專利名稱：SNPs組合鑒定TAP等位基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及等位基因的鑒定方法，具體涉及TAP等位基因的鑒定方法。

背景技術(shù)：
在普通實(shí)驗(yàn)室，TAP等位基因的鑒定方法目前主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)，序列特異性引物方法(PCR-SSP)等。
1)PCR-RFLP 主要原理利用特異限制性內(nèi)切酶酶切突變位點(diǎn)產(chǎn)生的不同片斷，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判斷堿基的二態(tài)性。
主要實(shí)驗(yàn)流程 PCR擴(kuò)增目的基因片段→特異限制性內(nèi)切酶酶切→瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片斷。
實(shí)驗(yàn)缺陷 ①實(shí)驗(yàn)步驟較煩瑣。
②且TAP基因由TAP1和TAP2組成，TAP1有13個(gè)SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)和一個(gè)特殊的堿基deletion，TAP2有8個(gè)SNP位點(diǎn)。故通過(guò)PCR-RFLP檢查T(mén)AP所有的SNP時(shí)要擴(kuò)增21次，酶切22次，然后再進(jìn)行凝膠電泳。工作量巨大，較易出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤。
③不能鑒別出純雜合子情況。
④實(shí)驗(yàn)方法本身誤差較大。
故實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和簡(jiǎn)便性有很大的提升空間。
2)PCR-SSP 主要原理設(shè)計(jì)出一套特異性針對(duì)各等位基因的引物，直接擴(kuò)增有序列差異的各等位基因特異性片斷，通過(guò)瓊脂糖電泳來(lái)判斷有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)確定基因的多態(tài)性。
主要實(shí)驗(yàn)流程 設(shè)計(jì)序列特異性引物→PCR→瓊脂糖凝膠電泳。
實(shí)驗(yàn)缺陷 不易自動(dòng)化；不能檢測(cè)新的等位基因并且準(zhǔn)確度有待提高。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定TAP等位基因的新方法。
本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案 一種SNPs組合鑒定TAP(抗原遞呈加工基因)等位基因的方法，包括下列步驟檢測(cè)待測(cè)樣本TAP基因上TAP1的第599、762、997、1910、1943和1983位點(diǎn)堿基的SNP分型獲得TAP1的SNP分型組合，或者檢測(cè)待測(cè)TAP基因上TAP2的第1308、1693和1951位點(diǎn)堿基的SNP分型獲得TAP2的SNP分型組合，根據(jù)TAP1或TAP2的SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型，確定TAP1或TAP2的等位基因分型。
樣本TAP基因來(lái)源于人外周血DNA，DNA可采用常規(guī)方法如鹽析法抽提。
上述TAP1的SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型按下表所示
上述TAP2的SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型按下表所示
本發(fā)明的原理為采用SNPs的組合特征確認(rèn)TAP等位基因分型。
本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為在分析了TAP基因上的SNPs分布和組成特點(diǎn)后，根據(jù)下述原則設(shè)計(jì)SNPs組合a.位點(diǎn)盡量集中，但不能靠得太近，以免引起引物和探針設(shè)計(jì)不便；b.位點(diǎn)所含多態(tài)信息量要多；c.選擇盡量少的位點(diǎn)，能覆蓋全部基因型。在分析并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，最終獲得兩組TAP等位基因分型的SNPs組合即TAP1的p599、p762、p997、p1910、p1943和p1983；TAP2的p1308、p1693和p1951，在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，無(wú)需按現(xiàn)有技術(shù)那樣檢測(cè)TAP上所有SNP位點(diǎn)，而僅需檢測(cè)上述組合中所列的SNP位點(diǎn)獲得SNP分型組合后即可確定TAP等位基因分型。
檢測(cè)SNPs組合中各SNP分型的方法可采用現(xiàn)有技術(shù)中的已知的檢測(cè)SNP分型的方法進(jìn)行，如針對(duì)組合中各SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出特異性針對(duì)該等位基因的引物，進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖電泳來(lái)判斷有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)確定SNP分型。
本發(fā)明還提供了改進(jìn)技術(shù)方案即采用Taq Man PCR技術(shù)檢測(cè)SNP分型。采用Taq Man PCR可極大地提高分型的靈敏度和準(zhǔn)確性，簡(jiǎn)化了操作步驟，且能鑒別出純雜合子情況，直接得出分型結(jié)果。
本發(fā)明實(shí)施例中，Taq Man PCR中所使用的引物及探針選自SEQ ID NO1-36。
本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的弊端，成功建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、高效和高通量的鑒定TAP等位基因的方法。



圖1TAP1上p599位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖2TAP1上p762位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖3TAP1上p997位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖4TAP1上p1910位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖5TAP1上p1943位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖6TAP1上p1983位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖7TAP2上p1308位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖8TAP2上p1693位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖 圖9TAP2上p1951位點(diǎn)Taq-Man PCR結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)TAP1和TAP2基因分型方案(Schemes) ①首先整理TAP1和TAP2基因序列上所有的突變位點(diǎn)。如表1和表2(數(shù)字代表單核苷酸在序列中的位置)。
表1
表2
②選擇合適的SNPs的原則a.位點(diǎn)盡量集中，但不能靠得太近，以免引起引物和探針設(shè)計(jì)不便；b.位點(diǎn)所含多態(tài)信息量要多；c.選擇盡量少的位點(diǎn)，能覆蓋全部基因型。
③綜合分析，最終選擇p599、p762、p997、p1910、p1943、p1983作為T(mén)AP1待檢測(cè)SNP位點(diǎn)；p1308、p1693、p1951作為T(mén)AP2待檢測(cè)SNP位點(diǎn)。
其SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型如下表所示 表3


為便于識(shí)別，上表采用不同的濃度的色塊代表不同的SNP分型，直觀地體現(xiàn)出本發(fā)明所選的TAP1的p599、p762、p997、p1910、p1943和p1983，以及TAP2的p1308、p1693和p1951覆蓋了所有的TAP基因分型。
實(shí)施例2 TAP1等位基因的鑒定實(shí)驗(yàn) 1)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn)來(lái)決定TAP1所有的多態(tài)性。位點(diǎn)分別為p599、p762、p997、p1910、p1943和p1983。分型Schemes如實(shí)施例1表3所示。
2)樣本X1、X2、Z3、X4、X5、X6來(lái)源于中國(guó)南方健康獻(xiàn)血員外周血DNA，均系無(wú)關(guān)供者。模板DNA由鹽析法制得。
3)TAP1檢測(cè)各SNP位點(diǎn)、SNP rs號(hào)、引物和探針序列，引物及探針由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI合成。
表4 4)Taq-Man PCR的反應(yīng)體系 引物和探針混合液(待檢SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物與探針的混合液) (引物的濃度為900nM，探針的濃度為200nM)0.125ul 2×PCR擴(kuò)增試劑盒(購(gòu)于ABI) 2.5ul 1×TE綬沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0) 1.875ul 模板 0.5ul(15ng/ul) 合計(jì) 5ul 5)Taq-Man PCR反應(yīng)參數(shù) 表5
5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 a.結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(Taq-Man PCR結(jié)果圖參見(jiàn)圖1-6)，與PCR-SSP(方法參考文獻(xiàn)M.L.Feng，D.Z.Liu，W.Shen，J.L.Wang，Z.H.Guo，X.Zhang，K.M.Du，K.C.Qian& T.M.Zhao(2006)Establishment ofan HPA-1-to-16-typed platelet donor registry in China.Transfusion Medicine 16369-374.)檢測(cè)結(jié)果相符。
表6


實(shí)施例3 TAP2等位基因的鑒定實(shí)驗(yàn) 1)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3個(gè)位點(diǎn)來(lái)決定TAP2所有的等位基因。位點(diǎn)分別為p1308，p1693和p1951。分型Schemes如實(shí)施例1表3所示。
2)樣本X1、X2、Z3、X4、X5、X6來(lái)源于中國(guó)南方健康獻(xiàn)血員外周血DNA，均系無(wú)關(guān)供者。模板DNA由鹽析法制得。
3)TAP2檢測(cè)各SNP位點(diǎn)、SNP rs號(hào)、引物和探針序列，引物及探針由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI合成。
表7 3)Taq-Man PCR的反應(yīng)體系 引物和探針混合液(待檢SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物與探針的混合液) (引物的濃度為900nM，探針的濃度為200nM)0.125ul 2×PCR擴(kuò)增試劑盒(購(gòu)于ABI) 2.5ul TE綬沖液 1.875ul 模板 0.5ul(15ng/ul) 合計(jì) 5ul 4)Taq-Man PCR反應(yīng)參數(shù) 表8
5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 a.結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(Taq-Man PCR結(jié)果見(jiàn)圖7-9)，與PCR-SSP檢測(cè)結(jié)果相符。
表9


序列表
權(quán)利要求
1.一種SNPs組合鑒定TAP等位基因的方法，包括下列步驟檢測(cè)待測(cè)樣本TAP基因上TAP1的第599、762、997、1910、1943和1983位點(diǎn)堿基的SNP分型獲得TAP1的SNP分型組合，或者檢測(cè)待測(cè)TAP基因上TAP2的第1308、1693和1951位點(diǎn)堿基的SNP分型獲得TAP2的SNP分型組合，根據(jù)TAP1或TAP2的SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型，確定TAP1或TAP2的等位基因分型。
2.如權(quán)利要求1所述SNPs組合鑒定TAP等位基因的方法，其特征在于，所述TAP1的SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型按下表所示
3.如權(quán)利要求1所述SNPs組合鑒定TAP等位基因的方法，其特征在于，所述TAP2的SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型按下表所示
4.如權(quán)利要求1或2或3所述SNPs組合鑒定TAP等位基因的方法，其特征在于，采用TaqMan PCR檢測(cè)SNP分型。
5.如權(quán)利要求4所述SNPs組合鑒定TAP等位基因的方法，其特征在于，所述Taq Man PCR中所使用的引物及探針選自SEQ ID NO1-36。
全文摘要
本發(fā)明涉及等位基因的鑒定方法，公開(kāi)了SNPs組合鑒定TAP等位基因的方法，包括下列步驟檢測(cè)待測(cè)樣本TAP基因上TAP1的第599、762、997、1910、1943和1983位點(diǎn)堿基的SNP分型獲得TAP1的SNP分型組合，或者檢測(cè)待測(cè)TAP基因上TAP2的第1308、1693和1951位點(diǎn)堿基的SNP分型獲得TAP2的SNP分型組合，根據(jù)TAP1或TAP2的SNP分型組合對(duì)應(yīng)的等位基因分型，確定TAP1或TAP2的等位基因分型。本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單易操作的鑒定TAP的多態(tài)性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101250587SQ200810035190
公開(kāi)日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月26日
發(fā)明者馮明亮 申請(qǐng)人:上海市血液中心