一種綿羊nectin4基因的克隆方法及引物和nectin4基因的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種綿羊nectin4基因的克隆方法及引物和nectin4基因的應(yīng)用。本發(fā)明通過利用巢式PCR原理和PCR引物錯(cuò)配導(dǎo)致非特異反應(yīng)的特點(diǎn)，改變常規(guī)PCR反應(yīng)條件，將10對引物分為兩組，通過兩輪PCR即獲得大小片段相符的Nectin4基因。本方法較RACE等其他傳統(tǒng)技術(shù)有明顯優(yōu)勢，綿羊Nectin4基因的成功擴(kuò)增為后續(xù)對其在病毒入侵中的功能進(jìn)行研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種綿羊nect i n4基因的克隆方法及引物和nect i n4基因的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綿羊nectin4基因的克隆方法及引物和 nectin4基因的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小反會(huì)獸疫（Peste des petits ruminants，PPR)是由小反會(huì)獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起山羊、綿羊等小反會(huì)獸以及玲羊等野生小反會(huì)獸 的一種急性、熱性、接觸性傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率。嚴(yán)重爆發(fā)時(shí)其發(fā)病率和致 死率分別能達(dá)到100%和90%，如果伴發(fā)其他疾病如山羊痘，死亡率也可高達(dá)100%。
[0003] PPRV的基礎(chǔ)研究還薄弱，許多問題亟待解決，研究病毒與宿主受體的相互作用不 僅有助于我們對病毒入侵、復(fù)制以及宿主免疫的了解，同時(shí)也能為我們研發(fā)診斷試劑和疫 苗提供有益的理論參考。PPRV為副黏病毒科的成員，與同屬的麻疹病毒(Measles virus， MV)在病原學(xué)、致病機(jī)理方面有一定的相似之處，MV日益深入的研究無疑為我們提供了借 鑒。在病毒感染過程中，病毒與受體的結(jié)合是病毒入侵的第一步。目前，MV利用的3種受體已 被證實(shí)，分別為CD46、SLAM(Signaling lymphocyte activation molecule)和Nectin4/ PVRL4(poliovirus receptor-related 4)。其中，SLAM被認(rèn)為是麻疹病毒通用的受體，已被 證實(shí)為該屬犬痕熱病毒(canine distemper virus，Q)V)的一個(gè)受體;2008年，SLAM被證實(shí) 也是PPRV的受體之一，本實(shí)驗(yàn)室也對這一情況進(jìn)行了證實(shí)，證明SLAM在山羊體內(nèi)的表達(dá)與 PPRV在山羊體內(nèi)的組織分布情況基本一致，但在呼吸道、消化道等組織器官中的表達(dá)情況 明顯不符合。這些現(xiàn)象提示PPRV可能還有其他受體存在。MV的3種受體在各物種間具有較好 的保守性，因此推測PPRV與MV有著相同的蛋白受體。2011年，Noyce等和Muhlebach等同時(shí)報(bào) 道了MV的另一個(gè)受體Nectin4，該受體廣泛分布于呼吸道、消化道上皮細(xì)胞基底層，與MV組 織嗜性高度吻合。接著，Nect in4也被證實(shí)為⑶V的受體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種綿羊nectin4基因的克隆方法及引 物和nectin4基因的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種綿羊nectin4基因的克隆方法，包括首先，進(jìn)行綿羊肺 支氣管總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄，其次進(jìn)行綿羊Nectin4基因的擴(kuò)增，通過兩輪PCR即獲得 Nectin4基因的完整0RF。
[0006] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)包括：
[0007] 所述的一種綿羊nectin4基因的克隆方法，所用的引物有十對，具體如下：
[0009] 第一輪擴(kuò)增:首先使用上述引物中的前5對外圍引物，以合成的cDNA為模板，分管 進(jìn)行PCR擴(kuò)增;反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性lmin;94°C變性15s，60°C退火5s，72°C延伸90s，35個(gè) 循環(huán);72 °C終延伸IOmin;產(chǎn)物于1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳觀察，在2000bp并沒有特異性條帶 出現(xiàn)，對2000bp左右范圍的膠塊進(jìn)行回收，作為第二輪PCR的模板;第二輪擴(kuò)增:使用純化后 的PCR產(chǎn)物為模板，使用上述引物中的后5對內(nèi)圍引物分管進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?94°C 預(yù)變性lmin;94°C變性158,60°(：退火158,72°(：延伸9〇8,35個(gè)循環(huán);72°(：終延伸1〇1^11 ;產(chǎn)物 于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，得到前4個(gè)泳道在約1700bp處出現(xiàn)明顯條帶，將該4個(gè)泳道 目標(biāo)位置的條帶分別切膠回收，克隆至T載體。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了用于克隆綿羊nectin4基因的的引物，其包含十對引物，具體 如下：
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供了nectin4基因在用于制備治療小反芻獸疫藥物中的 應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明進(jìn)一步提供了按照上述方法制得的綿陽nectin4基因。
[0014]本發(fā)明通過利用巢式PCR原理和PCR引物錯(cuò)配導(dǎo)致非特異反應(yīng)的特點(diǎn)，改變常規(guī) PCR反應(yīng)條件，將10對引物分為兩組，通過兩輪PCR即獲得大小片段相符的Nectin4基因。本 方法較RACE等其他傳統(tǒng)技術(shù)有明顯優(yōu)勢，綿羊Nectin4基因的成功擴(kuò)增為后續(xù)對其在病毒 入侵中的功能進(jìn)行研究奠定了基礎(chǔ)。從本申請的結(jié)果來看，PPRV在山羊體內(nèi)的組織分布情 況與Nectin4在動(dòng)物體內(nèi)的分布也基本一致。因此，推測Nect in4極有可能也是PPRV的另一 個(gè)受體，為了證實(shí)其是否為PPRV的受體，我們克隆表達(dá)了綿羊Nectin4基因，并將其亞克隆 至真核表達(dá)載體PCMV-Myc中，對其功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，為后續(xù)進(jìn)行病毒與宿主相互作用 研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0016] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)該理解為對本發(fā)明的限制，對本發(fā) 明方法、步驟或者條件的修改或者替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0017] 實(shí)施例！
[0018]引物設(shè)計(jì)
[0019] 使用在線引物設(shè)計(jì)軟件 "Primer3Plus"（http: //www · primer3plus · com/cgi-bin/ dev/primer3plus. cgi)，設(shè)計(jì) 10對引物(見下表）。
[0020] 表1 Nectin4基因的PCR引物 L〇〇23J 實(shí)施例2
[0024] 綿羊Nectin4基因的擴(kuò)增
[0025]第一輪擴(kuò)增：首先使用表1中的前5對外圍引物，以合成的cDNA為模板，分管進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性lmin;94°C變性158,60°(：退火58,72°(：延伸9〇8,35個(gè)循 環(huán);72 °C終延伸IOmin。產(chǎn)物于1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳觀察，在2000bp并沒有特異性條帶出 現(xiàn)，PCR產(chǎn)物只是彌散在整個(gè)泳道。對2000bp左右范圍的膠塊進(jìn)行回收，作為第二輪PCR的模 板。
[0026]第二輪擴(kuò)增:使用純化后的PCR產(chǎn)物為模板，使用表1中的后5對內(nèi)圍引物分管進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性111^11;94°(：變性158,60°(：退火158,72°(：延伸9〇8,35個(gè)循 環(huán);72°C終延伸IOmin。產(chǎn)物于1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳觀察，前4個(gè)泳道在約1700bp處出現(xiàn) 明顯條帶。將4個(gè)泳道目標(biāo)位置的條帶（1700bp左右處)分別切膠回收，克隆至T載體，并送交 公司測序鑒定。
[0027] 實(shí)施例3
[0028] 真核重組表達(dá)載體pCMV-Myc_Nectin4的構(gòu)建與鑒定
[0029] 將測序正確的基因重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Sa11和Kpn I將目的基因克隆至pCMV- Myc載體。構(gòu)建好的載體經(jīng)雙酶切鑒定，在1530bp左右出現(xiàn)特異條帶，證明插入片段與理論 值相符。測序結(jié)果也證實(shí)，Nectin4基因已成功克隆入pCMV-Myc載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。獲 得的重組質(zhì)粒命名為pCMV-Myc-Nectin4。
[0030] 實(shí)施例4
[0031] Nectin4基因表達(dá)的間接免疫熒光檢測
[0032] 重組質(zhì)粒pCMV-Myc_Nectin4轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，30h后經(jīng)間接免疫熒光檢測，可清晰觀 察到轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細(xì)胞出現(xiàn)大量特異性紅色熒光，而轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照和空細(xì) 胞對照均未出現(xiàn)熒光，顯示目的基因在CHO細(xì)胞中得到了高效表達(dá)。
[0033] 實(shí)施例5
[0034] Nectin4 蛋白的 Western-blot 鑒定
[0035] 收集重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nectin4轉(zhuǎn)染30h后CHO細(xì)胞，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，Western-blot鑒定結(jié)果顯示，在55kDa處出現(xiàn)一特異性條帶，與預(yù)期大小一致。從而證 明已成功獲得了有活性的綿羊Nectin4基因。
[0036]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變 化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種綿羊nectin4基因的克隆方法，其特征在于，包括首先，進(jìn)行綿羊肺支氣管總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄，其次進(jìn)行綿羊Nectin4基因的擴(kuò)增，通過兩輪PCR即獲得Nectin4基因的完 整 ORF。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種綿羊nectin4基因的克隆方法，其特征在于，所用的引物 有十對，具體如下：第一輪擴(kuò)增：首先使用上述引物中的前5對外圍引物，以合成的cDNA為模板，分管進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性lmin;94°C變性158,60°(：退火58,72°(：延伸9〇8,35個(gè)循 環(huán);72°C終延伸lOmin;產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，在2000bp并沒有特異性條帶出 現(xiàn)，對2000bp左右范圍的膠塊進(jìn)行回收，作為第二輪PCR的模板;第二輪擴(kuò)增:使用純化后的 PCR產(chǎn)物為模板，使用上述引物中的后5對內(nèi)圍引物分管進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù) 變性lmin;94°C變性158,60°(：退火158,72°(：延伸9〇8,35個(gè)循環(huán) ;72°(：終延伸1〇111丨11;產(chǎn)物于 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，得到前4個(gè)泳道在約1700bp處出現(xiàn)明顯條帶，將該4個(gè)泳道目 標(biāo)位置的條帶分別切膠回收，克隆至T載體。3. 用于克隆綿羊nectin4基因的的引物，其特征在于，包含十對引物，具體如下：￡> 4. nectin4基因在用于制備治療小反芻獸疫藥物中的應(yīng)用。5. 綿陽nectin4基因，其特征在于，按照權(quán)利要求1或2的方法制得。
【文檔編號】C12N15/11GK105861490SQ201610246272
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月19日
【發(fā)明人】王秋霞, 歐長波, 陳蕾, 才學(xué)鵬, 竇永喜, 余燕, 姜金慶, 張艷紅, 劉興友
【申請人】河南科技學(xué)院