一種納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種納米甲殼素?溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法：(1)將甲殼素溶于2.5?3M的HCl中，制備質(zhì)量體積濃度為30?35％的溶液；在95?105℃下劇烈攪拌1.5?6h進(jìn)行酸水解；酸水解后的懸濁液離心并水洗沉淀；水洗后的沉淀分散于水中再得懸濁液，并將得到的懸濁液置于透析袋中透析；透析后得到的樣品超聲2?5min，放置于?85～?75℃中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥得到納米甲殼素。(2)將納米甲殼素溶于磷酸緩沖液中，制成濃度為1.96×10?5?9.84×10?5M的溶液，超聲1?2min使其分散均勻；再加入溶菌酶，使溶液中溶菌酶的濃度為0.3?0.8mg/mL，200?500rpm攪拌2?4h，形成納米甲殼素?溶菌酶復(fù)合顆粒。該復(fù)合顆粒大大提高了溶菌酶的活性，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抑菌效果。
【專利說明】
一種納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品醫(yī)藥酶活提高領(lǐng)域，具體涉及一種納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 日常生活中，食物經(jīng)常會(huì)腐敗、變質(zhì)，誤食后會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，嚴(yán)重威脅 人們的健康。引起食物腐敗變質(zhì)原因較多，有物理因素、化學(xué)因素和生物性因素，其中由微 生物污染所引起的食物腐敗是最為重要和普遍的。鑒于常規(guī)化學(xué)防腐劑的毒副作用，開發(fā) 一種安全、高效的食品防腐劑具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0003] 溶菌酶本身是一種天然蛋白質(zhì)，無毒副作用，被認(rèn)為是一種很安全的食品添加劑。 它是專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，因其具有溶菌作用，可作為天然安全無毒的生物 保鮮劑。溶菌酶對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒都具有一定的殺傷和抑制作用，在一定程度上能夠阻止 或延緩食物變質(zhì)，延長(zhǎng)食物貨架期。目前已被很多國(guó)家和組織(美國(guó)、日本、FA0/WH0及中國(guó)） 批準(zhǔn)作為食品防腐劑和保鮮劑使用。
[0004] 溶菌酶作為一種天然的蛋白，還具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健功能，在嬰兒奶粉中添加適 量的溶菌酶，可使牛乳乳化。這種強(qiáng)化奶粉具有殺死腸道內(nèi)腐敗球菌、維持腸道內(nèi)菌群正常 化、促進(jìn)雙歧桿菌定植、增殖等功能，所以能增強(qiáng)嬰幼兒的抗感染能力，有助于嬰幼兒的健 康成長(zhǎng)。同時(shí)還可添加到牙膏中，它可以抑制菌斑和牙石的形成，有助于預(yù)防青少年齲齒的 發(fā)生。溶菌酶還具有藥理作用，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)藥，可增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)止血、凝 血、抗菌消炎等。
[0005] 蛋清溶菌酶的溶菌作用特異性很強(qiáng)，只對(duì)特定的微生物有充分的溶解作用，通常 對(duì)革蘭氏陽性菌作用效果顯著，但對(duì)革蘭氏陰性菌無效或者效果很差。同時(shí)，由于溶菌酶與 其他常用的化學(xué)防腐劑相比價(jià)格較高，目前國(guó)內(nèi)作為食品防腐劑使用還較少。為了改變這 種局限性，研究一種新的提高溶菌酶活性的方法，實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，拓寬其在食品行業(yè)中的應(yīng)用 具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有的溶菌酶存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種提高溶菌酶活性的方 法，利用納米甲殼素吸附溶菌酶，制備納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒，以提高溶菌酶活性并 且發(fā)揮其對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，具體包括如下步驟：
[0009] (1)納米甲殼素的制備
[0010] 將甲殼素溶于2.5-3M的HCl中，制備質(zhì)量體積濃度為30-35%的溶液；在95-105°C 下劇烈攪拌1.5-6h進(jìn)行酸水解;酸水解后的懸濁液離心并水洗沉淀;水洗后的沉淀分散于 水中再得懸濁液，并將得到的懸濁液置于透析袋中透析;透析后得到的樣品超聲2_5min，放 置于-85~-75°C中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥得到納米甲殼素。
[0011] (2)納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備
[0012] 將納米甲殼素溶于磷酸緩沖液中，制成濃度為1.96 X 10-5-9.84 X 10-5M的溶液，超 聲l-2min使其分散均勻；再加入溶菌酶，使溶液中溶菌酶的濃度為0.3-0.8mg/mL，200-500rpm攪拌2-4h，形成納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒。
[0013] 進(jìn)一步的，步驟(1)中懸濁液離心的離心力為3000-5000g，時(shí)間2-3min。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟(1)中懸濁液水洗5-10次。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟（1)中透析袋置于去離子水中進(jìn)行透析，將懸濁液中的小分子透析 出來，透析時(shí)間為1-2天，每l_3h換一次水，透析袋的截留分子量為10000-12000。
[0016] 進(jìn)一步的，步驟（1)中超聲后樣品先冷凍，再凍干，先冷凍的目的是保持樣品原有 的形貌特性，真空冷凍干燥的真空度5-15Pa、溫度-85~-75 °C、時(shí)間24-72h。
[0017] 進(jìn)一步的，步驟⑵中磷酸緩沖液的pH值為6.0-6.5，濃度為10-20mM。
[0018] 進(jìn)一步的，步驟(1)、（2)中超聲功率為20KHz。
[0019] 本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供以上述方法制備得到的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆 粒。
[0020] 本發(fā)明的有益結(jié)果為：
[0021] (1)本發(fā)明采用納米吸附制備方法，即甲殼素酸解制成納米顆粒，在最適pH值下納 米顆粒吸附溶菌酶，提高溶菌酶的活性。
[0022] (2)本發(fā)明中制備納米甲殼素的工藝，通過采用酸水解、透析的方法制備納米甲殼 素，此方法制備的納米甲殼素產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好、分布均勻。
[0023] (3)本發(fā)明中制備納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的方法，通過采用穩(wěn)定性好、分布 均勻的納米甲殼素吸附溶菌酶，縮短酶與底物結(jié)合的路徑，增加酶與底物反應(yīng)的速率，從而 提高溶菌酶的活性。
[0024] (4)本發(fā)明中制備納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的方法簡(jiǎn)單，易操作，成本較低，適 合大規(guī)模生產(chǎn)，大批量應(yīng)用于食品行業(yè)。
[0025] (5)本發(fā)明中制備的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性 菌均有良好的抑菌效果。
【附圖說明】
[0026] 圖1為實(shí)施例1-5吸附在納米甲殼素上的溶菌酶相對(duì)酶活圖譜。
[0027] 圖2為實(shí)施例1納米甲殼素吸附溶菌酶的透射電鏡圖。
[0028]圖3為實(shí)施例1-5納米甲殼素與溶菌酶相互作用的紫外圖。
[0029]圖4為實(shí)施例1-5納米甲殼素與溶菌酶相互作用的熒光圖譜。
[0030]圖5為實(shí)施例1-5納米甲殼素與溶菌酶相互作用的同步熒光圖譜（Δλ=15ηπι)。
[0031] 圖6為實(shí)施例1-5納米甲殼素與溶菌酶相互作用的同步熒光圖譜（Δλ = 60ηπι)。
[0032] 圖7為實(shí)施例1-5納米甲殼素與溶菌酶相互作用的紅外光譜。
[0033]圖8為實(shí)施例1-5納米甲殼素與溶菌酶相互作用的Stern-Vo Imer淬滅圖譜。
[0034] 圖9為實(shí)施例1-5復(fù)合顆粒中溶菌酶的抑菌圖譜(大腸桿菌）。
[0035] 圖10為實(shí)施例1 -5復(fù)合顆粒中溶菌酶的抑菌圖譜(金黃色葡糖球菌）。
[0036] 圖11為實(shí)施例1-5復(fù)合顆粒中溶菌酶的抑菌圖譜(枯草芽孢桿菌）。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] (1)納米甲殼素的制備
[0040] 將5g甲殼素溶于150mL 3M的HCl中；在100°C下劇烈攪拌2h進(jìn)行酸水解;酸水解后 的懸濁液3000g離心2min，水洗沉淀5次;水洗后的沉淀分散于水中再得懸濁液，并將得到的 懸濁液置于透析袋中透析2天，每2h換一次水;透析后得到的樣品20KHz超聲3min，放置于-80 °C中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥(真空度IOPa、溫度-80 °C、時(shí)間48h)得到納米甲殼素。 [0041] (2)納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備
[0042] 將4mg納米甲殼素溶于pH6.2的20mM磷酸緩沖液中，制成濃度為1.96 X 10-5M的溶 液，20KHz超聲Imin使其分散均勾;再加入40mg溶菌酶，500rpm攪拌4h，形成納米甲殼素-溶 菌酶復(fù)合顆粒。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] (1)納米甲殼素的制備
[0045] 將4.5g甲殼素溶于150mL 3M的HCl中；在103°C下劇烈攪拌3h進(jìn)行酸水解;酸水解 后的懸濁液5000g離心lmin，水洗沉淀6次;水洗后的沉淀分散于水中再得懸濁液，并將得到 的懸池液置于透析袋中透析1.5天，每Ih換一次水;透析后得到的樣品20KHz超聲3min，放置 于-78°C中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥(真空度5Pa、溫度-78°C、時(shí)間30h)得到納米甲殼素。
[0046] (2)納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備
[0047] 將8mg納米甲殼素溶于pH6.5的IOmM磷酸緩沖液中，制成濃度為3.93 X 10-5M的溶 液，20KHz超聲2min使其分散均勻;再加入50mg溶菌酶，400rpm攪拌4h，形成納米甲殼素-溶 菌酶復(fù)合顆粒。
[0048] 實(shí)施例3
[0049] (1)納米甲殼素的制備
[0050] 將5.2g甲殼素溶于150mL 3M的HCl中；在98°C下劇烈攪拌5h進(jìn)行酸水解;酸水解后 的懸濁液4000g離心2min，水洗沉淀8次;水洗后的沉淀分散于水中再得懸濁液，并將得到的 懸濁液置于透析袋中透析1天，每Ih換一次水;透析后得到的樣品20KHz超聲3min，放置于-85 °C中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥(真空度15Pa、溫度-85 °C、時(shí)間72h)得到納米甲殼素。
[0051] (2)納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備
[0052] 將12mg納米甲殼素溶于pH6.3的15mM磷酸緩沖液中，制成濃度為5.90 X 10-5M的溶 液，20KHz超聲Imin使其分散均勻;再加入60mg溶菌酶，500rpm攪拌2h，形成納米甲殼素-溶 菌酶復(fù)合顆粒。
[0053] 實(shí)施例4
[0054] (1)納米甲殼素的制備
[0055] 將5g甲殼素溶于150mL 2.5M的HCl中；在95°C下劇烈攪拌1.5h進(jìn)行酸水解;酸水解 后的懸濁液4000g離心2min，水洗沉淀10次；水洗后的沉淀分散于水中再得懸濁液，并將得 到的懸濁液置于透析袋中透析1.5天，每2h換一次水;透析后得到的樣品20KHz超聲3min，放 置于-80°C中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥(真空度lOPa、溫度-80°C、時(shí)間24h)得到納米甲殼 素。
[0056] (2)納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備
[0057] 將16mg納米甲殼素溶于pH6.3的IOmM磷酸緩沖液中，制成濃度為7.87 X 10-5M的溶 液，20KHz超聲Imin使其分散均勾;再加入80mg溶菌酶，500rpm攪拌4h，形成納米甲殼素-溶 菌酶復(fù)合顆粒。
[0058] 實(shí)施例5
[0059] (1)納米甲殼素的制備
[0060] 將4.5g甲殼素溶于150mL 3M的HCl中；在100°C下劇烈攪拌6h進(jìn)行酸水解;酸水解 后的懸濁液3000g離心3min，水洗沉淀5次;水洗后的沉淀分散于水中再得懸濁液，并將得到 的懸濁液置于透析袋中透析2天，每3h換一次水;透析后得到的樣品20KHz超聲3min，放置 于-75°C中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥(真空度5Pa、溫度-75°C、時(shí)間60h)得到納米甲殼素。 [0061] (2)納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備
[0062] 將2〇11^納米甲殼素溶于?!16.4的2〇11^磷酸緩沖液中，制成濃度為9.84\10- 51的溶 液，20KHz超聲2min使其分散均勻;再加入30mg溶菌酶，400rpm攪拌3h，形成納米甲殼素-溶 菌酶復(fù)合顆粒。
[0063] 對(duì)實(shí)施例1-5制得的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒進(jìn)行性能測(cè)定：
[0064] 1.納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的相對(duì)酶活
[0065] 酶活的測(cè)定參照Yang等(2008)的方法。取1 · 5mL的溶壁微球菌溶液(0 · 25mg/mL)加 到lcm的比色皿中，再加入IOOyL的溶菌酶或溶菌酶-納米甲殼素復(fù)合物，測(cè)定450nm時(shí)吸光 度的變化。
[0066] 相對(duì)酶活=IWX/Kfree X 100%
[0067] 其中Kfree是純?nèi)芫傅钠鹗夹甭?，Kmix是溶菌酶-納米甲殼素復(fù)合物的斜率。
[0068] 如圖1所示，未添加納米甲殼素的溶菌酶活性為100%，添加4mg的納米甲殼素溶菌 酶的相對(duì)酶活為120%，隨著納米甲殼素添加量增加，溶菌酶的相對(duì)酶活增加，當(dāng)納米甲殼 素的添加量為20mg時(shí)，酶活達(dá)到最大值254%。與對(duì)照相比，添加納米甲殼素的溶菌酶酶活 顯著增加。
[0069] 2.納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的形態(tài)及大小
[0070] 如圖2所示的為納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的透射電子顯微鏡圖，可見，納米甲 殼素呈紡錘狀，長(zhǎng)為100_500nm，寬為5-50nm左右，表面光滑，大小均勻。由圖可以看出，吸附 溶菌酶后，納米甲殼素粒徑?jīng)]有發(fā)生變化，但表面上出現(xiàn)一些3-9nm的圓形球體，證明溶菌 酶已成功吸附到納米甲殼素上。
[0071] 3.溶菌酶與納米甲殼素相互作用
[0072] 3.1紫外圖譜分析
[0073]如圖3所示，與原溶菌酶紫外圖相比，添加納米甲殼素的溶菌酶的峰出現(xiàn)了移動(dòng)， 且強(qiáng)度降低。隨著納米甲殼素的添加，吸收峰逐漸向高波長(zhǎng)移動(dòng)，添加20mg時(shí)，吸收峰紅移 了 3nm，這是因?yàn)楫?dāng)體系中納米甲殼素濃度逐漸增大時(shí)，納米甲殼素會(huì)有道溶菌酶分子中的 蛋白肽鏈伸展，使溶菌酶內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的疏水集團(tuán)裸露出來，從而使溶菌酶 吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，這表明納米甲殼素和溶菌酶發(fā)生了反應(yīng)。
[0074] 3.2熒光圖譜分析
[0075] 如圖4所示，激發(fā)波為295nm時(shí)，原溶菌酶在336nm處有最大吸收峰，隨著體系中納 米甲殼素濃度逐漸增加，峰強(qiáng)逐漸降低，并出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象。當(dāng)添加16mg納米甲殼素時(shí)，溶菌 酶的最大吸收波長(zhǎng)從336nm移動(dòng)到334nm，表明體系中加入納米甲殼素引起了溶菌酶的內(nèi)源 熒光的淬滅，說明二者在混合的過程發(fā)生了相互作用形成納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合物。
[0076] 3.3同步熒光圖譜分析
[0077] 如圖5所示，Δλ = λΘΠ ι -Aex = 15nm時(shí)的熒光顯示蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基熒光，隨著 體系中納米甲殼素濃度逐漸增加，峰強(qiáng)逐漸降低，但峰的位置并未發(fā)生移動(dòng)。如圖6所示，Δ λ = Aem-Aex = 60nm時(shí)的同步焚光光譜只顯示蛋白質(zhì)色氨酸殘基焚光，隨著體系中納米甲 殼素濃度逐漸增加，峰強(qiáng)逐漸降低，熒光峰的位置發(fā)生了略微的藍(lán)移，從276nm移動(dòng)到 275nm，表明色氨酸所處的微環(huán)境發(fā)生改變，說明二者在混合的過程發(fā)生了相互作用形成納 米甲殼素-溶菌酶復(fù)合物。
[0078] 3.4紅外光譜分析
[0079] 如圖7所示，溶菌酶在1241CHT1處的吸收峰是C-O的振動(dòng)峰，1551CHT1是N-H鍵彎曲 振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。納米甲殼素和溶菌酶相互作用后，1241CHT1處的吸收峰向右移動(dòng)，N-H鍵 在1551CHT 1的彎曲振動(dòng)峰向低波長(zhǎng)移動(dòng)，表明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變，說明加入納米甲殼 素后，溶菌酶與其發(fā)生了相互作用。
[0080] 4.溶菌酶與納米甲殼素結(jié)合方式和結(jié)合位點(diǎn)
[00811 如圖8所示，溶菌酶和納米甲殼素相互作用的淬滅Stern-Volmer曲線中F0/F(y)與 [QKx)之間存在良好的線性關(guān)系，生物大分子的熒光壽命一般為l0_8s，因此淬滅速率常數(shù) Kq為5.78 X IollLmor1iT1，其數(shù)值大于淬滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù) 約為2.OX 101()，所以可以推測(cè)納米甲殼素和溶菌酶結(jié)合方式為靜態(tài)淬滅。
[0082]根據(jù)l〇g[(F0-F)/F]與log[CHNC]的線性關(guān)系，計(jì)算出結(jié)合位點(diǎn)為1.03,結(jié)合常數(shù) 為3.29 X IO3Lmor1，如表 1所示。
[0083]表1為本發(fā)明中納米甲殼素與溶菌酶相互作用的結(jié)合參數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)表。(Ka代表 的是結(jié)合常數(shù)，η代表的是結(jié)合位點(diǎn)）
[0085] 5.抑菌圖譜
[0086]如圖9所示，溶菌酶對(duì)大腸桿菌(革蘭氏陰性菌）的抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)。 隨著體系中納米甲殼素濃度逐漸增加，溶菌酶對(duì)大腸桿菌的抑制率逐漸上升，表明納米甲 殼素可以增強(qiáng)溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制率。
[0087] 如圖10所示，溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌）的抑制率先上升后平穩(wěn)。 隨著體系中納米甲殼素濃度逐漸增加，溶菌酶對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率逐漸上升，表明納 米甲殼素可以增強(qiáng)溶菌酶對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制率。
[0088] 如圖11所示，溶菌酶對(duì)枯草芽孢桿菌(革蘭氏陽性菌）的抑制率先上升后平穩(wěn)。隨 著體系中納米甲殼素濃度逐漸增加，溶菌酶對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率逐漸上升，表明納米 甲殼素可以增強(qiáng)溶菌酶對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，具體包括如下步驟： (1) 納米甲殼素的制備 將甲殼素溶于2.5-3M的HC1中，制備質(zhì)量體積濃度為30-35 %的溶液;在95-105°C下劇 烈攪拌1.5-6h進(jìn)行酸水解;酸水解后的懸濁液離心并水洗沉淀;水洗后的沉淀分散于水中 再得懸濁液，并將得到的懸濁液置于透析袋中透析;透析后得到的樣品超聲2-5min，放置 于-85~-75°C中凍結(jié)，凍結(jié)后真空冷凍干燥得到納米甲殼素。 (2) 納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備 將納米甲殼素溶于磷酸緩沖液中，制成濃度為1.96 X 10夂9.84 X 10-5Μ的溶液，超聲1-2min使其分散均勻;再加入溶菌酶，使溶液中溶菌酶的濃度為0.3-0.8mg/mL，200-500rpm攪 拌2-4h，形成納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中懸池液離心的離心力為3000_5000g，時(shí)間2_3min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中懸濁液水洗5-10次。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中透析袋置于去離子水中進(jìn)行透析，將懸濁液中的小分子透析出來，透析時(shí)間為1-2天， 每l-3h換一次水，透析袋的截留分子量為10000-12000。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，其特征在于，步驟 (1) 中超聲后樣品先冷凍，再凍干，先冷凍的目的是保持樣品原有的形貌特性，真空冷凍干 燥的真空度5-15Pa、溫度-85~-75°C、時(shí)間24-72h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，其特征在于，步驟 (2) 中磷酸緩沖液的pH值為6.0-6.5，濃度為10-20mM。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒的制備方法，其特征在于，步驟 (1)、（2)中超聲功率為20KHz。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法制備的納米甲殼素-溶菌酶復(fù)合顆粒，其特征在 于，由權(quán)利要求1-7任一所述的方法制備而成。
【文檔編號(hào)】C12N9/36GK105861478SQ201610242360
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月19日
【發(fā)明人】孫慶杰, 熊柳, 姜?dú)q歲, 常然然, 葛勝菊, 楊潔
【申請(qǐng)人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)