)胞的體外擴增培養(yǎng)， 具有協(xié)同增效作用，包括協(xié)同增加對靶細(xì)胞的殺傷等，其和單獨使用白藜蘆醇以及單獨使 用蠶絲絲膠蛋白相比，具有無法比擬的協(xié)同優(yōu)勢，產(chǎn)生了協(xié)同增效作用。
[0031] 以下是對本發(fā)明中名稱術(shù)語的解釋：
[0032] 白藜蘆醇:又稱為芪三酚，是多酚類化合物，主要來源于花生、葡萄(紅葡萄酒）、虎 杖、桑椹等植物
[0033] 蠶絲絲膠蛋白：由家蠶產(chǎn)絲過程中分泌的一種蛋白，是蠶絲的主要成份 [0034] SCGM培養(yǎng)基:用于NK細(xì)胞體外擴增活化的培養(yǎng)試劑
[0035] NK細(xì)胞：自然殺傷細(xì)胞
[0036] PBMC:外周血單個核細(xì)胞 [0037] 0KT-3:小鼠來源的抗人⑶3蛋白單鏈抗體
[0038] IL-2:白細(xì)胞介素-2
[0039] RES:白藜蘆醇
[0040] SS:蠶絲絲膠蛋白
【附圖說明】
[0041] 圖1.白藜蘆醇和絲膠蛋白聯(lián)用可以有效的刺激NK細(xì)胞體外的增殖 [0042]圖2.白藜蘆醇和絲膠蛋白提高了NK細(xì)胞亞群在總細(xì)胞中的比例
[0043] 圖3.白藜蘆醇和絲膠蛋白組合物對NK細(xì)胞表面不同分子受體表達(dá)量的影響
[0044] 圖4.白藜蘆醇和絲膠蛋白聯(lián)用對NK效靶比殺傷活性檢測
[0045] 圖5.白藜蘆醇和絲膠蛋白聯(lián)用時NK體外迀移能力的檢測
[0046]圖6.白藜蘆醇和絲膠蛋白聯(lián)用時NK在N0D/SCID小鼠體內(nèi)的迀移及歸巢能力評價 [0047]圖7.白藜蘆醇與絲膠蛋白聯(lián)用可以增強NK細(xì)胞在體外對Treg抑制殺傷能力的抵 抗作用
【具體實施方式】：
[0048] 以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
[0049] 以下實施例中所述的絲膠蛋白即為本發(fā)明所述的蠶絲絲膠蛋白。
[0050] 實施例1.
[0051] 白藜蘆醇和絲膠蛋白儲存液的制備
[0052]將白藜蘆醇粉末(購自Sigma公司，美國）溶解于細(xì)胞培養(yǎng)級DMSO中，配制成終濃度 為5mM的儲存液，溶液經(jīng)0.22μπι濾器過濾除菌，按照lml/支進行分裝，避光保存于-80度下。 [0053] 蠶絲絲膠蛋白干粉(購自Wako公司，日本)溶解于ρΗ7·4的PBS中，配制成10mg/ml的 儲存液，溶液經(jīng)〇. 22μπι濾器過濾除菌，分裝為lml/支，凍存于-80度保存。
[0054]使用時，將兩種添加物的儲存液取出并在室溫下迅速融化；
[0055]按照以下比例和培養(yǎng)基混合
[0056] 取白藜蘆醇儲存液2ml，絲膠蛋白儲存液lml，SCGM培養(yǎng)基97ml，
[0057] 在室溫下混合均勻，即得。所得培養(yǎng)基注意避光保存。
[0058] 其中白藜蘆醇在終產(chǎn)品中的濃度為100μΜ，絲膠蛋白的濃度為100μg/ml。
[0059] 另外，根據(jù)實驗需要，也可按照以下比例配制：
[0060] 按照以下比例和培養(yǎng)基混合
[0061 ] 取白藜蘆醇儲存液Iml，絲膠蛋白儲存液0.5ml，SCGM培養(yǎng)基98.5ml，
[0062]在室溫下混合均勻，即得。所得培養(yǎng)基注意避光保存。
[0063]其中白藜蘆醇在終產(chǎn)品中的濃度為50μΜ，絲膠蛋白的濃度為50μg/ml。
[0064] 也可按照以下比例配制：
[0065]按照以下比例和培養(yǎng)基混合
[0066] 取白藜蘆醇儲存液100μΙ，絲膠蛋白儲存液200μ1，SCGM培養(yǎng)基100mL，
[0067] 在室溫下混合均勻，即得。所得培養(yǎng)基注意避光保存。
[0068] 其中白藜蘆醇在終產(chǎn)品中的濃度為5μΜ，絲膠蛋白的濃度為20μg/ml。
[0069] 也可按照以下比例配制：
[0070]按照以下比例和培養(yǎng)基混合
[0071] 取白藜蘆醇儲存液Iml，絲膠蛋白儲存液0.5ml ,X-VIVOlO培養(yǎng)基98.5ml，在室溫下 混合均勻，即得。所得培養(yǎng)基注意避光保存。
[0072]其中白藜蘆醇在終產(chǎn)品中的濃度為50μΜ，絲膠蛋白的濃度為50μg/ml。
[0073] 也可按照以下比例配制：
[0074]按照以下比例和培養(yǎng)基混合
[0075] 取白藜蘆醇儲存液100μΙ，絲膠蛋白儲存液200μ1，X-VIV010培養(yǎng)基IOOrnl，在室溫 下混合均勻，即得。所得培養(yǎng)基注意避光保存。
[0076] 其中白藜蘆醇在終產(chǎn)品中的濃度為5μΜ，絲膠蛋白的濃度為20μg/ml。
[0077] 實施例2.白藜蘆醇與絲膠蛋白聯(lián)用對NK細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖能力的評價采集健康 人外周血30ml，按照文獻(xiàn)報道的方法，使用人單個核細(xì)胞分離液(北京東方華輝生物醫(yī)藥科 技有限公司，Cat.No. 25610)進行PBMC的分離。分離后的PBMC利用臺盼藍(lán)拒染法進行計數(shù)， 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為〇. 5x106細(xì)胞/ml，用D-PBS重懸。
[0078]按照表1.中實驗設(shè)計的分組方法，利用不同的培養(yǎng)配方進行NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)， SCGM培養(yǎng)基購自CellGenix，人源化CD3單克隆抗體0KT-3購自Takara，重組人白細(xì)胞介素-2 (IL-2)購自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)。
[0079]培養(yǎng)體系分別為，
[0080] 空白SCGM培養(yǎng)基，
[0081] 含有白藜蘆醇的SCGM培養(yǎng)基其中白藜蘆醇在培養(yǎng)體系中的濃度為5μΜ，含有絲膠 蛋白的SCGM培養(yǎng)基，其中的絲膠蛋白濃度為20μg/ml。
[0082]含有白藜蘆醇與絲膠蛋白的SCGM培養(yǎng)基，其中的白藜蘆醇在培養(yǎng)體系中的濃度為 5μΜ，絲膠蛋白濃度為20μg/ml。
[0083] 在分離PBMC當(dāng)天，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，使用0KT-3，10ng/ml和IL-2,500IU/ ml刺激細(xì)胞;5天后，每3天根據(jù)細(xì)胞生長情況，向培養(yǎng)瓶中補加含有IL-2，500IU/ml的培養(yǎng) 基，直至培養(yǎng)結(jié)束;不同實驗組按照表1.的設(shè)計，在培養(yǎng)體系中分別添加空白SCGM培養(yǎng)基， 白藜蘆醇，絲膠蛋白以及白藜蘆醇和絲膠蛋白之混合，并使各組容積相同。各組起始培養(yǎng) 細(xì)胞數(shù)為3x106,分別在培養(yǎng)中的第5,7，10,和14天取樣進行細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果繪制 細(xì)胞增殖曲線。
[0084]同時在第14天收獲細(xì)胞時，利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測NK細(xì)胞占總細(xì)胞的百分 率，評價NK細(xì)胞的純度。實驗方法簡述如下:根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，按照每個樣品106細(xì)胞數(shù)從 四組收獲的NK細(xì)胞中進行取樣。細(xì)胞離心后，重懸于200μ1細(xì)胞保存液中，檢測NK細(xì)胞表面 標(biāo)志物，包括 CD3，CD56 和 CD16，其中CD3-/CD56+，CD56+/CD16-，CD56+/CD16-是 NK 細(xì)胞的表 面標(biāo)志性分子。
[0085] 實驗結(jié)果圖1.顯示，與對照組相比，添加白藜蘆醇或者添加絲膠可以促進NK細(xì)胞 體外的增殖，但是與對照組相比，并沒有顯著性差異;而同時向培養(yǎng)體系中添加白藜蘆醇和 絲膠蛋白，可以顯著的提高NK體外擴增的能力。通過流式細(xì)胞分析，檢測四組培養(yǎng)體系獲得 的NK細(xì)胞其表面標(biāo)志性分子，對其純度進行分析表明，使用白藜蘆醇和絲膠蛋白的培養(yǎng)組 中，NK細(xì)胞占總細(xì)胞的百分率高于其他組。
[0086] 表1.實驗分組
[0088] 其中1^3為5以]?，33為2(^8/1111，？81(：其實接種密度為2\106/1111
[0089] 實施例3.白藜蘆醇和絲膠蛋白對NK細(xì)胞表面不同分子受體表達(dá)水平的影響
[0090] 在培養(yǎng)第14天，收集不同組的NK細(xì)胞，采用流式細(xì)胞分析技術(shù)對NK表面表達(dá)的具 有代表性的活化性受體，抑制性受體，趨化性受體以及細(xì)胞因子受體進行了分析。操作過程 簡述如下:每個進行流式檢測的樣品中細(xì)胞數(shù)不少于IO 6細(xì)胞。樣品在室溫下，350g離心10 分鐘，棄去培養(yǎng)基上清，用細(xì)胞保存液進行重懸，終體積為200μ1。根據(jù)檢測的分子加入不同 的特異性抗體，檢測的分子以及相應(yīng)分子表達(dá)倍數(shù)變化的計算方法見下表2.。
[0091 ] 表2.本實驗涉及的NK細(xì)胞表面分子及分類
[0094] 通過流式細(xì)胞分析的結(jié)果顯示（圖3.)，培養(yǎng)體系中添加了白藜蘆醇和絲膠蛋白 后，與單獨使用任何一種或者不適用任何一種添加物的培養(yǎng)方法相比，NK細(xì)胞表面的趨化 性受體CCR7，CXCR3和CD62L的表達(dá)量和細(xì)胞因子受體IL-21R顯著升高；抑制性受體包括 KIR2DL1，KIR3DL1的表達(dá)量顯著下降。此外，與其他實驗組相比，活化性受體NKG2D，NKp30， NKp44和NKp46的表達(dá)量也發(fā)生上調(diào)。
[0095] 實施例4.白藜蘆醇和絲膠蛋白對NK細(xì)胞體外殺傷活性的影響
[0096]利用CFSE法測定不同實驗組獲得的NK體外靶細(xì)胞殺傷活性，使用靶細(xì)胞為人白血 病細(xì)胞系K562XFSE染色試劑盒購自Life Technology公司（貨號：Cat · 34554)，碘化丙啶 (PI)購自Sigma公司。K562細(xì)胞系購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。實驗分組與實施 例2相同。
[0097]將靶細(xì)胞的密度均調(diào)整至6xl04/ml，加入到U型底96孔培養(yǎng)板中，每孔100μΙ。收獲 四個實驗組培養(yǎng)的NK細(xì)胞，按照試劑盒說明書對NK細(xì)胞進行標(biāo)記，將標(biāo)記后的細(xì)胞按照效 靶比5 :1，10:1，和20 :1的比例與靶細(xì)胞等體積混合，設(shè)置3個平行對照空。同時設(shè)單獨效應(yīng) 細(xì)胞和空白培養(yǎng)基作為對照空?；旌虾笈囵B(yǎng)板在37°C，5%C02條件下孵育4小時。孵育結(jié)束 后，每孔加入25μ1 PI染液（IOOygAU )，冰浴孵育5分鐘后，用流式細(xì)胞儀進行分析，測定NK 對靶細(xì)胞的殺傷能力。靶細(xì)胞的殺傷百分比的計算方式為：細(xì)胞毒百分比=[實驗組死亡 的靶細(xì)胞-自然死亡的靶細(xì)胞/100-自然死亡的靶細(xì)胞]X 100
[0098]實驗結(jié)果顯示（圖4.)，當(dāng)效靶比為5:1時，四個培養(yǎng)體系的NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷 活性沒有顯著性差異；當(dāng)效靶比提高到10:1和20:1時，白藜蘆醇和絲膠蛋白聯(lián)用組的NK的 體外殺傷活性顯著高于其他組。
[0099]實施例5.白藜蘆醇和絲膠蛋白對NK體外迀移能力的影響 [0100]利用TransWell法檢測了四種不同培養(yǎng)體系中獲得的NK細(xì)胞在體外的迀移能力。 TransWe 11培養(yǎng)系統(tǒng)（0·5μπι孔徑）購自BD Bioscience公司；AIM-V培養(yǎng)基購自Life Technology公司。參考文獻(xiàn)Cancer Res 2008;68: (14)中報道的方法進行成熟DC的制備，并 收集成熟DC細(xì)胞的培養(yǎng)上清，凍存于-80度。
[0101] 分別從不同培養(yǎng)體系中收獲NK細(xì)胞，并進行計數(shù)。將細(xì)胞重懸于AM-V無血清培養(yǎng) 基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5xl05細(xì)胞/ml，同時使用未處理的PBMC作為對照。向TransWell培養(yǎng)體 系下腔室加入500μ1凍存的成熟DC培養(yǎng)上清，空白組加入500μ1空白A頂-V培養(yǎng)基作為對照。 四組來源不同的NK細(xì)胞，按照5χ10 5細(xì)胞/孔接種于TransWell上腔內(nèi)，接種體積為200μ1。靜 止培養(yǎng)90分鐘后，收集下腔室中的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基樣品加入⑶56-ΡΕ和⑶3-FITC抗體后，用 流式細(xì)胞儀進行分析，檢測發(fā)生迀移的NK細(xì)胞。
[0102] NK細(xì)胞迀移率=[實驗組NK細(xì)胞數(shù)-PBMC組細(xì)胞數(shù)/對照組NK細(xì)胞數(shù)-PBMC組細(xì)胞 數(shù)]xlOO%
[0103] 實驗結(jié)果表明，單獨使用白藜蘆醇或絲膠蛋白進行培養(yǎng)的NK，其體外迀移能力比 對照組略強，但是沒有顯著性差異；而白藜蘆醇和絲膠蛋白聯(lián)用擴增的NK細(xì)胞，其體外的 迀移能力比對照組或者單獨使用上述兩種添加物培養(yǎng)獲得的NK細(xì)胞顯著提高。
[0104] 實施例6.白藜蘆醇和絲膠蛋白對NK細(xì)胞內(nèi)體歸巢能力的影響
[0105]利用N0D/SCID小鼠對四種不同培養(yǎng)體系中獲得的NK細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢能力進行 評價及比較。NOD-SCID小鼠分為五組(表3.)，每組10只，在注射NK細(xì)胞前，進行350RAD劑量 輻照處理。將四種培養(yǎng)體系中培養(yǎng)14天的NK細(xì)胞收獲，用細(xì)胞保存液(北京東方華輝生物醫(yī) 藥科技有限公司，Cat.No.41611)進行重懸并計數(shù)。細(xì)胞通過尾靜脈注射方式給予小鼠，注 射的細(xì)胞數(shù)為2xl0 7,陰性對照組給予等體積的生理鹽水。
[0106] 表3.動物實驗分組
[0108] 注射后4天，處死小鼠，分離骨髓和脾臟的總白細(xì)胞。總白細(xì)胞經(jīng)計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞 數(shù)為106細(xì)胞/ml。每份樣品取5~10x106細(xì)胞，用偶聯(lián)了抗人⑶45，CD56的磁珠進行分選并 計數(shù)，統(tǒng)計NK細(xì)胞向小鼠脾臟和骨髓中的歸巢能力。實驗分析數(shù)據(jù)顯示（圖6.)，單獨使用白 藜蘆醇或者絲膠蛋白進行NK培養(yǎng)時，NK細(xì)胞體內(nèi)向骨髓和脾臟的歸巢能力較對照組有所提 高，但是與對照組相比差異部不顯著；而當(dāng)白藜蘆醇與絲膠蛋白聯(lián)用進行NK體外培養(yǎng)時，所 獲得的NK細(xì)胞在體內(nèi)的歸巢能力與其他實驗組相比具有顯著的提高。
[0109] 實施例7.白藜蘆醇和絲膠蛋白聯(lián)用增強NK細(xì)胞對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的抑制抵抗 作用
[0110] 采用體外共培養(yǎng)法檢測使用本發(fā)明涉及培養(yǎng)體系獲得的NK細(xì)胞與對照組培養(yǎng)體 系獲得的NK細(xì)胞在Treg存在下對靶細(xì)胞K562和實體瘤腫瘤細(xì)胞株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299 的殺傷能力（實驗分組見表4·)。實驗方法參考文獻(xiàn)（Mark J.Smyth et al J. Immunol. 2006:176)大致如下：
[0111] 使用 anti-CD52-PE，anti-CD4-FITC，anti-TCRβ-APC單克隆抗體（均購自BD Pharmingen公司）的磁珠，用FACSAria從健康志愿者外周血中分離調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。分離后的 細(xì)胞取樣進行流式分析，檢測細(xì)胞表面標(biāo)志分子為TCRi3+/CD4+/CD52+細(xì)胞亞群，保證其純 度大于97%。收集活化的Treg細(xì)胞，用X-VIV015無血清培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為105細(xì) 胞/ml。
[0112] 收集來自不同培養(yǎng)體系的NK細(xì)胞，350g離心10分鐘，重懸于20ml含X-VIV015無血 清培養(yǎng)基中并進行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為105細(xì)胞/ml。將上述NK與Treg兩種細(xì)胞以1:1進行混 合，再與K562細(xì)胞系進行共培養(yǎng)，利用CFSE法檢測效靶殺傷能力。
[0113] 表4.實驗分組
[0115]通過檢測結(jié)果顯示，使用本發(fā)明涉及的培養(yǎng)體系獲得的NK與其他實驗組使用的培 養(yǎng)體系得到的NK相比，其可以顯著的抵抗Treg對效靶殺傷的抑制作用；而對于其他培養(yǎng)體 系獲得的NK細(xì)胞而言，Treg的存在顯著降低了其對靶細(xì)胞的殺傷能力。（圖7.)。
【主權(quán)項】
1. 一種含有白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物，其特征在于，兩者在培養(yǎng) 體系中的終濃度如下： 白藜蘆醇 1μΜ-100μΜ 蠶絲絲膠蛋白 lμg/ml-100μg/ml。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，兩者在培養(yǎng)體系中的終濃度如下： 白藜蘆醇 1μΜ-50μΜ 蠶絲絲膠蛋白 lμg/ml_50μg/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，兩者在培養(yǎng)體系中的終濃度如下： 白藜蘆醇 5μΜ 蠶絲絲膠蛋白 20μg/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，其中還含有培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)，其 與白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白混合在一起構(gòu)成權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)基組合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，其中所述的培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)選自 植物細(xì)胞，動物細(xì)胞，真菌和細(xì)菌，人的組織細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞，重組的細(xì)胞的培養(yǎng)基。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，其中所述的培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)是 SCGM培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征在于，所述方法包括將白藜蘆醇和 蠶絲絲膠蛋白分別或一起配制成液體儲備液，使用時，和培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)混合。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，將白藜蘆醇和蠶絲絲膠蛋白分別配制 成液體儲備液，冷凍保存，使用時，和培養(yǎng)細(xì)胞用的其他物質(zhì)按照適當(dāng)?shù)谋壤旌霞纯伞?. 一種體外NK細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求1所述的組合物 在體外培養(yǎng)NK細(xì)胞。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的體外NK細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟如下：分離TOMC，接 種于含有權(quán)利要求1所述的組合物的培養(yǎng)體系中，使用0KT-3，和IL-2刺激細(xì)胞3-5天，之后 每2-3天補加 IL-2,總培養(yǎng)周期為14-21天，至培養(yǎng)結(jié)束，其中PBMC細(xì)胞的初始接種密度為1 X106/ml-5X106/ml〇
【文檔編號】C12N15/00GK105861484SQ201610391352
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】趙宇, 胡楊, 劉彩云, 李帥民, 王敏, 賈樂偉
【申請人】北京時合生物科技有限公司