專(zhuān)利名稱(chēng)：葫蘆素藥理新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，確切地說(shuō)它是葫蘆素藥理新用途，涉及葫蘆素在提高白細(xì)胞中應(yīng)用，通過(guò)與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，提高抗腫瘤效果；可以口服、注射或外用。
葫
背景技術(shù)：
葫蘆素(Cucurbitacins)屬于19-甲基出現(xiàn)在C-9位上的一類(lèi)四環(huán)三萜化合物，主要分布于葫蘆科植物中，在十字花科、玄參科、秋海棠科、杜英科、四數(shù)木科等高等植物及一些大型真菌中也有發(fā)現(xiàn)(包括葫蘆素A、B、C、D、E、I、Q等)。中國(guó)科學(xué)院昆明植物所研究員邱明華帶領(lǐng)科技人員在發(fā)現(xiàn)的一系列新型葫蘆素的基礎(chǔ)上，研究了229個(gè)幾乎所有的葫蘆素類(lèi)化合物，提出了新的結(jié)構(gòu)分類(lèi)模式，由此前的5類(lèi)結(jié)構(gòu)類(lèi)型重新分為12類(lèi)，得到了國(guó)際學(xué)術(shù)界的認(rèn)可。目前，我國(guó)批準(zhǔn)生產(chǎn)的葫蘆素又叫葫蘆素BE，為中藥甜瓜蒂(別名苦丁香)提取物，主要含葫蘆素B、E等成分，現(xiàn)有的提取物中葫蘆素B含量為60％以上，純化后葫蘆素B含量可達(dá)90％以上。葫蘆素片用于治療慢性肝炎(葫蘆素片藥學(xué)通報(bào)1986，21(6)357)，經(jīng)上海、北京、重慶等地十三家醫(yī)院臨床，其有效率為75.2％，顯效率為44.6％。臨床上觀察到葫蘆素片能較全面地改善慢性肝炎常見(jiàn)癥狀和主要體征，并有明顯的降酶(S-GPT)、降濁(TTT、ZnTT)和降膽紅質(zhì)作用，停藥后不引起S-GPT反跳，對(duì)蛋白倒置和高球蛋白血癥也有明顯的糾正作用，還能提高慢性肝炎患者的非特異性細(xì)胞免疫能力，無(wú)明顯毒副作用。除此而外，葫蘆素片還能用于治療原發(fā)性肝癌，經(jīng)上海、北京、廣西等地六家醫(yī)院臨床觀察，統(tǒng)計(jì)169例，有效率69％，顯效率39％。臨床觀察表明，該藥與5-氟脲嘧啶比較，其改善癥狀、消除肝痛、縮小瘤體、延長(zhǎng)生存期、恢復(fù)體力等，均優(yōu)于對(duì)照組，且無(wú)一般化療藥物的毒副作用(治療肝炎、肝癌新藥葫蘆素片中草藥1987，18(10)21，葫蘆素治療原發(fā)性肝癌50例臨床觀察新藥與臨床1984，3(2)21-22，葫蘆素的藥理與臨床應(yīng)用中草藥1992，23(11)605～608)。最近有作者將葫蘆素片與化療藥聯(lián)合，治療中晚期肝癌，中位生存期由單一化療藥的6.1±7.12月，提高到12.5±7.54月(葫蘆素片加化療藥治療中晚期原發(fā)性肝癌的臨床療效觀察癌癥1989，8(6)434～436)；另有文發(fā)現(xiàn)葫蘆素B，E(II)20μg/ml對(duì)癌細(xì)胞的殺傷率為82.6％，濃度提高至80μg/ml時(shí)，其殺傷率達(dá)94.1％，而對(duì)正常人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響則分別為90.6％及89.5％，表明(II)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，它同時(shí)能促進(jìn)正常淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化功能；在進(jìn)行葫蘆素片與現(xiàn)有藥物-滅澳靈治療慢性乙肝療效比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，治療組服用葫蘆素片，飯后口服，1日3次，每次2片，以3～6個(gè)月為一療程。對(duì)照組服用滅澳靈片。結(jié)果治療組總有效率為67.4％，而對(duì)照組總有效率為35.9％，P＜0.01(葫蘆素片治療慢性乙型肝炎89例療效觀察浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)1994，18(4)18～19)；有文獻(xiàn)指出，長(zhǎng)療程用藥(6周)能明顯抑制肝纖維組織增生，防止肝脂肪變性以及肝硬變的形成和發(fā)展?，F(xiàn)有劑型為片劑等，對(duì)于口服固體制劑而言，由于葫蘆素的水溶性差，片劑的體外溶出波動(dòng)較大，且溶出慢，如此不利于臨床治療。針對(duì)此類(lèi)問(wèn)題，有人申請(qǐng)了納米葫蘆素制劑藥物及其制備方法的專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?1103658.3，在該專(zhuān)利申請(qǐng)中，公開(kāi)了一種采用微波萃取、減壓濃縮、超音速射流技術(shù)噴霧干燥等步驟制成的納米葫蘆素制劑藥物，其顆粒細(xì)度達(dá)1200-1500目，粒徑為0.1-200nm，其中絕大部分粒徑小于100nm。該藥物生物利用度高，治療效果顯著。除此之外，尚有如下一些專(zhuān)利葫蘆素環(huán)糊精包合物及其制劑申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào)02153647.3；葫蘆素脂質(zhì)體組方及其制劑申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào)02144633.4；葫蘆素滴丸及其制備方法申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào)200310100943.3。亦有文獻(xiàn)將葫蘆素制備成乳劑，并考察了制備工藝(中南藥學(xué)2004，2(2)73-76)。在該文獻(xiàn)中，作者采用大豆油制備脂肪乳劑，其油相的濃度為20％，磷脂濃度為1.2％，甘油濃度為2.1％，藥物用量為0.01％(0.1mg/ml)，所得乳劑于115℃滅菌30分鐘，粒度為390nm。作者還考察了pH值對(duì)藥物的穩(wěn)定性影響，發(fā)現(xiàn)滅菌前將pH值調(diào)節(jié)為8.50、9.50，滅菌后的pH值為6.96、7.30，而藥物的含量大大下降，特別是后者，含量下降約10％。為了解決這一問(wèn)題，有專(zhuān)利申請(qǐng)了可過(guò)濾除菌的乳劑。
最近，美國(guó)的研究人員報(bào)道，葫蘆素抗癌的作用機(jī)理為抑制STAT3活性，Bolleddula Jayaprakasam等比較了葫蘆素B、D、E、I與阿霉素對(duì)人直腸癌(HCT-116)、乳腺癌(MCF-7)、肺癌(NCI-H460)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌(SF-268)細(xì)胞的抗癌活性，結(jié)果表明，在所選擇的四種瘤細(xì)胞中，葫蘆素B在0.4μM時(shí)，對(duì)人直腸癌的抑制率為81.5％、人乳腺癌87％；在0.1μM時(shí)對(duì)人肺癌的抑制率為96％；0.05μM對(duì)人CNS癌的抑制率為92％，均高于阿霉素的抑制率(分別為64％、47％、45％、71％，3μM)，即葫蘆素B對(duì)相應(yīng)的瘤細(xì)胞毒性至少是阿霉素的7.5、30、60倍(BolleddulaJayaprakasam et al.Anticancer and antiinflammatoru activity of cucurbitacinsfrom Cucurbita andreana Cancer Letters 2003，18911～16)。在同一篇文獻(xiàn)中，作者還發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B對(duì)COX-2有選擇性抑制作用。另外，JuditBartalis等報(bào)道葫蘆素B抗肝癌細(xì)胞(HepG2)的IC50為27.7μM，葫蘆素E為15.3μM(Judit Bartalis et al Relationship between cucurbitacinsreversed-phase high-performance liquid chromatography hydrophobicity indexand basal cytotoxicity on HepG2 cells Journal of Chromatography B，818(2005)159～166)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供葫蘆素藥理新用途，即葫蘆素及其藥物組合物在提高白細(xì)胞中應(yīng)用，通過(guò)與其它抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，提高抗腫瘤效果；可以口服、注射或外用。本發(fā)明是通過(guò)反復(fù)篩選和試驗(yàn)得出的。
至今，所有的文獻(xiàn)中尚未見(jiàn)有關(guān)采用葫蘆素來(lái)提高白細(xì)胞，減少放、化療的毒副作用，提高聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果。我們經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葫蘆素可以提高白細(xì)胞，明顯改善化療藥物對(duì)骨髓的傷害作用，可以與化療藥物聯(lián)合，提高療效，減低骨髓抑制作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的詳細(xì)組分由下列實(shí)施例給出，但本發(fā)明的保護(hù)范圍，不僅局限于此。
實(shí)施例1、葫蘆素提取物(葫蘆素B含量大于50％)1、藥理實(shí)驗(yàn)樣品-葫蘆素BE混懸劑的制備采用購(gòu)買(mǎi)的葫蘆素BE原料，以CMC-Na為助懸劑，按照常規(guī)方法配制混懸劑，濃度為0.1mg/ml。
2、藥理實(shí)驗(yàn)正常昆明小白鼠48只，隨機(jī)分為8組，每組6只。隔天給藥，CTX腹腔注射給藥，葫蘆素混懸劑灌胃給藥，隔天給藥，給藥5次，給藥結(jié)束后第二天小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規(guī)血白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1原料混懸口服治療組和對(duì)照組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(×109·L-1)

注與正常組比較◇p＜0.05；與CTX組比較×p＜0.05××p＜0.01實(shí)施例2、葫蘆素提取物(葫蘆素B含量大于80％)1、藥理實(shí)驗(yàn)樣品-葫蘆素脂質(zhì)體的制備將葫蘆素與蛋黃卵磷脂按照1∶300(W/W)投料，以適當(dāng)量的乙醇溶解，減壓蒸干乙醇，加入水化介質(zhì)水化脂質(zhì)膜，最后經(jīng)微射流進(jìn)行分散，過(guò)0.22μm微孔濾膜除菌，粒度約160nm，即得。
2、藥理實(shí)驗(yàn)H22荷瘤小鼠用手術(shù)刀割破尾靜脈采血，挑選體重20±2g、基礎(chǔ)外周血白細(xì)胞(WBC)接近者隨機(jī)分為7組，每組10只。另設(shè)一組正常小鼠作空白對(duì)照(給予葡萄糖注射液)。自造模后第二天開(kāi)始給藥，氟尿嘧啶對(duì)照組于第1、3、5、7、9天給藥，其余組連續(xù)給藥10天，每日一次。除灌胃組外其余組給藥途徑均為尾靜脈注射。第11天各組小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規(guī)血白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2、脂質(zhì)體注射液治療組和對(duì)照組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(×109·L-1)

注與正常對(duì)照組比較Δp＜0.05ΔΔp＜0.01與模型對(duì)照組比較◇p＜0.05◇◇p＜0.01與氟尿嘧啶組比較×p＜0.05××p＜0.01外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高、中、低劑量組相對(duì)于氟尿嘧啶組有非常顯著性差異(P＜0.01)，提示葫蘆素脂質(zhì)體注射液在治療腫瘤的同時(shí)(抑瘤率分別為48.2％、45.2％、40.4％、25，4％、32.9％)，沒(méi)有骨髓抑制作用甚至有升白趨勢(shì)，明顯優(yōu)于抑制骨髓造血功能的單純化療藥治療。
實(shí)施例3、葫蘆素提取物(葫蘆素B含量大于90％)1、藥理實(shí)驗(yàn)樣品-葫蘆素乳劑的制備處方組成葫蘆素0.01g，HS15 1.5g，大豆磷脂1g，中鏈油(辛葵酸甘油酯)5g，大豆油5g，維生素E0.1g，甘油2.5g，鹽酸適量，其余為注射用水，共100ml。
制造方法1)將中鏈油、大豆油、維生素E置于燒杯中，加熱至60℃，加入大豆磷脂、HS15，強(qiáng)烈攪拌分散至溶解，加入藥物，攪拌溶解；2)水相的制備甘油加入注射用水中，在40℃下攪拌溶解(必要時(shí)用活性炭除熱原)；3)將水相加入油相，強(qiáng)烈攪拌5min，形成初乳；4)過(guò)均質(zhì)儀，第一步調(diào)節(jié)勻化壓力至4000psi，第二步再調(diào)節(jié)至18000psi，將溶液反復(fù)勻化，得到均勻的乳劑，過(guò)0.3μm微孔濾膜除菌，分裝，充氮?dú)?，封口，滅菌即得本品。平均粒徑?83nm。
2、藥理實(shí)驗(yàn)正常昆明小白鼠78只，隨機(jī)分為13組，每組6只。隔天給藥，CTX(環(huán)磷酰胺)及其復(fù)方組給藥5次，多烯紫杉醇、紫杉醇、阿霉素(DXR)及各自的聯(lián)合組給藥3次，作空白對(duì)照給予葡萄糖注射液。給藥結(jié)束后，各組小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規(guī)血白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3葫蘆素乳劑對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響結(jié)果(×109·L-1)

注與空白對(duì)照組比較p◇＜0.05、p◇◇＜0.01；與相對(duì)應(yīng)的化療組比較p×＜0.05注CTX與葫蘆素的比例為40mg/0.1mg(400/1)；DXR與葫蘆素的比例為10mg/0.2mg(50/1)；多烯紫杉醇與葫蘆素的比例為50mg/0.3mg(500/3)；紫杉醇與葫蘆素的聯(lián)合應(yīng)用比例為100mg/0.3mg(1000/3)。
實(shí)施例4、自乳化組方口服給藥1、藥理實(shí)驗(yàn)樣品-參照我們申請(qǐng)的專(zhuān)利“實(shí)施例12葫蘆素BE”(CN200410021536.8)進(jìn)行配制。
2、藥理實(shí)驗(yàn)正常昆明小白鼠30只，隨機(jī)分為5組，每組6只。隔天給藥，CTX腹腔注射(IP)給藥，葫蘆素自乳化組方灌胃給藥，隔天給藥，給藥5次，給藥結(jié)束后第二天小鼠眼眶后靜脈采血20μl，用常規(guī)血白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4、自乳化組方口服治療組和對(duì)照組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果(×109·L-1)

注與正常組比較◇p＜0.05；與CTX組比較×p＜0.05實(shí)施例5、聯(lián)合應(yīng)用提高療效將H22模型小鼠接種24h后隨機(jī)分為7組，每組10只①模型對(duì)照組(給予葡萄糖注射液)②CTX(5mg/kg)(占復(fù)方的98.9％)③CTX(10mg/kg)(占復(fù)方的99.45％)④CTX(20mg/kg)(占復(fù)方的99.7％)⑤葫蘆素脂質(zhì)體注射液(0.055mg·kg-1)⑥葫蘆素脂質(zhì)體注射液(0.055mg·kg-1)+CTX(5mg/kg)⑦葫蘆素脂質(zhì)體注射液(0.055mg·kg-1)+CTX(10mg/kg)。CTX低、中、高化療組分別于第1、3、5、7天0.1ml/10g腹腔注射5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，給藥四次。葫蘆素脂質(zhì)體注射液組連續(xù)7天每日1次尾靜脈注射0.055mg·kg-1。葫蘆素脂質(zhì)體注射液合并CTX化療藥組(5mg/kg、10mg/kg)相應(yīng)于第1、3、5、7天腹腔注射CTX，給藥四次。第8天稱(chēng)重處死，取瘤塊稱(chēng)重，計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5、與CTX聯(lián)用對(duì)小鼠肝癌H22的抑瘤作用研究(x±SD)


注與模型組比較，*P＜0.05 **P＜0.01與對(duì)應(yīng)CTX組比較，Δp＜0.05ΔΔp＜0.0權(quán)利要求
1.葫蘆素藥理新用途，其特征在于將葫蘆素藥應(yīng)用于制備提高外周血白細(xì)胞的藥物，或與其它抗腫瘤藥物組合制備減少化療藥物毒副作用，提高抗腫瘤藥物效果的復(fù)方制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于所述的葫蘆素為葫蘆科植物、十字花科、玄參科、秋海棠科、杜英科、四數(shù)木科植物及一些大型真菌中提取的一類(lèi)四環(huán)三萜化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于所述的葫蘆素主要成分為葫蘆素B，也可以包括葫蘆素A、葫蘆素C、葫蘆素D、葫蘆素E、葫蘆素I、葫蘆素Q其中的一種或者多種成分；葫蘆素B含量大于50％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于給藥途徑包括外用、口服和注射給藥；給藥劑型為片劑、散劑、膠囊劑、顆粒劑、混懸劑、糖漿劑、口服液、乳劑、納米粒、脂質(zhì)體、軟膏劑、貼劑、注射劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葫蘆素藥理新用途，其特征在于，所述葫蘆素給藥劑量按照總葫蘆素計(jì)算，小鼠以0.001mg/公斤～1mg/公斤體重給藥，健康成人用劑量為0.1mg～5mg/日。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述葫蘆素藥理新用途，其特征在于在組方制劑中，葫蘆素占0.0001％～99.9％重量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了葫蘆素藥理新用途，將葫蘆素應(yīng)用于制備提高外周血白細(xì)胞的藥物，或與其它抗腫瘤藥物組合制備減少化療藥物毒副作用，提高抗腫瘤藥物效果的復(fù)方制劑。所述的葫蘆素為葫蘆科植物、十字花科、玄參科、秋海棠科、杜英科、四數(shù)木科植物及一些大型真菌中提取的一類(lèi)四環(huán)三萜化合物。采用葫蘆素來(lái)提高白細(xì)胞，減少放、化療的毒副作用，提高聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果。明顯改善化療藥物對(duì)骨髓的傷害作用，可以與化療藥物聯(lián)合，提高療效，減低骨髓抑制作用。
文檔編號(hào)A61K9/127GK1883484SQ200610046738
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者鄧意輝, 陳大為, 馬恩龍, 曹穎林, 黃漢洲, 李必昌, 王紹寧, 王寧, 沈琳, 王雋偉 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué), 江蘇亞勝生物科技開(kāi)發(fā)有限公司