專利名稱：與黃瓜有毛基因Gl緊密連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記。特別是一種與黃瓜有 毛基因Gl緊密連鎖的分子標(biāo)記。
技術(shù)背景黃瓜(Cucumis sativus L )是葫戶禾斗(Cucurbitaceae)黃瓜屬(Cucumis) 一年蔓生的草本植物，原產(chǎn)溫暖濕潤(rùn)的喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)，傳入我 國(guó)栽培已有2000多年的歷史，我國(guó)是黃瓜的次生起源中心。黃瓜作為世界十大 重要的蔬菜作物之一，也是我國(guó)主栽蔬菜作物之一。黃瓜植株莖、葉、巻須、花 萼、子房表面均覆有剛毛，多數(shù)子房表面有瘤狀突起，瘤上有刺。黃瓜果實(shí)屬于 瓠果，由子房和花托共同發(fā)育而成，果實(shí)均有刺，但是有些品種果實(shí)上沒(méi)有果瘤。 通過(guò)組織學(xué)觀察，黃瓜葉片上的剛毛和果實(shí)上的果刺形態(tài)結(jié)構(gòu)一樣，均為多細(xì)胞 無(wú)腺體的表皮毛。Robinson曾在1964年通過(guò)輻射誘變產(chǎn)生了黃瓜無(wú)毛類型突變體，該隱性突 變基因命名為glabrous (gl)，該突變體表現(xiàn)為莖、葉、巻須、花萼、子房均沒(méi) 有表皮毛，果實(shí)表面也沒(méi)有果刺和果瘤(cucumber gene list, 2001)。山東農(nóng) 業(yè)大學(xué)的曹辰興于1997年在華北類型黃瓜地方品種"大青把"(表現(xiàn)為植株有 毛、有果剌和果瘤)自交后代群體中發(fā)現(xiàn)無(wú)毛類型的自然突變體，其表現(xiàn)為莖、 葉、巻須、花梗、花萼、子房表面均光滑無(wú)剛毛，果實(shí)表面無(wú)刺無(wú)瘤(曹辰興， 郭紅蕓.黃瓜突變新類型一無(wú)毛黃瓜.中國(guó)蔬菜，1999， 4: 29)。用無(wú)毛類型突 變體與有毛類型野生型雜交，正反交子一代均恢復(fù)有毛性狀，表明植株毛的有無(wú) 的性狀為細(xì)胞核基因控制，通過(guò)F2和BC1群體的遺傳分析，結(jié)果表明有毛(G1) 為顯性，無(wú)毛(gl)為隱性，并且莖、葉、巻須等表面的表皮毛性狀為一對(duì)核基 因控制。用無(wú)毛黃瓜的花粉給普通有毛黃瓜的有刺無(wú)瘤(tutu)自交系授粉，子 一代植株果實(shí)表面有刺有瘤，通過(guò)分離群體的遺傳分析結(jié)果表明控制莖、葉、果實(shí)表皮毛性狀的無(wú)毛基因?qū)刂乒鲂誀畹墓龌虼嬖陔[性上位作用(曹辰興 等.黃瓜莖葉無(wú)毛性狀與果實(shí)瘤剌性狀的遺傳關(guān)系.園藝學(xué)報(bào)，2001， 28(6): 565-566.)，天津黃瓜研究所也在1999年發(fā)現(xiàn)了無(wú)毛黃瓜的自然突變體，其表現(xiàn) 型與以前發(fā)現(xiàn)的突變體一致，遺傳分析結(jié)果也是一對(duì)核基因控制的顯性性狀(馬 德華等.黃瓜無(wú)毛突變體的生理特性研究.園藝學(xué)報(bào)，2002， 29(3): 282-284)。 這些突變體為黃瓜葉片剛毛和果刺的形成機(jī)理研究提供了理想的材料。但是，目 前國(guó)內(nèi)外對(duì)于黃瓜無(wú)毛突變體僅限于遺傳規(guī)律分析和生理特性的研究，對(duì)于黃瓜 果剌形成的分子機(jī)制研究卻從未有報(bào)道。
圖位克隆(map-based cloning),又稱定位克隆(positional cloning), 圖位克隆方法可以在基因產(chǎn)物未知的情況下，根據(jù)功能基因在基因組中的位置進(jìn) 行，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的一個(gè)具 體位置的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分 子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因。圖位克隆方法的應(yīng)用需要具備幾個(gè) 條件具有高密度的分子圖譜；具有大片段的基因組文庫(kù)(BAC或YAC文庫(kù))及 物理圖譜；親本間具有較高多態(tài)性的分離群體等。圖位克隆技術(shù)主要包括以下幾 個(gè)步驟l.尋找與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。常用的標(biāo)記篩選方法主要有分 離群體分組分析法(Bulked Segregant Analysis, BSA)和近等基因系法
(Near-isogenic lines)。配制特殊的遺傳群體是篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的分 子標(biāo)記的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2.篩選含有大插入片段的基因組文庫(kù)。常用的文庫(kù)有BAC
(Bacterial artificial chromosome)文庫(kù)、YAC(Yeast artificial chromosome) 文庫(kù)，用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記篩選基因組文庫(kù)，得到陽(yáng)性克隆。3.目的基 因區(qū)域的精細(xì)定位。用陽(yáng)性克隆的末端作為探針篩選基因組文庫(kù)，進(jìn)行染色體步 移，直到獲得目標(biāo)基因附近的大片段重疊群，通過(guò)整合己有的遺傳圖譜和尋找新 的分子標(biāo)記，提高目的基因區(qū)域的圖譜密度。4.目的基因的分離。利用側(cè)翼分子 標(biāo)記分析大群體，將目的基因定位在一個(gè)BAC克隆上，分離陽(yáng)性克隆。5.目標(biāo)基 因的鑒定。陽(yáng)性克隆中可能含有多個(gè)候選基因，找到候選基因后，通過(guò)分離群體 的共分離分析或進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因功能，其它方法如檢査cDNA時(shí)空表 達(dá)特點(diǎn)是否與表型一致、測(cè)定cDNA序列査詢數(shù)據(jù)庫(kù)、篩選突變體文庫(kù)，找出DNA序列的變化和功能的關(guān)系都可以作為鑒定方法。但是黃瓜的基因組學(xué)研究較落 后，至今沒(méi)有在黃瓜上成功利用圖位克隆方法克隆基因的例子，其最主要原因是 不能有效獲得與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位，首先必須找到與該性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記。 相關(guān)序歹lj擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)標(biāo) 記是2001年由Li等提出的一種新型的基于PCR的分子標(biāo)記(Li， G. andQuiros， C. F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 2001,103,455-461.)，該標(biāo)記旨在通過(guò)獨(dú) 特的引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增基因組的開(kāi)放閱讀框(open reading frames, ORF)部分。它 的引物設(shè)計(jì)思想建立在基因組研究的統(tǒng)計(jì)性規(guī)律(即基因的外顯子部分G/C 含量較高，而內(nèi)含子、啟動(dòng)子、基因間序列等部分A/T含量較高)基礎(chǔ)上。它的 正向引物長(zhǎng)度為17個(gè)堿基，其中5'端前10個(gè)堿基為隨機(jī)的填充性序列，第 11-14為CCGG核心序列，最后面3個(gè)為隨機(jī)的選擇性堿基；反向引物一般18個(gè) 堿基，5'端前l(fā)l個(gè)也是填充性序列，緊接為AATT核心序列，最后也是3個(gè)選 擇性堿基。SRAP標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和廣泛適用的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該標(biāo)記 的最大優(yōu)點(diǎn)是較RAPD、 AFLP等標(biāo)記容易找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。 所以找到與Gl基因緊密連鎖的標(biāo)記，可為下一步圖位克隆這個(gè)基因打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。果實(shí)是黃瓜經(jīng)濟(jì)性狀最重要的部分，隨著人們生活水平的提高，品質(zhì)育種 己提到重要位置。果實(shí)的品質(zhì)分為感觀品質(zhì)、風(fēng)味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，目前已鑒定 的品質(zhì)基因多為感觀品質(zhì)基因，如果瘤有無(wú)、果剌顏色、果刺多少、果皮顏色和 果皮組織結(jié)構(gòu)等等。歐美溫室類型的黃瓜為無(wú)果瘤、少刺的果皮，稱其為"水果" 黃瓜，其市場(chǎng)價(jià)格為普通黃瓜的2 — 3倍。外觀光滑的黃瓜污染少，清洗方便，食用衛(wèi)生，是無(wú)公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測(cè)表明無(wú)瘤少刺黃瓜果肉農(nóng)藥殘留量比有刺黃瓜低27%，果皮農(nóng)藥殘留量低18%。黃瓜有毛基因Gl控制果刺的形 成，它的研究將會(huì)加速品質(zhì)育種進(jìn)程，與有毛G1連鎖的分子標(biāo)記也可以應(yīng)用到 黃瓜分子標(biāo)記輔助育種的過(guò)程中。由于黃瓜無(wú)毛基因gl對(duì)果瘤這個(gè)重要的品質(zhì)基因有隱性上位作用，這表明 有毛基因Gl是果瘤形成過(guò)程的必要基因。所以Gl基因的研究將有助于揭示黃瓜
果瘤形成的分子機(jī)制，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是利用分子標(biāo)記和BSA法，提供一個(gè)和與黃瓜有毛基因Gl緊密 連鎖的分子標(biāo)記。在黃瓜有毛野生類型(G1G1)和無(wú)毛突變體(glgl)的F2代 分離群體中篩選與有毛基因Gl緊密連鎖的分子標(biāo)記，為進(jìn)一步分離和克隆Gl 基因奠定基礎(chǔ)。由于該基因決定黃瓜果刺的形成，所以該分子標(biāo)記也可應(yīng)用到黃 瓜分子標(biāo)記輔助育種工作中。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明由上游引物(S-M4E3-F)和下游引物(S-M4E3-R)組成，并包括上 游和下游引物PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO. 1中716個(gè)核苷酸序列。
本發(fā)明它是由SRAP引物(ME4和EM3) PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷 酸序列具有序列表中SEQ ID N0.4中738個(gè)核苷酸序列。
本發(fā)明的分子標(biāo)記是一個(gè)SCAR標(biāo)記，名稱為S-M4E3，來(lái)源與普通黃瓜，是 由對(duì)應(yīng)的SRAP標(biāo)記ME4EM3轉(zhuǎn)化而來(lái)的，具有序列表中SEQ ID No. 1的716個(gè) 堿基的DNA序列，對(duì)應(yīng)的SRAP標(biāo)記具有序列表中SEQ ID No. 4的738個(gè)堿基的 DNA序列。
由于黃瓜表皮毛(果刺)細(xì)胞開(kāi)始分化的時(shí)間很早，所以在形態(tài)學(xué)上很難 確定，而傳統(tǒng)的育種方法是根據(jù)植物的形態(tài)來(lái)進(jìn)行選擇，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，本發(fā)明 的SCAR標(biāo)記在植物種子期間或子葉長(zhǎng)出的早期階段就可鑒定，即省時(shí)也準(zhǔn)確， 所以可用于黃瓜分子標(biāo)記輔助育種，加速黃瓜品質(zhì)育種進(jìn)程。


圖1為SRAP標(biāo)記分析黃瓜有毛池和無(wú)毛池的植株差異片段。P1為黃瓜有毛 野生型親本S06， P2為黃瓜無(wú)毛突變體gl。
圖2為SCAR標(biāo)記分析黃瓜S06Xgl的F2分離群體部分植株。Pl為黃瓜有 毛野生型親本S06， P2為黃瓜無(wú)毛突變體gl， F1為兩親本的雜交F1代。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l、與黃瓜有毛基因(Gl)緊密連鎖的SRAP標(biāo)記的獲得一、 F2群體的親本獲得和群體的構(gòu)建普通黃瓜有毛(G1G1)野生類型的親本S06由上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué) 院黃瓜課題組提供，該自交系屬于歐洲溫室類型的黃瓜，其表現(xiàn)為全雌、有果刺、 無(wú)果瘤，該自交系描述可見(jiàn)文獻(xiàn)《自然科學(xué)進(jìn)展》2005年發(fā)表的文獻(xiàn)"黃瓜SRAP 遺傳連鎖圖的構(gòu)建及始花節(jié)位的基因定位"(潘俊松，等.黃瓜SRAP遺傳連鎖圖 的構(gòu)建及始花節(jié)位的基因定位.自然科學(xué)進(jìn)展，2005， 15， 167-172)。黃瓜無(wú)毛 突變體(glgl)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院的曹辰興饋贈(zèng)，曹辰興于 1997年在華北類型黃瓜地方品種"大青把"(表現(xiàn)為植株有毛、有果刺和果瘤) 自交后代群體中發(fā)現(xiàn)無(wú)毛類型的自然突變體，其表現(xiàn)為莖、葉、巻須、花梗、花 萼、子房表面均光滑無(wú)剛毛，果實(shí)表面無(wú)刺無(wú)瘤(曹辰興，郭紅蕓.黃瓜突變新 類型一無(wú)毛黃瓜.中國(guó)蔬菜，1999， 4: 29)。本發(fā)明利用這兩個(gè)親本配制了雜交組合，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F2代群體。在125 株F2個(gè)體中，鑒定葉片有毛和無(wú)毛的表現(xiàn)型，并在結(jié)果期鑒定有無(wú)果刺的表型， 看是否一致，利用卡方分析法計(jì)算分離比例。每株取一片嫩葉提取基因組DNA。二、 篩選與有毛性狀連鎖的分子標(biāo)記 1、黃瓜基因組DNA的提取用CTAB法提取親本及F2代分離群體的葉片總DNA，2XCTAB緩沖液配方為 2%的CTAB， Tris cl (PH=8. 0) 100mmol/L， EDTA (PH=8. 0)20 mmol/L， Nacl 1. 4 mol/L。方法為取兩片真葉展開(kāi)時(shí)的葉片在液氮中快速研磨成粉末狀，放于 1.5ml的離心管中；加入預(yù)熱的600WCTAB提取緩沖液，60。C水浴0. 5 — lh;加 入等體積氯仿異戊醇(24: 1， v/v)，混勻后12000r/min4°C離心10min;將上 清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加等體積異丙醇，輕輕混勻，冰浴0.5h以上，4'C， 12000r/min 4°C離心10min;倒去上清液，用70%酒精沖洗沉淀兩次，干燥后， 加入TE緩沖液150W溶解后，加入RNA酶(10u g/ml)除去RNA， 37。C水浴30min 后存于一20。C備用。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm的光吸收值，10D相 當(dāng)于50ng DNA計(jì)算DNA的含量，利用260nm和280nm的光吸收值的比值估計(jì)DNA的質(zhì)量。在0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以50ng/ixl的入DNA為標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)所得DNA 的濃度。
2、 有毛(Gl_)和無(wú)毛(glgl)黃瓜的基因池建立。
在F2分離群體中，用BSA法建立有毛(Gl一)和無(wú)毛(glgl)黃瓜的基因 池。從分離群體中分別隨機(jī)選取有毛的植株和無(wú)毛的植株個(gè)體各10株，每個(gè)基 因池用10株植株的子葉混合提取DNA而成。
3、 用SRAP標(biāo)記篩選親本和兩個(gè)基因池之間多態(tài)的標(biāo)記，從中獲得與目標(biāo) 性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記。
利用16對(duì)SRAP正向引物和22對(duì)SRAP反向引物(共352個(gè)組合)對(duì)兩個(gè) 親本及兩個(gè)基因池進(jìn)行篩選，引物由上海生工合成。PCR體系為基因組DNA30 ng，引物0.5 Wnol/L， 200 Mmol/L dNTPs， 2 mmol/L MgC12， lXTaq緩沖液， 0.6 U TaqDNA聚合酶(上海Promega公司產(chǎn)品)，總反應(yīng)體系為10 HL。 PCR擴(kuò) 增程序?yàn)?4 。C 3 min ; 94 。C 20 sec; 37 °C 30s; 72 °C lmin， 8個(gè)循環(huán)； 94 °C 20 sec; 48 °C 30 s; 72°C lmin， 35個(gè)循環(huán)；72°C 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物加 入10ul的上樣緩沖液，混勻95。C變性5min，迅速置于冰上，冷卻后取6^1 上樣，用4%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳緩沖液為1XTBE， 70 W恒功 率，電泳1.5-2h (或二甲苯氫指示劑距離凝膠底部約3/l處)。其中4%的丙烯 酰胺凝膠為4。/。丙烯酰胺和N， ，N'-亞甲雙丙烯酰胺(19: l質(zhì)量比)，410g/L 尿素，1XTBE。上樣緩沖液98%去離子甲酰胺，10 ramol/L EDTA (PH=8. 0)， 0.025%二甲苯青FF， 0.025%溴酚藍(lán)。4%的測(cè)序凝膠(50ml): 4%的丙烯酰胺凝 膠50ml， 10%的過(guò)硫酸銨400u 1， TEMED為40ul。
電泳后進(jìn)行銀染。銀染方法為將帶膠的玻璃板放入固定液(10%冰醋酸、 1%無(wú)水乙醇)中，在搖床上輕輕搖動(dòng)至指示劑顏色褪去；用超純水洗l一3min; 將沖洗后的膠板放入染色液中(2g/L硝酸銀)搖動(dòng)半小時(shí)；將染色后的膠板放 入超純水中漂洗5s后放入裝有顯影液(15g/L的NaOH， 0.5%的甲醛溶液)的塑 料盒中，輕輕搖動(dòng)至條帶清晰；放入自來(lái)水中沖洗3min;室溫下干燥，干燥后 拍照。
SRAP標(biāo)記分析有毛和無(wú)毛基因池的差異片段結(jié)果如圖1所示，其中ME4EM3這對(duì)引物在親本和池之間表現(xiàn)出相同的多態(tài)性，即有毛親本S06和有毛基因池有 條帶，而無(wú)毛親本和無(wú)毛基因池沒(méi)有條帶，這個(gè)多態(tài)性片段長(zhǎng)度大約為750bp。 在125株F2群體分析中，將與有毛親本S06的帶型一致的有帶個(gè)體計(jì)為1，將 與無(wú)毛親本gl帶型一致的無(wú)帶個(gè)體計(jì)為2，缺失數(shù)據(jù)計(jì)為0,通過(guò)Mapmaker3. 0 軟件計(jì)算，結(jié)果為這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)和Gl基因之間的連鎖距離為3.2cM。其中 L0D^3. 0，采用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距。實(shí)施例2、與黃瓜Gl基因緊密連鎖的SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記SRAP標(biāo)記的多態(tài)性片段的回收、克隆和測(cè)序1、 SRAP多態(tài)片段的回收將多態(tài)性片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下，置于離心管中，用槍頭搗碎，加 入超純水沖洗三遍，然后加入10ul超純水95。C水浴10min，快速離心取上清液， 用SRAP引物ME4EM3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為目標(biāo)條帶DNA 5 u 1，引物 0. 5u mol/L， 200li mol/L dNTPs， 1 XTaq Buffer, 1. 5mmol/L MgC12， 2U Taq DNA 聚合酶(上海Promega公司產(chǎn)品)，總反應(yīng)體系為40ul。目標(biāo)條帶PCR擴(kuò)增程序 為94°C 3min; 35cycles， 94°C 30s; 50。C 30s; 72°C lmin; 72°C 5 min。 將PCR產(chǎn)物中加入goldview熒光染料，4r下放置lOmin讓染料了 DNA結(jié)合，然 后加入上樣緩沖液(6X緩沖液0.25%溴酚藍(lán)，40。/。(w/v)蔗糖水溶液)4ul，混 勻后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標(biāo)片段放入1.5ml的離心 管中，用DNA回收試劑盒(上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號(hào) Cat. No. SKI 132)回收。2、 酶連反應(yīng)將回收片段用連接酶連接到pUCm-T載體(上海申能博彩公司)上，連接反 應(yīng)體系為10 x Ligation Buffer力口 1.0|4， T一vector(35ngA4)力口 Ligase(3UM)加l潛l，回收DNA加6.5W，總體積為10W，在16。C下連接過(guò)夜，然后置于4t:備用3、 片段的克隆用電擊法將連有目標(biāo)片段的T-vector轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞 (購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)，具體方法如下吸取lml S0B培養(yǎng)基置于滅菌的1. 5ml的印pendorf管；取50W感受態(tài)細(xì)胞，放入滅菌的IO(M印pendorf 管；取lW連接產(chǎn)物加入盛裝感受態(tài)細(xì)胞的印pendorf管，混勻；將加有連接產(chǎn) 物的感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯(規(guī)格為2mm)， 2500v電擊轉(zhuǎn)化；電擊后將菌液洗 到lml SOB培養(yǎng)基中，37°C， 250 r/min培養(yǎng)lh。將菌液均勻涂布于LB固體培 養(yǎng)基的平板上，該培養(yǎng)基含氨芐100mg/ml， IPTG和x-gal。涂好的平板倒置 于37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。用滅過(guò)菌的牙簽將平板上的白斑菌落挑到2ml含氨芐 (100mg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C ， 250r/min培養(yǎng)2h后進(jìn)行菌液PCR，剩 余菌液繼續(xù)在37°C， 250rmp/min培養(yǎng)過(guò)夜。菌液PCR的反應(yīng)體系為M13引物 0. lwmol/L， dNTPs 200umol/L， lXTaq Buffer, 2. Ommol/L MgC12， 0. 5U Taq DNA聚合酶(上海Promega公司產(chǎn)品)，菌液1W，總反應(yīng)體系為IOW。菌液PCR 的反應(yīng)程序?yàn)?4°C 2 min; 25cycles， 94°C 30s; 50°C 30s， 72°C 45s; 72 °C 5 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，將擴(kuò)增出預(yù)期大小片段的菌 液送由上海生工進(jìn)行測(cè)序。 SCAR標(biāo)記的設(shè)計(jì)與分析
1、 SCAR標(biāo)記的設(shè)計(jì)
得到多態(tài)性片段的核苷酸序列，序列為所附序列表中的SEQIDN0.4。根據(jù) 引物設(shè)計(jì)原則(避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體結(jié)構(gòu)，GC含量40—60X,退火溫度 高于50°C )及ME4EM3多態(tài)位點(diǎn)片段兩端的序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3. 0 設(shè)計(jì)了一對(duì)20 23bp的引物S-M4E3。 S-M4E3-F序列為所附序列表中的SEQ ID NO. 2， S-M4E3-R序列為所附序列表中的SEQ ID NO. 3。引物由上海生工合成。
2、 SCAR標(biāo)記的分析
用新的SCAR引物對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行退火溫度梯度篩選，在55'C — 63'C下，兩 個(gè)親本都可擴(kuò)增出相同的條帶，在64'C—66'C下，兩個(gè)親本之間表現(xiàn)為多態(tài)性， 即有毛親本S06有一條750bp左右的擴(kuò)增條帶，而無(wú)毛親本在相同的位置沒(méi)有擴(kuò) 增條帶。進(jìn)一步用F2群體125個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系基因組DNA 30 ng， S-M4E3引物0. 2 Mmol/L， 200 Wnol/L dNTPs， 2誦ol/L MgC12， lXTaq緩沖液， 0. 5 U TaqDNA聚合酶(上海Promega公司產(chǎn)品)，總反應(yīng)體系為10叱。SCAR 的擴(kuò)增程序?yàn)?4。C 3min;35cycles，94。C 20s，65。C 20s，72。C 45s;72。C 5min。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，引物S-M4E3擴(kuò)增的片段來(lái)自原來(lái)SRAP標(biāo)記的多 態(tài)性片段，新的SCAR標(biāo)記S-M4E3與和Gl基因之間的連鎖距離也為3. 2cM。因 為S-M4E3標(biāo)記是一個(gè)SCAR標(biāo)記，所以在今后的分子標(biāo)記輔助育種中，具有穩(wěn)定 和使用方便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可以將此標(biāo)記篩選黃瓜BAC文庫(kù)，通過(guò)BAC末端測(cè)序得 到連鎖距離更近的分子標(biāo)記服務(wù)與黃瓜有毛基因的圖位克隆。本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分別如下
(1) SEQ ID NO. 1的信息 〈110〉上海交通大學(xué)
〈120〉與黃瓜有毛基因(Gl)緊密連鎖的分子標(biāo)記 <160> 4 <210> 1 〈211〉 716 〈212〉 DNA
〈213>黃瓜(Cucumis sativus L.) 〈400〉 1
CGGACCACTC TGTAATGAGC CTCAGCTGGT CAGTCTGAAG AGCCATGACA TCAGTTGTTT 60 CCGMGTCCG CTCGAAGTCG TCCTACTATC GCTTCGTCCT ACTATCGCTT CCTCGACCTG 120 GTTGTATGAT GTCGTCGGGG GACATGTTAA ACATATGGCT GGACATGGAA GGAATTTCCA 180 TATCATTGAG ATACACTTGT GCAAATTCCT CAAACCTAGG AGGAATGTTC GATGTCGGCA 240 AAGGTCTCTG CATGGGCTCC CGTTGCACGA TCTTTTCACG AATACATACG CCAACTCGTC 300 TTAATATGGG AAAGGCTTAT TTAACATACC CTTGGCTGTG ATTCTCAGCA ACAACGATGC 360 ACTTTATGAC GGGCAGCATT TCTGTGATTG CTTGGTATGC TTCAACGTCT TTATACTGCC 420 GTCAATGACT TCGCATGGAC ATTGCATCCC GACAACTTCA ACGCCATCAT TCGTAGAAGT 480 TGTGCCAGAT ACCCAGGTTT CAACGCCATC ATTCGTAGAA GTTGTGCCAG ATACGCAGGT 540 TTCAACGCCA TCATTCGTAG AAGTTGTGCC AGATACCCAA ATACCCAGGT CTTCCATCGT 600 TTCAAGGCCA TCATTCGTAG AAGTTGTGCC AGATACCCAG ATACCCAGGT CTTCCATCCA 660 CCCAATACTA ACTAAATGCG AATGCAGGAA TACTAAATCG ACACACATAG TCAATT 716
(2) SEQ ID N0.2的信息 〈210〉 2
<211> 20<212〉DNA〈213>人工序列 <400> 2
CGGACCACTCTGTAATGAGC 20
(3) SEQ ID NO. 3的信息 〈210> 3 <211> 20 <212〉腿 <213>人工序列 〈400〉 3
AATTGACTATGTGTGTCGATTTA 23
(4) SEQ ID N0.4的信息 <210> 4 <211> 738 <212>腿
<213>黃瓜(Cucumis sativus L.) <400> 4
TGAGTCCAAA CCGGACCACT CTGTAATGAG CCTCAGCTGG TCAGTCTGAA GAGCCATGAC60
ATCAGTTGTTTCCGAAGTCC GCTCGAAGTC GTCCTACTAT CGCTTCGTCC TACTATCGCT120
TCCTCGACCTGGTTGTATGA TGTCGTCGGG GGACATGTTA MCATATGGC TGGACATGGA180
AGGAATTTCCATATCATTGA GATACACTTG TGCAAATTCC TCAMCCTAG GAGGAATGTT240
CGATGTCGGCAAAGGTCTCT GCATGGGCTC CCGTTGCACG ATCTTTTCAC GAATACATAC300
GCCAACTCGTCTTAATATGG GAAAGGCTTA TTTAACATAC CCTTGGCTGT GATTCTCAGC360
AACAACGATGCACTTTATGA CGGGCAGCAT TTCTGTGATT GCTTGGTATG CTTCAACGTC420
TTTATACTGCCGTCAATGAC TTCGCATGGA CATTGCATCC CGACAACTTC AACGCCATCA■
TTCGTAGAAGTTGTGCCAGA TACCCAGGTT TCAACGCCAT CATTCGTAGA AGTTGTGCCA540
GATACGCAGGTTTCAACGCC ATCATTCGTA GAAGTTGTGC CAGATACCCA AATACCCAGG600TCTTCCATCG TTTCAAGGCC ATCATTCGTA GAAGTTGTGC CAGATACCCA GATACCCAGG 660 TCTTCCATCC ACCCAATACT AACTAAATGC GAATGCAGGA ATACTAAATC GACACACATA 720 GTCAATTCGT ACGCAGTC 738
權(quán)利要求
1、一種與黃瓜有毛基因Gl緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，它由上游引物(S-M4E3-F)和下游引物(S-M4E3-R)組成，并包括上游和下游引物PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO.1中716個(gè)核苷酸序列。
2、 一種與黃瓜有毛基因Gl緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，它是由SRAP 引物(ME4和EM3) PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO. 4中738個(gè)核苷酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的與黃瓜有毛基因Gl緊密連鎖的分子標(biāo)記， 其特征是，在黃瓜分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的與黃瓜有毛基因G1緊密連鎖的分子標(biāo)記。它由上游引物(S-M4E3-F)和下游引物(S-M4E3-R)組成，并包括上游和下游引物PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO.1中716個(gè)核苷酸序列。它是由SRAP引物(ME4和EM3)PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO.4中738個(gè)核苷酸序列。本發(fā)明可用于黃瓜分子標(biāo)記輔助育種，加速黃瓜品種育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101250523SQ20081003555
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者媛 關(guān), 吳愛(ài)忠, 潘俊松, 蘇 蔣, 潤(rùn) 蔡 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)