專利名稱：與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記，具體是與黃瓜果瘤基因r"緊密 連鎖的分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumis sativus L.)是葫盧科(Cucurbitaceae) —年蔓生的草本 植物，原產(chǎn)溫暖濕潤(rùn)的喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)，傳入我國(guó)栽培已有2000 多年的歷史，我國(guó)是黃瓜的次生起源中心。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之 一，也是我國(guó)主栽蔬菜作物之一。
果實(shí)是黃瓜經(jīng)濟(jì)性狀最重要的部分，黃瓜果實(shí)屬于瓠果，由子房和花托共 同發(fā)育而成。在黃瓜果實(shí)上有一個(gè)重要的性狀是果瘤，果瘤是黃瓜果實(shí)表面的瘤 狀突起。果瘤基因的研究始于1913年，有果瘤是黃瓜的野生性狀，果瘤性狀是 由化(Tuberculate fruit)基因調(diào)控，有果瘤(為顯性，無(wú)果瘤(7W為 隱性。在經(jīng)典遺傳圖譜上，果瘤基因(7U Tuberculate fruit)和無(wú)光澤果皮 基因(D)及一致果皮顏色基因(u， uniform immature fruit color)緊密連鎖 在一起，并且和薄皮基因(Te， tender skin of fruit)、小刺基因(ss， small spines)在同一個(gè)連鎖群上。2007年王桂玲對(duì)黃瓜果瘤性狀進(jìn)行了遺傳分析并 通過(guò)BSA法獲得兩個(gè)同果瘤基因連鎖的SSR標(biāo)記，遺傳距離為20. OcM和14. lcM (王桂玲等.黃瓜果瘤的遺傳及SSR標(biāo)記.植物學(xué)通報(bào)，2007, 24(2) :168-172)。 目前對(duì)于黃瓜果瘤性狀的研究報(bào)道很少。
黃瓜育種中發(fā)現(xiàn)黃瓜果實(shí)均有刺，但是有些品種果實(shí)上沒(méi)有果瘤，刺和瘤
是兩個(gè)不同的性狀，刺的形成是由w基因決定的，而r"基因決定瘤的形成，雖
然刺和瘤性狀是由不同的基因決定的，但有研究表明刺對(duì)于瘤具有隱性上位作 用，曹辰興用無(wú)毛黃瓜的花粉給普通有毛黃瓜的有刺無(wú)瘤(7iy7")自交系授粉， 子一代植株果實(shí)表面有刺有瘤，通過(guò)分離群體的遺傳分析結(jié)果表明控制莖、葉、 果實(shí)表皮毛性狀的無(wú)毛基因?qū)刂乒鲂誀畹墓龌虼嬖陔[性上位作用(曹辰興等.黃瓜莖葉無(wú)毛性狀與果實(shí)瘤刺性狀的遺傳關(guān)系.園藝學(xué)報(bào)，2001， 28(6): 565-566)。因此，果瘤基因r"的研究將有助于揭示黃瓜果刺基因形成的分子機(jī) 制，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎(chǔ)。
隨著生物技術(shù)水平的不斷發(fā)展，克隆目的基因的方法也層出不窮，圖位克 隆方法是其中一種可以在基因產(chǎn)物未知的情況下，克隆目的基因比較好的方法， 圖位克隆技術(shù)是根據(jù)功能基因在基因組中的位置進(jìn)行，在利用分離群體的遺傳連 鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的一個(gè)具體位置的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建高 密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn) 而克隆該基因。但是由于黃瓜的基因組學(xué)研究較落后，至今沒(méi)有在黃瓜上成功利 用圖位克隆方法克隆基因的例子，其最主要原因是不能有效獲得與目標(biāo)基因緊密 連鎖的分子標(biāo)記。利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位，首先必須找到與該性狀緊密連鎖 的分子標(biāo)記。SRAP(sequence-related amplified polymorphism)標(biāo)記具有穩(wěn)定 性好、多態(tài)性高和廣泛適用的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該標(biāo)記的最大優(yōu)點(diǎn)是較RAPD、 AFLP等 標(biāo)記容易找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。找到與果瘤基因化緊密連鎖的 標(biāo)記，可為下一步圖位克隆這個(gè)基因打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
黃瓜的果瘤是模式植物擬南芥和水稻等所不具有的性狀，在黃瓜的育種上 是重要的性狀之一。隨著人們生活水平的提高，品質(zhì)育種已提到重要位置。黃瓜 果實(shí)剌瘤性狀屬于感觀品質(zhì)范疇。歐美溫室類型的黃瓜為無(wú)果瘤、少刺的果皮， 稱其為水果黃瓜，其市場(chǎng)價(jià)格為普通黃瓜的2-3倍。外觀光滑黃瓜污染少，清洗 方便，食用衛(wèi)生，是無(wú)公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測(cè)表明無(wú)瘤少刺黃瓜果肉農(nóng) 藥殘留量比有刺黃瓜低27%，果皮農(nóng)藥殘留量低18%。黃瓜果瘤基因r"控制果 瘤的形成，它的研究將會(huì)推動(dòng)品質(zhì)育種進(jìn)程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記 進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中是十分有效的方法，分子標(biāo)記是在DNA水平 上對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)，可在苗期 進(jìn)行選擇，加快了育種的進(jìn)程。r"基因的精細(xì)定位將有助于建立相應(yīng)的分子標(biāo) 記輔助選擇系統(tǒng)，同時(shí)利用建成的BAC文庫(kù)，進(jìn)一步克隆決定果瘤形成的基因， 也有助于揭示果瘤形成的分子機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供與黃瓜果瘤基因"緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明利用分子標(biāo)記和BSA(Bulked Segregant Analysis)法， 提供兩個(gè)與黃瓜果瘤基因仏緊密連鎖的SRAP標(biāo)記；其次提供兩個(gè)與黃瓜果瘤基 因緊密連鎖的穩(wěn)定SCAR標(biāo)記，以便分子標(biāo)記輔助育種體系的建立。本發(fā)明的分 子標(biāo)記可簡(jiǎn)便、快速、高通量地應(yīng)用于育種實(shí)踐。 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及的第一種與黃瓜果瘤基因乃緊密連鎖的分子標(biāo)記是一個(gè)SRAP 標(biāo)記，由SRAP引物(ME6和EM9) PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具 有序列表中SEQ ID NO. 1中738個(gè)核苷酸序列。
所述引物ME6，具體為5， -TGAGTCCAAACCGGTAA-3，。 所述引物EM9，具體為5， -GACTGCGTACGAATTGAT-3，。 本發(fā)明涉及的第二種與黃瓜果瘤基因化緊密連鎖的分子標(biāo)記是一個(gè)SRAP 標(biāo)記，由上游引物(C_SC69-F)和下游引物(C_SC69-R)組成，并包括上游和下 游引物PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO. 2 中218個(gè)核苷酸序列。
所述引物C—SC69-F，具體為5， -TTCCGAAAGCAGGAGAGTCAAT-3，。 所述引物C—SC69-R具體為5， -GCCAGATTTGGTATATCAAACAG-3'。 本發(fā)明涉及的第三種與黃瓜果瘤基因化緊密連鎖的分子標(biāo)記是一個(gè)SRAP 標(biāo)記，由SRAP引物(ME2和EM4) PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具 有序列表中SEQ ID NO. 3中535個(gè)核苷酸序列和SEQ ID NO. 4中476個(gè)核苷酸序 列；其中535個(gè)核苷酸的片段與有果瘤基因r"連鎖，476個(gè)核苷酸的片段與無(wú) 果瘤基因71/連鎖。
所述引物ME2，具體為5' -TGAGTCCAAACCGGAGC-3'。 所述引物EM4，具體為5， - GACTGCGTACGAATTTGA-3，。 本發(fā)明涉及的第四種與黃瓜果瘤基因化緊密連鎖的分子標(biāo)記是一個(gè)SRAP 標(biāo)記，由上游引物(C—SC24-F)和下游引物(C一SC24-R)組成，并包括上游和下 游引物PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO. 5 中514個(gè)核苷酸序列和SEQ ID NO. 6中455個(gè)核苷酸序列；其中514個(gè)核苷酸的 片段與有果瘤基因化連鎖，455個(gè)核苷酸的片段與無(wú)果瘤基因化連鎖。 所述引物C—SC24-F具體為5， -CCGGAGCTGTGTAATGGAAGAA -3，。
6所述引物C—SC24-R具體為5， -AATTTGAGATATAACCTACGTGA -3，。 本發(fā)明用有果瘤親本S52和無(wú)果瘤親本S06雜交獲得Fl， Fl再自交獲得F2 分離群體，通過(guò)BSA法從分離群體中分別隨機(jī)選取有果瘤株和無(wú)果瘤株個(gè)體各 10株，建立有瘤池和無(wú)瘤池，采用SRAP分子標(biāo)記結(jié)合BSA方法，篩選黃瓜果瘤 基因連鎖分子標(biāo)記；獲得兩個(gè)SRAP標(biāo)記ME6EM9和ME2EM4，其中標(biāo)記ME6EM9具 有序列表中SEQ ID NO. 1中738個(gè)核苷酸序列，標(biāo)記ME2EM4具有序列表中SEQ ID NO. 3中535個(gè)核苷酸序列和SEQ ID NO. 4中476個(gè)核苷酸序列；經(jīng)連鎖分析發(fā) 現(xiàn)這兩個(gè)標(biāo)記與黃瓜果瘤基因緊密連鎖，其遺傳距離分別是2.8cM和3.2cM;隨 后將ME6EM9和ME2EM4標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，分別命名為C_SC69和 C_SC24，其中標(biāo)記C_SC69具有序列表中SEQ ID NO. 2中218個(gè)核苷酸序列，標(biāo) 記C—SC24具有序列表中SEQ ID NO. 5中514個(gè)核苷酸序列和SEQ ID NO. 6中455 個(gè)核苷酸序列。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果傳統(tǒng)的育種方法是根據(jù)植物 的形態(tài)來(lái)進(jìn)行選擇，由于黃瓜果瘤性狀需要植株結(jié)瓜時(shí)才能確定，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)， 本發(fā)明的分子標(biāo)記可在植物種子期間或子葉長(zhǎng)出的早期階段就可鑒定，即省時(shí)也 準(zhǔn)確，所以可用于黃瓜分子標(biāo)記輔助育種，加速黃瓜品質(zhì)育種的進(jìn)程。
本發(fā)明中涉及的E.coli DH5ci菌株已在文獻(xiàn)《李欣，楊坤寧，劉志勇，陳 紅兵.電轉(zhuǎn)化法制備高轉(zhuǎn)化效率的E.coli感受態(tài)細(xì)胞研究.食品與生物技術(shù)學(xué) 報(bào)，2007， 26 (6) 48-51》中公開(kāi)，本發(fā)明中涉及的E.coli DH5 a菌株可通過(guò) 公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得，購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，公司地址經(jīng)濟(jì) 技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)東北二街19號(hào)。


圖1為SRAP標(biāo)記ME6EM9轉(zhuǎn)化顯性的SCAR標(biāo)記C_SC69對(duì)兩個(gè)親本、兩個(gè) 基因池和組成基因池20個(gè)單株的檢測(cè)結(jié)果；
圖2為SRAP標(biāo)記ME2EM4轉(zhuǎn)化共顯的SCAR標(biāo)記C一SC24對(duì)兩個(gè)親本、兩個(gè) 基因池和組成基因池20個(gè)單株的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。 實(shí)施例1
步驟一，r"基因緊密連鎖SRAP標(biāo)記的獲得 1、 F2群體的構(gòu)建
歐洲溫室類型自交系S06(母本)，表面光滑無(wú)果瘤，白刺較細(xì)小；華南類型 自交系S52(父本)，表面有果瘤，黑刺較粗大，S06自交系和S52自交系已在《自 然科學(xué)進(jìn)展》2005年"黃瓜SRAP遺傳連鎖圖的構(gòu)建及始花節(jié)位的基因定位" 一文中公開(kāi)(潘俊松等.黃瓜SRAP遺傳連鎖圖的構(gòu)建及始花節(jié)位的基因定位. 自然科學(xué)進(jìn)展，2005， 15， 167-172)。本實(shí)施例利用這兩個(gè)親本配制了雜交組合， F,為有果瘤，黑刺較粗大，&代自交產(chǎn)生&代群體。在247株F2個(gè)體中，鑒定有 /無(wú)果瘤表型，卡方分析法進(jìn)行驗(yàn)證。
2 、 7"基因緊密連鎖SRAP標(biāo)記的篩選
① 黃瓜基因組DNA的提取
用CTAB法提取親本及F2分離群體的葉片總DNA。方法為取兩片真葉展開(kāi) 時(shí)的葉片在液氮中快速研磨成粉末狀，放于1. 5ml的離心管中；加入預(yù)熱的500W CTAB提取緩沖液，6(TC水浴0.5h-lh;加入等體積氯仿異戊醇，其中氯仿與異 戊醇的體積比為24: 1，混勻后12000r/min 4°C離心10min;將上清液轉(zhuǎn)入新 的離心管，加等體積異丙醇，輕輕混勻，冰浴0.5h以上；12000r/min 4°C離心 10min;倒去上清液，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇沖洗沉淀兩次，干燥后，加入TE 緩沖液150W溶解后，加入10yg/ml的RNA酶去除RNA， 37。C水浴30min;在 0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以50ng/ul的ADNA為標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)所得DNA的濃度；后 用TE稀釋終濃度為30ng/ul，存于-2(TC備用。
② 有果瘤(r"—)和無(wú)果瘤(7bru)基因池建立
BSA法從F2分離群體中分別隨機(jī)選取有果瘤株和無(wú)果瘤株個(gè)體各10株，建 立有瘤和無(wú)瘤(7"71/)黃瓜的基因池。
③ SRAP標(biāo)記的篩選
用736對(duì)SRAP引物組合對(duì)兩個(gè)親本及兩個(gè)基因池進(jìn)行篩選，引物合成。 SRAP反應(yīng)體系為基因組DNA 30 ng，引物0. 5陶ol/L， 200 Wnol/L d鮮s， 2隱ol/LMgCl2， lp 1 10XPCR reactions buffer, 0. 6 U TaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為 IOW，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公司。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 °C 3 min ; 94 °C 30 s; 35 °C 30s; 72 °C lmin， 8個(gè)循環(huán)；94 °C 30 s; 50 °C 30 s; 72°C lmin， 35個(gè)循環(huán)；72°C 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用4%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分 離，電泳緩沖液為1XTBE， 50 W恒功率，電泳1.5h-2h。
電泳后進(jìn)行銀染。銀染方法為將帶膠的玻璃板放入固定液中，在搖床上 輕輕搖動(dòng)至指示劑顏色褪去，其中固定液的組成為冰醋酸、無(wú)水乙醇、蒸餾水 的體積比為1:10:100;用超純水洗lmin-3min;將沖洗后的膠板放入染色液中搖 動(dòng)半小時(shí)，其中染色液的組分為2g/L硝酸銀；將染色后的膠板放入超純水中漂 洗5s后放入裝有顯影液的塑料盒中，輕輕搖動(dòng)至條帶清晰，放入自來(lái)水中沖洗 3min;室溫下干燥，干燥后拍照，其中顯影液是在1L蒸餾水中加入15g NaOH 和3ml甲醛混勻得到的。
SRAP標(biāo)記分析有瘤和無(wú)瘤基因池的差異片段得到兩個(gè)SRAP標(biāo)記ME6EM9和 ME2EM4，結(jié)果ME6EM9標(biāo)記在親本和池之間表現(xiàn)出相同的多態(tài)性，即有瘤親本S52 和有瘤基因池中有條帶，無(wú)瘤親本S06和無(wú)瘤基因池沒(méi)有條帶；而ME2EM4為共 顯性標(biāo)記，有兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物535bp和476bp， 535bp與T" allele連鎖，476bp 與allele連鎖。通過(guò)247株&群體進(jìn)行連鎖分析，將與有瘤親本S52的帶 型一致的個(gè)體計(jì)為1，將與無(wú)瘤親本S06帶型一致的個(gè)體計(jì)為2，雜合記為3， 缺失數(shù)據(jù)計(jì)為0，通過(guò)Mapmaker3. 0軟件計(jì)算，結(jié)果這兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與r"基 因緊密連鎖，連鎖距離分別是2.8cM和3.2cM，其中L0D^3. 0，采用Kosambi 函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳圖距。
步驟二 ，乃基因緊密連鎖的SRAP標(biāo)記轉(zhuǎn)化SCAR標(biāo)記
1、 SRAP標(biāo)記的多態(tài)性片段的回收、克隆和測(cè)序
將多態(tài)性片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下，置于離心管中，用槍頭搗碎，加 入超純水沖洗三遍，然后加入10ul超純水95。C水浴15min，快速離心取上清液， 用相對(duì)應(yīng)的SRAP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為目標(biāo)條帶DNA5pl，引 物0.5umol/L， 200umol/L dNTPs， lXTaq Buffer, 1. 5誦ol/L MgCl2， 2U Taq DNA聚合酶，總反應(yīng)體系為50ul，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公司。目標(biāo) 條帶PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5 min; 35cycles， 94°C 30s; 50°C 30s; 72°C lmin;
972°C 5 min。將PCR產(chǎn)物中加入goldview熒光染料1， 4。C下放置10min讓 染料同DNA結(jié)合，然后加入上樣緩沖液2y 1，混勻后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分 離，在紫外燈下切下目標(biāo)片段放入1.5ml的離心管中，用DNA回收試劑盒回收， 其中DNA回收試劑盒為上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號(hào)為 Cat. No. SKI 132。將回收產(chǎn)物與載體連接采用上海申能博彩公司的pUCm-T vector 系統(tǒng)。用電擊法將連有目標(biāo)片段的T-vector轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞， 將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，涂好的平板倒置于37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng) 過(guò)夜，挑菌、搖菌及PCR菌液檢測(cè)，進(jìn)行相關(guān)序列的測(cè)定。
2、 SCAR標(biāo)記的設(shè)計(jì)與分析
①SRAP標(biāo)記ME6EM9轉(zhuǎn)化為顯性的SCAR標(biāo)記
根據(jù)測(cè)序結(jié)果，即序列表中SEQ IDNO. 1，設(shè)計(jì)SCAR引物，該引物為 5' -CTTTCCGGTAACTGAAGTTATTGC-3'， 5' -ACGAATTGATATTGAAGAAGATGCT-3'， 該引物由上海生工合成。
應(yīng)用這對(duì)引物對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行退火溫度梯度篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在47C-70°C 范圍內(nèi)變換不同的退火溫度都不能使這對(duì)引物在親本和池間有多態(tài)性，因此為了 能轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，本發(fā)明采用基于BAC文庫(kù)的PCRWalking的方法，華北類型有 果瘤品種S94用于文庫(kù)的構(gòu)建，該文庫(kù)包含大約19， 200 Hind III克隆。首先用上 面這對(duì)引物組合篩選BAC文庫(kù)，獲得含有目標(biāo)片段的單克隆，委托上海人類基因 組研究中心進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果獲得目標(biāo)DNA片段兩側(cè)的約lkb的序列，通過(guò)獲得 與標(biāo)記相鄰的兩翼序列，在兩親本間尋找序列上的差異，包括lbp插入/缺失和2bp 差異，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。
引物序列為
C—SC69-F: 5' -TTCCGAAAGCAGGAGAGTCAAT-3'， C—SC69-R: 5' -GCCAGATTTGGTATATCAAACAG-3，。
用新的SCAR引物對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行退火溫度梯度篩選，在55'C-6rC范圍內(nèi)， 兩個(gè)親本擴(kuò)增出相同的條帶，在62'C-64'C范圍內(nèi)，兩個(gè)親本之間表現(xiàn)為多態(tài)性， 即有瘤親本S52有一條218bp的擴(kuò)增條帶，序列見(jiàn)序列表中SEQ ID NO. 2，而無(wú) 瘤親本在相同的位置沒(méi)有擴(kuò)增條帶，進(jìn)一步用這個(gè)SCAR標(biāo)記在兩親本、兩基因池及F2群體247個(gè)單株進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，PCR體系基因組DNA30ng，引 物O. 2Mmol/L， 200 Mmol/L dNTPs， 2mmol/LMgCl2， lXTaq緩沖液，0. 5 U TaqDNA 聚合酶，總反應(yīng)體系為10叱，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公司。SCAR的 擴(kuò)增程序?yàn)?4。C 3min; 35cycles， 94°C 20s， 63°C 20s， 72°C 20s; 72°C 5min， 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果。圖1中，其中，M為DL2000 maker, PN為無(wú)瘤 親本S06， PT為有瘤親本S52, BN為無(wú)瘤池，BT為有瘤池。
如圖1所示，轉(zhuǎn)化的SCAR標(biāo)記在兩親本、兩基因池及組成基因池的20單 株中的擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，通過(guò)F2分離群體分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的SCAR 標(biāo)記與相對(duì)應(yīng)的SRAP標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果沒(méi)有差異，通過(guò)Mapmaker3. 0軟件計(jì)算，連 鎖距離為2. 8cM，將這個(gè)標(biāo)記命名為C—SC69。
②SRAP標(biāo)記ME2EM4轉(zhuǎn)化為共顯的SCAR標(biāo)記
SRAP標(biāo)記ME2EM4為共顯標(biāo)記，有兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物約535bp和476bp， 535bp (序列為序列表中SEQ ID NO. 3)與71" allele連鎖，476bp (序列為序列表中 SEQ ID NO. 4)與7" allele連鎖。通過(guò)DANMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果分析表明兩親本 之間核苷酸序列相差59bp，根據(jù)測(cè)序比較結(jié)果，將引物設(shè)計(jì)在兩親本間包含多 態(tài)性區(qū)段的兩端，引物序列為
C—SC24-F: 5， -CCGGAGCTGTGTAATGGAAGAA -3，，
C_SC24-R: 5' -AATTTGAGATATAACCTACGTGA -3，。
用新的SCAR引物對(duì)兩個(gè)親本進(jìn)行退火溫度梯度篩選，在52'C-63。C范圍內(nèi)， 兩個(gè)親本之間都表現(xiàn)為多態(tài)性，即有瘤親本S52有一條514bp(序列為序列表中 SEQIDN0.5)左右的擴(kuò)增條帶，而無(wú)瘤親本有一條455bp(序列為序列表中SEQ ID N0.6)左右的擴(kuò)增條帶。進(jìn)一步用這個(gè)SCAR引物對(duì)兩親本、兩基因池及&群體 247個(gè)單株進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，PCR體系基因組DNA30ng，引物0.2Mmol/L， 200陶ol/L dNTPs， 2隨1/L MgCl" lXTaq緩沖液，0. 5 U TaqDNA聚合酶，總 反應(yīng)體系為10吣，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公司。SCAR的擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min; 35cycles， 94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 30s; 72°C 5rain， 3%瓊脂糖 凝膠電泳顯示結(jié)果。
如圖2所示，M為DL2000 maker， PN為無(wú)瘤親本S06， PT為有瘤親本S52， BN為無(wú)瘤池，BT為有瘤池；轉(zhuǎn)化的SCAR標(biāo)記在兩親本、兩基因池及組成基因池的20單株中的擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果條帶清晰穩(wěn)定，并且與相對(duì)應(yīng)的SRAP引物擴(kuò)增結(jié) 果完全對(duì)應(yīng)，通過(guò)Mapmaker3.0軟件計(jì)算，連鎖距離為3. 2cM,將這個(gè)標(biāo)記命名 為C—SC24。 SC69和SC24是兩個(gè)SCAR標(biāo)記，因此在今后的分子標(biāo)記輔助育種中， 具有穩(wěn)定和使用方便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可以將兩標(biāo)記篩選黃瓜BAC文庫(kù)，通過(guò)BAC 末端測(cè)序得到連鎖距離更近的分子標(biāo)記，將有助于黃瓜有瘤基因的圖位克隆。序列表
<110>上海交通大學(xué)
<120>與黃瓜果瘤基因7i/緊密連鎖的分子標(biāo)記 <160> 6 <210> 1 <211> 738 <212〉隨
<213〉黃瓜(Cuc咖is sativus L ) <400> 1
TGAGTCCTTTCCGGTMCTGMGTTATTGCCMTATACAAAGCGAAGATGAGMMCCAT60
TAGATGCTATAGCAACGATATCATAGGMTGMCTCGMCMGATGGAGAGTCTCTTTTC120
TCAMGGAAAAGACCATGTTATATTGACGAAATTGAAAGAGGAGTCTGTATTCMCTCCT180
TGGCTGTTTGATGTACCAAATCTGGCGCGAMTMTCGTCCGTCTTATTCTTGTMTTCG240
GTCTCGATGTTCTTCGACTGCTGTTCMTGCAGATCTTGGATTCAACAGATMACATCAT300
CATCCTGTTCCCATTTCCTCCATAGTTTATCCCCTTTGGGAGGMTTCCAGGACCTCCCA360
CATTMTTCTGT嵐TTGTTTTTGTAATCATAMAGGTAAGTTMTCGCACCTTCATTTC420
TTCCGTCTGACTCTGAGATGATTGTCTTAGATTCAGACATGAGGMGTTTGGTGGAGTGG480
GGAAMCTTCAATGGCATTTACAMCGCAATAGACGAAGATTTAGGCACAMCACTATAC540
G嵐TTTTCCAGTTTTCAAACTCAGGMGAATTCCTTMCCGAAGCAGCTTCGGTGGCAT600
TMCATCTTTGAGAAGGACAMCCCAGAAGCCGAAACACCGMMGAGCAGAGATAAATC660
GGCCGTGAAATTAGAAGGAGTGAAATGAAGTCGTACMTATAAAAAGCATCTTCTTCMT720
ATCMTTCGT ACGCAGTC 738
<210> 2 〈211〉 218 <212>腿
<213>黃瓜(Cucumis sativus L.) <400> 2
TTCCGMAGC AGTGAGTCCT TTCCGGTMC TGAGAMACC ATTAGATGCT ATAGCAACGA GAGTCTCTTT TCTCMAGGA嵐GACCATG TATTCMCTC CTTGGCTGTT TGATGTACCA
TGMGTTATT GCCAATATAC磁GCGAAGA 60
TATCATAGGA ATGMCTCGA ACMGATGGA 120
TTATATTGAC GAAATTGAAA GAGGAGTCTG 180 MTCTGGC 218
<210> 3 <211> 535 <212> DNA<213>黃瓜(Cucumis sativus L ) <400> 3
TGAGTCCMACCGGAGCTGTGTMTGGMGAMACMMGTTTAGAGTGAMTAMTMA60
ATGCACATAGMTCGAGTATTTCMAATTGTGTTATTTTTATCGMGTGAAMCMTACT120
TGTATTGAATGGTAAATAAAMCCMCCACTMTGCCCTAACMTATCMTMCACAGAC180
TTCAAAAAATTTCAACTATTTCACTAGGCCAATMCTCMGTTCACAMAACATACT嵐240
ATTTGTATGGATGACCCAAAMTTGAGCCTAAAATGCCATTGACCCGMTTAAAMMTA300
TACATATGTACATATATATATATCTMATGACATGACTCTMGAAATMCAAAACTMTT360
ACAATAGGTATGCTMCCTAATTAAATMTCTTGCAGTTAATCGGTTTAAGTTMGMCT420
ATAAAAATTAAGTGTATTTCATAAATCAMATTTATCATTGCTATGGCMTAATTMTAG480
AGGGAGATGAATCAAGCTMCTCACGTAGGTTATATCTCAMTTCGTACGCAGTC 535
<210> 4
<211> 476
<212> ■
<213>黃瓜(Cucumis sativus L )
<400〉 4
TGAGTCCAAACCGGAGCTGTGTMTGGMGMAACMMGTTTAGAGTGAMT嵐T嵐60
ATGCACATAGMTCGAGTACACTTCAAAATTGTGTTATTTTTATCGMGTGMAACMTA120
CTTGTATTGAATGGT嵐TAMMCCMCCACTMTGCCCTMCMTATCMTAACACAG180
ACTTCAMAAATTTCMCTATTTCACTAGGCCMTMCTCMGTTCGCMMACATACTA240
AAATTTGTATGGATGACCCAAAAATTGAGCCT嵐ATGCCATTGACCCGAATTAAAAAAA300
TTTACATATATCTAAATGACATGACTCTMGAMTMCMMCTAATTACMTAGGTATG360
CTAACCTAATTAAATAATCTTGCAGTTAATCGGTTTAAGTTMGAACTATMCTCACGTA420
GAGGGAGATGAATCAAGCTAACTCACGTAGGTTTTATCTCAAATTCGTACGCAGTC 476
<210> 5
<211> 514
<212>腿
〈213〉黃瓜(Cucumis sativus L )
<400> 5
CCGGAGCTGTGTMTGGMGMAACAMAGTTTAGAGTGAMTAMTMAATGCACATAG60
MTCGAGTATTTCMAATTGTGTTATTTTTATCGAAGTGAAMCMTACTTGTATTGAAT120
GGTAAATAAAAACCAACCACTAATGCCCTAACAATATCAATMCACAGACTTCAAAAAAT180
TTCAACTATTTCACTAGGCCMTMCTCMGTTCACAAAAACATACT嵐ATTTGTATGG240
ATGACCCAAAAATTGAGCCTMAATGCCATTGACCCGMTTAAAAAMTATACATATGTA300
CATATATATATATCTMATGACATGACTCTMGAAATMCAAAACTAATTACMTAGGTA360
TGCTMCCTAATTAAATMTCTTGCAGTTAATCGGTTTAAGTTAAGAACTATAAMATTA420
AGTGTATTTCATAAATCAMATTTATCATTGCTATGGCAATMTTAATAGAGGGAGATGA480
ATCAAGCTAACTCACGTAGGTTATATCTCAMTT 514
14<211> 455
〈212〉 DNA
<213>黃瓜(Cucumis sativus L )〈400〉 6
CCGGAGCTGTGTMTGGMGAAMCAMAG
AATCGAGTACACTTCAAAATTGTGTTATTT
ATGGT嵐TAAAMCCMCCACTMTGCCC
ATTTCMCTATTTCACTAGGCCMTAACTC
GGATGACCCAAAAATTGAGCCT嵐ATGCC
TCTAAATGACATGACTCTMG嵐TMCM
T嵐TMTCTTGCAGTTMTCGGTTTMGT
MTCMGCTAACTCACGTAGGTTTTATCTC
TTTAGAGTGA MTAAATAAA ATGCACATAG 60
TTATCGMGT GAAMCMTA CTTGTATTGA 120
TMCMTATC MTMCACAG ACTTCAAAM 180
MGTTCGCAA AAACATACTA AAATTTGTAT 240
ATTGACCCGA ATTMAAAAA TTTACATATA 300
MCTAATTAC MTAGGTATG CTMCCTAAT 360
TAAGAACTAT MCTCACGTA GAGGGAGATG 420 嵐TT 45權(quán)利要求
1、一種與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，由SRAP引物ME6和EM9經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQIDNO.1中738個(gè)核苷酸序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與黃瓜果瘤基因乃緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征在于，所述SRAP引物具體為ME6: 5' -TGAGTCCAAACCGGTAA-3， ； EM9: 5， -GACTGCGTACGAATTGAT-3'。
3、 一種與黃瓜果瘤基因化緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，上游引物 C—SC69-F和下游引物C一SC69-R組成，并包括上游和下游引物PCR擴(kuò)增得到的核 苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID N0.2中218個(gè)核苷酸序列。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的與黃瓜果瘤基因化緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征在于，所述引物C—SC69-F，具體為5， -TTCCGAAAGCAGGAGAGTCAAT-3，。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的與黃瓜果瘤基因r"緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征在于，所述引物C—SC69-R具體為5' -GCCAGATTTGGTATATCAAACAG-3'。
6、 一種與黃瓜果瘤基因7"緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，由SRAP引 物(ME2和EM4) PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO. 3中535個(gè)核苷酸序列和SEQ ID NO. 4中476個(gè)核苷酸序列；其中535個(gè)核 苷酸的片段與有果瘤基因化連鎖，476個(gè)核苷酸的片段與無(wú)果瘤基因n/連鎖。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的與黃瓜果瘤基因71/緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征在于，所述SRAP引物具體為ME2: 5， -TGAGTCCAAACCGGAGC-3， ; EM4: 5，-GACTGCGTACGAATTTGA-3，。
8、 一種與黃瓜果瘤基因n/緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，由上游引物 C一SC24-F和下游引物C一SC24-R組成，并包括上游和下游引物PCR擴(kuò)增得到的核 苷酸序列，該核苷酸序列具有序列表中SEQ ID NO. 5中514個(gè)核苷酸序列和SEQ ID NO. 6中455個(gè)核苷酸序列；其中514個(gè)核苷酸的片段與有果瘤基因71/連鎖，455個(gè)核苷酸的片段與無(wú)果瘤基因r"連鎖。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的與黃瓜果瘤基因7"緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征在于，所述引物C—SC24-F具體為5' -CCGGAGCTGTGTAATGGAAGAA -3'。
10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的與黃瓜果瘤基因7b緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特 征在于，所述引物C—SC24-R具體為5' -MTTTGAGATATAACCTACGTGA -3'。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明先得到兩個(gè)SRAP標(biāo)記，其中標(biāo)記ME6EM9具有序列表中SEQ ID No.1中的序列，標(biāo)記ME2EM4具有序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中的序列；將ME6EM9和ME2EM4轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，分別為C_SC69和C_SC24。C_SC69為顯性標(biāo)記，擴(kuò)增SEQ ID No.2中的218bp產(chǎn)物；C_SC24為共顯性標(biāo)記，有兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物分別為SEQ ID No.5中的514bp和SEQ ID No.6中的455bp產(chǎn)物。本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于黃瓜果瘤性狀的輔助選擇育種，加速黃瓜品種育種的進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101481737SQ200910045048
公開(kāi)日2009年7月15日 申請(qǐng)日期2009年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月8日
發(fā)明者何歡樂(lè), 姚丹青, 張微微, 潘俊松, 潤(rùn) 蔡 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)