游離dna提取試劑盒及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種游離DNA提取試劑盒，所述試劑盒包含裂解液、洗滌液A、洗滌液B、去抑制劑、磁珠和洗脫液；其中，洗滌液B中醇的濃度可以低于1％，甚至完全不含醇、不含表面活性劑。本發(fā)明還提供與所述試劑盒配套使用的，或包含或整合了所述試劑盒的全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)。本發(fā)明的試劑盒特別適合于短片段DNA，例如血漿游離DNA的提取，并且不會(huì)負(fù)面影響后續(xù)的PCR反應(yīng)，具有使用安全、簡(jiǎn)便、快捷、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
游離DNA提取試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及遺傳物質(zhì)的提取領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于游離DNA提取的試劑 盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 游離DNA又稱(chēng)循環(huán)DNA(circulating nucleic acid)，是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞外 的內(nèi)源性DNA，可以單鏈或雙鏈DNA的形式存在，大多數(shù)游離DNA是以核蛋白形式存在的雙鏈 DNA。游離DNA片段較小，長(zhǎng)度一般在幾十到幾百個(gè)bp之間。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，人循環(huán)血中 游離DNA含有非常重要的遺傳信息，利用游離DNA高通量測(cè)序技術(shù)可以有效的進(jìn)行產(chǎn)前篩查 和腫瘤等疾病的相關(guān)檢測(cè)，比如唐氏綜合癥孕中期篩查，傳統(tǒng)方法一般需要取羊水進(jìn)行檢 測(cè)，存在一定的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，而使用游離DNA高通量測(cè)序技術(shù)，不僅準(zhǔn)確率更高，而且僅需采集 孕婦靜脈血就可以直接進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查，意義重大。
[0003] 利用游離DNA進(jìn)行的產(chǎn)前篩查或腫瘤檢測(cè)，首先要進(jìn)行游離DNA的提取純化，這一 步是最為重要，也是最基本的步驟，提取產(chǎn)物的質(zhì)量直接影響到后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和 可靠性。由于游離DNA片段較小，在血漿中含量低，因此，游離DNA的提取試劑與普通的核酸 提取試劑相比，需要有更高的提取效率，如果要滿(mǎn)足大規(guī)模的篩查檢測(cè)需要，游離DNA提取 試劑還需要滿(mǎn)足操作簡(jiǎn)單、成本低、能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化等要求。
[0004] 目前用于血漿游離DNA提取純化的方法主要有酚氯仿法、柱提取法和磁珠法，其中 酚氯仿法需要在核酸提取過(guò)程中使用對(duì)人體有害的有機(jī)溶劑，越來(lái)越難以被檢驗(yàn)人員接 受，而且該方法操作復(fù)雜，對(duì)于游離DNA來(lái)說(shuō)提取效率較低，需要加大樣本量來(lái)滿(mǎn)足后續(xù)檢 測(cè)需求，同時(shí)在提取過(guò)程中需要進(jìn)行高速離心操作，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。柱提取法是目前主要 使用的方法，該方法不需要使用毒性較大的有機(jī)溶劑，操作方法較酚氯仿法稍簡(jiǎn)單，但操作 過(guò)程中仍然需要進(jìn)行高速離心，同時(shí)提取效率較低，需要加大樣本量來(lái)滿(mǎn)足后續(xù)檢測(cè)的需 求，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。磁珠法近幾年才開(kāi)始應(yīng)用于DNA的提取，該方法最大的特點(diǎn)是提取過(guò) 程不需要進(jìn)行高速離心，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0005] 然而，以上這些產(chǎn)品很少是針對(duì)血漿游離DNA的特性而專(zhuān)門(mén)為游離DNA設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā) 的。這些產(chǎn)品不僅提取效率不高，而且操作步驟繁瑣，大部分需要進(jìn)行多次洗滌(3-4次）。更 重要的是，現(xiàn)有的DNA提取產(chǎn)品中的洗滌液均含有高濃度的醇，而高濃度的醇對(duì)后續(xù)的PCR 反應(yīng)有抑制作用。此外，作為揮發(fā)性溶劑，醇對(duì)自動(dòng)化儀器有不利影響，并且具備易燃性，從 而帶來(lái)安全隱患。因此，采用現(xiàn)有的DNA提取產(chǎn)品，需要在提取后放置較長(zhǎng)時(shí)間，讓醇完全揮 發(fā)后才能進(jìn)行后續(xù)測(cè)試，否則會(huì)直接影響后續(xù)測(cè)試結(jié)果。
[0006] 目前無(wú)論是采用哪種提取方法，在實(shí)際應(yīng)用中，主要還是以手工柱提取游離DNA為 主，該方法手工操作不僅工作量大，而且提取效果容易受人為因素影響，無(wú)法滿(mǎn)足大規(guī)模， 高通量、高質(zhì)量的檢測(cè)需求。提取DNA的自動(dòng)化系統(tǒng)雖然也可用于游離DNA的提取，但是設(shè)備 都比較大，運(yùn)行成本高，且沒(méi)有完全配套的游離DNA提取試劑盒，提取效率較低，達(dá)不到理想 的效果。
[0007] 自動(dòng)核酸提取平臺(tái)目前市場(chǎng)上已有不少，如:Roche、Chiron、Abbott、Gen_probe、 Biomerieux等公司研發(fā)的分子診斷產(chǎn)品都有相關(guān)的全自動(dòng)核酸提取平臺(tái)。但這些平臺(tái)都主 要以提取病毒、基因組或其它長(zhǎng)片段核酸為主，并未針對(duì)短片段的游離DNA進(jìn)行過(guò)優(yōu)化，也 少有配套使用的專(zhuān)門(mén)的游離DNA提取試劑盒。這些平臺(tái)也存在體積較大，構(gòu)造復(fù)雜，設(shè)備價(jià) 格高，每次運(yùn)行的成本高等缺點(diǎn)，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)有用戶(hù)對(duì)自動(dòng)化處理游離DNA的需求。
[0008] 因此，本領(lǐng)域急需可以應(yīng)用于游離DNA提取的試劑盒以及配套使用該試劑盒的提 取系統(tǒng)，這些試劑盒應(yīng)該具備操作簡(jiǎn)單、快捷、安全，結(jié)果準(zhǔn)確以及成本合理等優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種游離DNA提取試劑盒以及配套使用該試劑盒的提取系 統(tǒng)，從而能簡(jiǎn)單、快捷、安全、準(zhǔn)確地檢測(cè)游離DNA，尤其是血漿游離DNA。
[0010]在第一方面，本發(fā)明提供一種游離DNA提取試劑盒，所述試劑盒包含多個(gè)容器，所 述容器中裝有裂解液、洗滌液A、洗滌液B、去抑制劑、磁珠和洗脫液，其中，洗滌液B中醇濃度 低于1%。
[0011] 在具體的實(shí)施方式中，所述洗滌液B中不含醇、不含表面活性劑。
[0012] 在具體的實(shí)施方式中，所述洗滌液B的pH值為4-6。
[0013] 在具體的實(shí)施方式中，所述洗滌液B為0.01~lmol/L，pH為4~6的Tris-HCL緩沖液 或Tris-乙酸、檸檬酸緩沖液。
[0014] 在具體的實(shí)施方式中，所述游離DNA是血漿游離DNA。
[0015] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述裂解液主要包含異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、表面活性劑 (包括但不限于NP40、Triton IOCKTween 20)、異丙醇。
[0016]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述洗滌液A包含異硫氰酸胍、表面活性劑(包括但不限于 NP40、Triton 100、Tween 20)、乙醇。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述去抑制劑為蛋白酶K。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述磁珠為表面烷基化的磁性顆粒。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述洗脫液包含pH值8.0~10的TriS-HCL緩沖液(或Tris-乙酸、檸檬酸緩沖液）。
[0020] 在第二方面，本發(fā)明提供一種提取游離DNA的方法，包括利用本發(fā)明第一方面所述 的游離DNA提取試劑盒提取樣品中的游離DNA。
[0021] 在具體的實(shí)施方式中，所述樣品是血漿，和所述游離DNA是血漿游離DNA。
[0022]在第三方面，本發(fā)明提供一種游離DNA提取系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含或整合了本發(fā)明第 一方面所述的游離DNA提取試劑盒。
[0023]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述游離DNA是血漿游離DNA。
[0024] 在第四方面，本發(fā)明提供一種用于游離DNA提取的洗滌液B，所述洗滌液B中醇濃度 低于1 % ;優(yōu)選地，所述洗滌液B不含醇、不含表面活性劑。
[0025] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述洗滌液B的pH值為4-6。
[0026]在第五方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第四方面所述的洗滌液B在制備游離DNA提取試劑 盒中的用途。
[0027]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述游離DNA是血漿游離DNA。
[0028] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述洗滌液B為0.01~lmol/L，pH為4~6的Tris-HCL緩沖液 或Tris-乙酸、檸檬酸緩沖液。
[0029]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1是本發(fā)明的游離DNA提取系統(tǒng)的平面示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為有效保證核酸在洗滌過(guò)程中不損失，現(xiàn)有的DNA提取產(chǎn)品中的洗滌液均含有60 ~80 %的高濃度的醇。但高濃度的醇具有抑制后續(xù)PCR反應(yīng)、不利于自動(dòng)化儀器、易燃等缺 陷，從而造成安全隱患以及整個(gè)提取流程的操作繁瑣、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。
[0032]發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)利用醇濃度較低的緩沖液進(jìn)行洗 滌同樣可以獲得良好的洗滌效果而不會(huì)造成核酸損失，同時(shí)該緩沖液中的醇濃度可以非常 低，甚至完全不含醇且不含表面活性劑。在此發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種可用于游離 DNA提取的試劑盒，該試劑盒所采用的洗滌液不含醇類(lèi)等揮發(fā)性溶劑，從而不會(huì)影響后續(xù)的 PCR反應(yīng)，并且使用安全、簡(jiǎn)便、成本低廉;而配套該游離DNA提取試劑盒的全自動(dòng)游離DNA提 取系統(tǒng)不僅實(shí)現(xiàn)了游離DNA提取的全自動(dòng)化，而且提取效率要比現(xiàn)有技術(shù)中主要的提取試 劑盒的提取效率高1倍左右，并且具有非常好的防污染功能。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。 [0033]本發(fā)明的游離DNA提取試劑盒
[0034]本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)單、提取效率高的DNA提取試劑盒，特別是血漿游離DNA提 取試劑盒。本發(fā)明的試劑盒基于磁珠法核酸提取原理，專(zhuān)門(mén)針對(duì)游離DNA片段較短的特點(diǎn)設(shè) 計(jì)開(kāi)發(fā)。利用該試劑盒，僅需2步洗滌，在提取過(guò)程中不需要進(jìn)行離心，同時(shí)洗滌步驟無(wú)需使 用高濃度的醇類(lèi)物質(zhì)，從而顯著降低對(duì)后續(xù)測(cè)試的影響，而且提取效率達(dá)到目前主流的柱 提取方法試劑盒的2倍以上。
[0035]在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供這樣一種游離DNA提取試劑盒，所述試劑盒由容 器以及裝在所述容器中的裂解液、洗滌液A、洗滌液B、去抑制劑、磁珠、洗脫液組成;其中， [0036] 裂解液主要包含異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、去垢劑(包括但不限于NP40、Triton 100、 Tween 20)、異丙醇。在高鹽條件以及合適濃度異丙醇條件下，血漿中的游離DNA可以高效地 與磁珠結(jié)合，同時(shí)去除部分蛋白、多糖、血脂等血漿中含有的雜質(zhì)；
[0037] 洗滌液A主要包含異硫氰酸胍、去垢劑（包括但不限于NP40、Triton 100、Tween 20)、乙醇，作用是進(jìn)一步去除磁珠上的雜質(zhì)，保證游離DNA在洗滌條件下不會(huì)丟失。
[0038]洗滌液B可以包含極低濃度的醇，例如低于1 %的醇，甚至完全不含醇。本發(fā)明的洗 滌液B還可以不含表面活性劑。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，利用醇濃度很低的，甚至不含醇 的洗滌液B可以達(dá)到良好的洗滌效果。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，利用較低pH(例如，pH為4-6)的 低醇或不含醇緩沖液可以得到更好的效果。在具體的實(shí)施方式中，所述洗滌液B主要包含 0.01~lmol/L的pH值4~6的Tris-HCL緩沖液或Tris-乙酸、檸檬酸緩沖液，用于去除鹽分和 其它水溶性雜質(zhì)，同時(shí)保證游離DNA不會(huì)丟失。
[0039] 去抑制劑主要包含蛋白酶K，和裂解液一起使用來(lái)消化血漿中的蛋白類(lèi)雜質(zhì)。
[0040] 磁珠為表面被烷基化的磁性顆粒，用于血漿中游離DNA的吸附。
[0041 ]洗脫液主要包含pH值8.0~10的TriS-HCL緩沖液或TriS-乙酸、檸檬酸緩沖液，用 于將游離DNA從磁珠上洗脫下來(lái)。
[0042]本發(fā)明的游離DNA提取系統(tǒng)
[0043]在本發(fā)明提供的游離DNA提取試劑盒的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提供與該試劑盒配 套使用的，或包含或整合了本發(fā)明的游離DNA提取試劑盒的全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)。
[0044]在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的游離DNA提取系統(tǒng)包括安裝平臺(tái)，以及依次安裝于 該安裝平臺(tái)上的吸頭盒載架、試劑槽載架、離心管載架、PCR板載架、樣本管載架、固定載架 以及廢棄物載架，其中，固定載架上設(shè)置有振蕩器，該振蕩器具有加熱功能。
[0045]圖1是本發(fā)明的游離DNA提取系統(tǒng)的平面示意圖。如圖1所示，本發(fā)明的游離DNA提 取系統(tǒng)100通常包括安裝平臺(tái)10、吸頭盒載架20、試劑槽載架30、離心管載架40、PCR板載架 50、樣本管載架60、固定載架70以及廢棄物載架80。其中，吸頭盒載架20、試劑槽載架30、離 心管載架40、PCR板載架50、樣本管載架60、固定載架70以及廢棄物載架80依次安裝于安裝 平臺(tái)10上。
[0046] 吸頭盒載架10設(shè)置有4個(gè)容納室11，從而可以放置多個(gè)相同規(guī)格或不同規(guī)格的吸 頭，在本實(shí)施例中，吸頭盒載架10可放置4盒不同規(guī)格的吸頭，例如吸頭盒載架10可放置4盒 1000 ul和300ul規(guī)格的吸頭，當(dāng)然也可根據(jù)需求放置其它規(guī)格的一次性吸頭。
[0047] 試劑槽載架30用于放置裂解液、洗滌液、洗脫液等提取試劑。如圖1所示，在本實(shí)施 例中，在安裝平臺(tái)10上一共設(shè)置3條并列的試劑槽載架30,且該三條試劑槽載架30緊鄰吸頭 盒載架20布置，其中，每一條試劑槽載架30可以放置四個(gè)試劑槽31，每一個(gè)試劑槽31可容納 60ml試劑，因此，在本實(shí)施例中，最多可放置12個(gè)試劑槽。
[0048]離心管載架40設(shè)置有用于離心管容納孔41，離心管容納孔41用于放置盛放小體積 試劑的離心管（圖未示），如盛放有磁珠、去抑制劑、PCR反應(yīng)液等的離心管。在本實(shí)例中，離 心管載架40總共設(shè)置有24個(gè)離心管容納孔41，從而可以安裝24個(gè)不同規(guī)格的離心管，例如 24個(gè)1.5ml或2ml的離心管。離心管載架40緊鄰試劑槽載架40布置。
[0049] PCR板載架50緊鄰離心管載架40布置，并用于放置96孔PCR反應(yīng)板，以供后續(xù)測(cè)試 時(shí)使用。
[0050] 樣本管載架60用于放置樣本管并緊鄰PCR板載架布置，在本實(shí)施例中，總共設(shè)置四 條樣本管載架60,每條樣本管載架設(shè)置有24個(gè)樣本管容納孔61，每一個(gè)樣本管容納孔61可 以安裝一個(gè)樣本管，從而每一樣本管載架60可以放置24個(gè)樣本管，樣本管可以是13 X75mm 和13 X IOOmm的規(guī)格核酸采血管。當(dāng)然也可以使用其它規(guī)格的樣本管載架，從而放置其它規(guī) 格的核酸采血管，例如更大的16 100或16 125mm規(guī)格的核酸采血管等。
[0051] 固定載架70與樣本管載架60間隔一定距離布置，在固定載架70上配置有振蕩器 (圖未示）、磁力板(圖未示)和深孔板位(圖未示）。其中，振蕩器具有加熱功能。在游離DNA提 取過(guò)程中，振蕩器進(jìn)行磁珠的混勻，同時(shí)由于振蕩器具有加熱功能，從而可以將提取的游離 DNA從磁珠上洗脫下來(lái)。磁力板用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)96孔深板內(nèi)的樣本進(jìn)行磁珠吸附，并通過(guò)自動(dòng)化 移液通道吸棄廢液，實(shí)現(xiàn)固液分離，該模式可以有效避免游離DNA提取過(guò)程中的核酸污染， 同時(shí)達(dá)到較高的提取效率。
[0052]廢棄物載架80用于放置樣本處理過(guò)程中的廢液和廢棄吸頭，并設(shè)置有專(zhuān)門(mén)的廢液 槽(圖未示），該廢液槽可以取出并進(jìn)行清潔消毒。
[0053]本發(fā)明的游離DNA提取系統(tǒng)的工作流程如下所述：
[0054] 1.游離DNA提取系統(tǒng)先將試劑槽中的裂解液和磁珠混合液加入到深孔板中，例如 加入量為500ul;
[0055] 2.將樣本管中的待測(cè)樣本吸取一定量(諸如為200ul)并加入到深孔板中與裂解液 和磁珠混合液進(jìn)行混勻；
[0056] 3.裂解一定時(shí)間，例如15至30分鐘；
[0057] 4.裂解完成后，全自動(dòng)提取系統(tǒng)將深孔板轉(zhuǎn)移至磁力板，待磁珠完全吸附至深孔 板底側(cè)部后，通過(guò)全自動(dòng)移液通道吸棄廢液；
[0058] 5.將深孔板轉(zhuǎn)移至振蕩器上，再通過(guò)全自動(dòng)移液通道加入洗滌液A: 600至SOOul， 進(jìn)行震蕩洗滌；
[0059] 6.洗滌完成后，將深孔板轉(zhuǎn)移至磁力板，待磁珠完全吸附至深孔板底側(cè)部后，通過(guò) 全動(dòng)動(dòng)移液通道吸棄廢液；
[0060] 7 .再一次將深孔板轉(zhuǎn)移至振蕩器上，再通過(guò)全自動(dòng)移液通道加入洗滌液B: 600至 800ul，進(jìn)行震蕩洗滌；
[0061 ] 8.將深孔板轉(zhuǎn)移至磁力板，待磁珠完全吸附至深孔板底側(cè)部后，通過(guò)全自移液通 道吸棄廢液；
[0062] 9.最后，將深孔板轉(zhuǎn)移至振蕩器上，加入洗脫液30至IOOul，進(jìn)行加熱洗脫，加熱溫 度為60至85攝氏度，洗脫時(shí)間為10至20分鐘，得到純凈的游離DNA。
[0063]本發(fā)明的游離DNA提取系統(tǒng)提供通過(guò)全自動(dòng)操作，實(shí)現(xiàn)由樣本載入到游離DNA提取 純化完成的全自動(dòng)化操作，同時(shí)具有設(shè)備臺(tái)面設(shè)計(jì)緊湊、通量大、提取速度快、成本低的優(yōu) 勢(shì)，可以更好的滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。而配套本發(fā)明的游離DNA提取試劑盒的全自動(dòng)游離DNA提取 系統(tǒng)不僅實(shí)現(xiàn)了游離DNA提取的全自動(dòng)化，而且提取效率遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)中的主要提取試 劑盒，并且具有非常好的防污染功能。
[0064]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0065] 1.本發(fā)明的游離DNA提取試劑盒采用的洗滌液B的組成簡(jiǎn)單、不含醇類(lèi)等揮發(fā)性有 機(jī)溶劑以及表面活性劑；
[0066] 2.本發(fā)明的與后續(xù)PCR反應(yīng)中利用的緩沖液組成非常接近，僅需適當(dāng)調(diào)節(jié)pH就可 用于PCR反應(yīng);和
[0067] 3.本發(fā)明的游離DNA提取試劑盒以及游離DNA提取系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單、快捷并且準(zhǔn)確。
[0068] 實(shí)施例1:
[0069]使用全自動(dòng)游離DNA提取系統(tǒng)和配套游離DNA提取試劑盒，對(duì)模擬血漿游離DNA樣 本進(jìn)行提取，同時(shí)使用天根血漿游離DNA提取試劑盒（目錄號(hào)DP339,天根生化科技(北京)有 限公司，北京)進(jìn)行比對(duì)，比較2種方法對(duì)模擬血漿游離DNA樣本的提取效率。
[0070]其中，本發(fā)明游離DNA提取試劑盒的組成為：
[0071] 裂解液(50 %異硫氰酸胍、10 % Triton-100、1 %檸檬酸鈉）；
[0072] 洗滌液A( 30 %異硫氰酸胍、5 % Triton-100、1 %檸檬酸鈉、30 %乙醇）；
[0073]洗滌液B(0. lmol/L，pH值4.5的Tris-HCL緩沖液）；
[0074]洗脫液(0.05mol/L，pH值8.5的Tris-HCL緩沖液）；
[0075] 磁珠溶液(硅烷磁珠，含量為30 % );
[0076] 去抑制劑(30mg/ml蛋白酶K)。
[0077]模擬血漿游離DNA樣本的配制使用人工合成的160bpDNA片段(模擬游離DNA片段大 小，并設(shè)計(jì)引物探針用于熒光定量PCR分析)使用人血漿進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)渲瞥纱郎y(cè)的 模擬樣本。經(jīng)過(guò)2種對(duì)比方法提取后，提取產(chǎn)物使用熒光定量PCR方法進(jìn)行定量分析。
[0078]直接擴(kuò)增檢測(cè)樣本的配制使用人工合成的161bpDNA片段直接使用超純水進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)渲瞥煽芍苯舆M(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)的樣本，稀釋倍數(shù)與上述模擬血漿游 離DNA樣本一致，作為提取效率計(jì)算的基數(shù)，通過(guò)上述提取產(chǎn)物的定量分析，計(jì)算不同提取 方法的提取效率
[0079]實(shí)驗(yàn)分別選擇濃度約為105、107、108、10 9c〇pieS/ml的4個(gè)濃度樣本進(jìn)行提取效率 比較，每個(gè)樣本重復(fù)2次取平均值，綜合評(píng)估本發(fā)明提取效率與天跟游離DNA提取試劑盒效 率的差異。
[0081]從提取效率的比較結(jié)果來(lái)看，本發(fā)明不僅實(shí)現(xiàn)了游離DNA提取的全自動(dòng)化，而且提 取效率要比市面上主要的手工提取試劑盒提取效率高1倍左右。
[0082] 實(shí)施例2:
[0083]使用全自動(dòng)游離DNA提取系統(tǒng)和配套游離DNA提取試劑盒進(jìn)行防污染測(cè)試。
[0084]模擬血漿游離DNA樣本配制：將人工合成的161bpDNA片段使用人血漿進(jìn)行一定倍 數(shù)稀釋?zhuān)瓜♂尯髽颖镜哪MDNA濃度達(dá)到101()copies/ml左右。
[0085]防污染測(cè)試方案：將模擬血漿游離DNA樣本作為陽(yáng)性樣本，陰性血漿作為陰性樣 本，間隔排列，共進(jìn)行96個(gè)樣本的測(cè)試，要求48個(gè)陰性樣本不被污染，使用熒光定量PCR方法 進(jìn)行陰陽(yáng)性判定。
[0086]檢測(cè)結(jié)果顯示，全自動(dòng)游離DNA提取系統(tǒng)在進(jìn)行96個(gè)陰陽(yáng)間隔樣本測(cè)試過(guò)程中，48 個(gè)陰性樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，未在提取過(guò)程中發(fā)生污染。證明該全自動(dòng)游離DNA提取系統(tǒng) 具有非常好的防污染產(chǎn)生功能，適合臨床單位使用。

[0089]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種游離DNA提取試劑盒，所述試劑盒包含多個(gè)容器，所述容器中裝有裂解液、洗滌 液A、洗滌液B、去抑制劑、磁珠和洗脫液，其中，洗滌液B中醇濃度低于1 %。2. 如權(quán)利要求1所述的游離DNA提取試劑盒，其特征在于，所述洗滌液B中不含醇、不含 表面活性劑。3. 如權(quán)利要求2所述的游離DNA提取試劑盒，其特征在于，所述洗滌液B的pH值為4-6。4. 如權(quán)利要求3所述的游離DNA提取試劑盒，其特征在于，所述洗滌液B為0.01~lmol/ L，pH為4~6的Tris-HCL緩沖液或Tris-乙酸、檸檬酸緩沖液。5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的游離DNA提取試劑盒，其特征在于，所述游離DNA是血 漿游離DNA。6. -種提取游離DNA的方法，包括利用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的游離DNA提取試劑 盒提取樣品中的游離DNA。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述樣品是血漿，和所述游離DNA是血漿游離 DNA〇8. -種游離DNA提取系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含或整合了權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的游離 DNA提取試劑盒。9. 一種用于游離DNA提取的洗滌液B，所述洗滌液B中醇濃度低于1 % ;優(yōu)選地，所述洗滌 液B不含醇、不含表面活性劑。10. 權(quán)利要求9所述的洗滌液B在制備游離DNA提取試劑盒中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105861493SQ201610392350
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】陳威, 蔣淼
【申請(qǐng)人】上海科華生物工程股份有限公司