參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應(yīng)用，它是首次在黃瓜基因組中發(fā)現(xiàn)的控制苦味合成的兩個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子（Csa5G157230和Csa5G156220）之一，兩個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子分別在果實(shí)和葉片中控制苦味的形成。利用酵母單雜交、凝膠組織體系和煙草瞬時(shí)表達(dá)證明了這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到與苦味合成啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并激活合成基因的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)在無(wú)苦味的黃瓜葉片或果實(shí)中大量表達(dá)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子能夠恢復(fù)黃瓜植株的苦味性狀。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了黃瓜苦味形成的分子機(jī)制，為無(wú)苦味黃瓜育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜的苦味是由一類(lèi)稱為葫蘆素C的三萜化合物導(dǎo)致的。黃瓜果實(shí)中積累葫蘆素C會(huì)嚴(yán)重影響黃瓜的口感及品質(zhì)。早期的經(jīng)典遺傳學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃瓜的苦味由Bi和Bt兩個(gè)基因控制。最近研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)由8個(gè)基因組成的基因簇參與黃瓜苦味的合成。其中Bi基因編碼氧化角鯊烯環(huán)化酶，它催化生成葫蘆2烯醇，是葫蘆素C合成的第一步，也是合成中最關(guān)鍵的一步。
[0003]盡管已經(jīng)基本確定了黃瓜中苦味合成的分子機(jī)制，但調(diào)控苦味形成的分子機(jī)制目前還不清楚，相關(guān)合成基因也未被克隆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220及其應(yīng)
用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006]本發(fā)明還提供編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0007]本發(fā)明還提供含有編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220基因的載體、工程菌、宿主細(xì)胞及轉(zhuǎn)化的植物。
[0008]本發(fā)明還提供編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因在調(diào)控黃瓜苦味合成中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明還提供編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因在無(wú)苦味黃瓜分子育種中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供一種在植物中瞬時(shí)表達(dá)基因的方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220基因的載體轉(zhuǎn)入植物體(如煙草)中，獲得目的基因大量表達(dá)。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步提供用于PCR擴(kuò)增編碼所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220基因的引物對(duì)，包括上游引物5 ' -TCTCTTTCCTCTCTCATTACGGGTGA-3 '和下游引物5' -CGCACATCAAGGCAATCAACTCG-3'。
[0012]從來(lái)自湖南的一個(gè)葉片無(wú)苦味的黃瓜突變體(XY - 3)，它是由苦味黃瓜(XY - 2)自然突變而來(lái)。在突變體XY - 3中，檢測(cè)了之前發(fā)現(xiàn)的苦味合成基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)苦味合成基因簇在突變體中的表達(dá)量非常的低。由此推測(cè)該突變體中調(diào)控苦味合成的基因可能發(fā)生了突變。將XY — 2和XY — 3的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)比較基因組序列，重點(diǎn)尋找發(fā)生在轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部突變。通過(guò)分析，找到一個(gè)SNP，位于Csa5G156220這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)該基因只在葉片中大量表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)該基因在突變體XY —3中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子在突變體中的表達(dá)也大幅降低。此外，還發(fā)現(xiàn)干旱以及ABA等逆境處理都可以使該轉(zhuǎn)錄因子及苦味合成基因表達(dá)升高，具有很高的一致性。因此，推測(cè)該突變可能導(dǎo)致該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量降低，從而使合成基因表達(dá)大幅降低，最終導(dǎo)致了葉片從苦變?yōu)椴豢唷?br> [0013]為了進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)行了酵母單雜交和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，證明該轉(zhuǎn)錄因子的確能夠結(jié)合到苦味合成基因的啟動(dòng)子區(qū)域。此外，還將苦味合成基因的啟動(dòng)子連上報(bào)告基因(LUC)，在煙草中檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的激活作用，發(fā)現(xiàn)它可以激活報(bào)告基因的表達(dá)。由于穩(wěn)定的黃瓜轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，因此，本發(fā)明建立了黃瓜子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，利用農(nóng)桿菌將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入黃瓜XY - 3的無(wú)無(wú)苦味子葉中，一周后檢測(cè)子葉，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子和合成基因大量表達(dá)，從而導(dǎo)致子葉由不苦變成苦。綜合上述研究結(jié)果，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了在葉片中調(diào)控苦味合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。將該基因命名為Bf，它通過(guò)調(diào)控合成基因的表達(dá)從而進(jìn)一步調(diào)控葉片苦味的形成。
[0014]之前的遺傳分析發(fā)現(xiàn)黃瓜果實(shí)基因是由Bt基因控制。由于野生黃瓜果實(shí)非常的苦，因此在黃瓜馴化過(guò)程中，Bt基因必然發(fā)生了突變，導(dǎo)致黃瓜果實(shí)不苦，該突變受到人為選擇而保留下來(lái)。在之前的研究中，對(duì)114份黃瓜核心種質(zhì)材料進(jìn)行重測(cè)序分析，通過(guò)生物信息學(xué)分析黃瓜馴化發(fā)生的區(qū)域，再結(jié)合圖位克隆，將Bt基因定位到5號(hào)染色體442kb的區(qū)間內(nèi)。此區(qū)間有68個(gè)候選基因。進(jìn)一步分析這些基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中Csa5G157230只在野生黃瓜的果實(shí)中表達(dá)，在栽培黃瓜果實(shí)中不表達(dá)。并且Csa5G157230基因與同時(shí)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控葉片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)檢測(cè)Csa5G157230基因和苦 味合成Bi基因在不同黃瓜品種中以及Bt基因分離群體個(gè)體中的基因表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量與果實(shí)中苦味素的含量呈正相關(guān)。即Csa5G157230基因的表達(dá)量越高，則Bi基因表達(dá)量越高，從而黃瓜果實(shí)越苦。根據(jù)這些信息，推測(cè)這個(gè)基因很有可能就是Bt基因，它通過(guò)類(lèi)似Bf調(diào)控苦味合成的機(jī)制調(diào)控黃瓜果實(shí)中的苦味合成。
[0015]基于之前已報(bào)道的研究體系，如酵母單雜交、凝膠阻滯證明Csa5G157230基因的確可以轉(zhuǎn)錄激活苦味合成基因的表達(dá)。由于穩(wěn)定的黃瓜轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，因此本發(fā)明建立了黃瓜果實(shí)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，利用農(nóng)桿菌將Csa5G157230基因?qū)胄绿┟艽坦麑?shí)中，三周后檢測(cè)注射區(qū)域的果實(shí)，發(fā)現(xiàn)Csa5G157230基因和合成基因大量表達(dá)，從而導(dǎo)致果實(shí)由不苦變成苦。綜合上述研究結(jié)果，認(rèn)為Csa5G157230基因即為Bt基因。它通過(guò)調(diào)控合成基因的表達(dá)從而進(jìn)一步調(diào)控果實(shí)苦味的形成。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中涉及的XY-3無(wú)苦味突變體相關(guān)信息；其中，A為突變體中葫蘆素C的相對(duì)濃度，XY-2為苦味黃瓜；B為突變體中苦味合成基因的表達(dá)情況；C為重測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變的位置位于Bf轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部。
[0017]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中用干旱和ABA處理后Csa5G156220及苦味合成基因的表達(dá)情況。
[0018]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中用生物信息學(xué)分析結(jié)合圖位克隆，將Bt基因定位于5號(hào)染色體的情況；其中，有67個(gè)候補(bǔ)基因，它們?cè)谝吧驮耘帱S瓜果實(shí)及葉片中的表達(dá)用漸變色區(qū)分，越深代表含量越高。
[0019]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中檢測(cè)不同種類(lèi)的黃瓜以及Bt分離群體中的個(gè)體中苦味合成基因B1、苦味調(diào)控基因Bt的表達(dá)及葫蘆素C的含量。
[0020]圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中用酵母單雜交系統(tǒng)和煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)證明Bf可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動(dòng)子上，并激活下游報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。
[0021]圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中用凝膠阻滯系統(tǒng)證明Bf可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動(dòng)子上。
[0022]圖7為本發(fā)明實(shí)施例1中用酵母單雜交系統(tǒng)和煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)證明Bt可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動(dòng)子上，并激活下游報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。
[0023]圖8為本發(fā)明實(shí)施例1中用凝膠阻滯系統(tǒng)證明Bf可以結(jié)合到苦味合成基因的啟動(dòng)子上。
[0024]圖9為本發(fā)明實(shí)施例2中分別用葉片和果實(shí)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)證明Bf和Bt的生物學(xué)功能，當(dāng)Bf或Bt表達(dá)后導(dǎo)致苦味合成基因Bt表達(dá)升高，最終使苦味物質(zhì)葫蘆素C的含 量升高。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0026]實(shí)施例1調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子挖掘與獲得
[0027]1、候補(bǔ)基因的挖掘
[0028]在湖南發(fā)現(xiàn)了一個(gè)葉片無(wú)苦味的黃瓜突變體(XY - 3)，它是由苦味黃瓜(XY - 2)自然突變而來(lái)(圖1，A)。在突變體XY - 3中，苦味合成基因簇在突變體中的表達(dá)量非常的低(圖1，B)，推測(cè)該突變體中調(diào)控苦味合成的基因可能發(fā)生了突變。將XY — 2和XY — 3的基因組DNA進(jìn)行重測(cè)序。利用生物信息學(xué)分析，尋找發(fā)生在轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部突變。該分析找到一個(gè)SNP，位于Csa5G156220這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的內(nèi)部(圖1，C)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示該基因只在葉片中大量表達(dá)，且該轉(zhuǎn)錄因子在突變體中的表達(dá)也大幅降低(圖1，B)。此外，干旱以及ABA等逆境處理都可以使該轉(zhuǎn)錄因子及苦味合成基因表達(dá)升高(圖2)。因此，將該轉(zhuǎn)錄因子列為候補(bǔ)基因，命名為Bf。
[0029]之前的遺傳分析發(fā)現(xiàn)黃瓜果實(shí)苦味是由Bt基因控制。在黃瓜馴化過(guò)程中，Bt基因必然發(fā)生了突變，導(dǎo)致黃瓜果實(shí)不苦。對(duì)114份黃瓜核心種質(zhì)材料進(jìn)行重測(cè)序分析，通過(guò)生物信息學(xué)分析黃瓜馴化發(fā)生的區(qū)域，再結(jié)合圖位克隆，將Bt基因定位到5號(hào)染色體442kb的區(qū)間內(nèi)。此區(qū)間有68個(gè)候選基因(圖3)。進(jìn)一步分析這些基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中Csa5G157230只在野生黃瓜的果實(shí)中表達(dá)，在栽培黃瓜果實(shí)中不表達(dá)(圖3)。檢測(cè)Csa5G157230基因和苦味合成Bi基因在不同黃瓜品種中以及Bt基因分離群體個(gè)體中的基因表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量與果實(shí)中苦味素的含量呈正相關(guān)(圖4)。即Csa5G157230基因的表達(dá)量越高，則Bi基因表達(dá)量越高，從而黃瓜果實(shí)越苦。并且Csa5G157230基因與我們發(fā)現(xiàn)的調(diào)控葉片苦味合成的基因是同源基因，都是bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)這些信息，推測(cè)這個(gè)基因很有可能就是Bt基因，它通過(guò)類(lèi)似Bf調(diào)控苦味合成的機(jī)制調(diào)控黃瓜果實(shí)中的苦味合成。
[0030]2、黃瓜Csa5G156220基因功能驗(yàn)證
[0031 ] 首先制備黃瓜葉片和果實(shí)的cDNA文庫(kù)，然后利用正向引物和反向弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見(jiàn)表1)。
[0032]表1引物序列(5' -3')
[0033]
【權(quán)利要求】
1.參與調(diào)控黃瓜葫蘆素C合成的轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)錄因子Csa5G156220的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的工程菌。
6.權(quán)利要求2或3所述基因在調(diào)控黃瓜苦味合成中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2或3所述基因在無(wú)苦味黃瓜分子育種中的應(yīng)用。
8.一種在植物中瞬時(shí)表達(dá)基因的方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求4所述的載體轉(zhuǎn)入植物體中，獲得目的基因大量表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物包括但不限于黃瓜、煙草。
10.用于PCR擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的引物對(duì)，其特征在于，包括上游引物5' -TCTCTTTCCTCTCT CATTACGGGTGA-3'和下游引物 5' -CGCACATCAAGGCAATCAACTCG-3'。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103755791SQ201310701069
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】黃三文, 尚軼, 張慧明, 陳惠明, 張忠華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所