專利名稱：檢測控制水稻耐鹽等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻育種中的檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測耐鹽秈稻品種Nona Bokra控制水稻耐鹽等位基因SKCl和MT的特異性PCR分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
土壤的鹽潰化是限制農(nóng)作物生長，造成作物減產(chǎn)最嚴(yán)重的非生物脅迫之一。水稻在鹽潰地種植一般都會減產(chǎn)，嚴(yán)重時甚至不能完成生活史。通過遺傳改良提高水稻的抗逆性是解決這一農(nóng)業(yè)問題的最有效途徑之一。水稻耐鹽性屬于數(shù)量性狀遺傳，受多基因的控制。目前已有2個耐鹽基因獲得克隆，分別為和俗八其中SKCl耐鹽等位基因來自耐鹽秈稻品種Nona Bokra,耐鹽等位基因來自中花11的EMS突變體辦(，用于基因定位的另一個親本越光和中花11則屬于鹽敏感粳稻品種。在已發(fā)表的定位研究中，雖然有發(fā)展的分子標(biāo)記位于5K7基因內(nèi)部或臨界，但這些標(biāo)記屬于擴增片段酶切長度多態(tài)性(CAPS)標(biāo)記，需要在PCR之后再進行限制性內(nèi)切酶酶切，整個過程較繁瑣，另外的SSR標(biāo)記則離基因有一定的距離。為了更方便、可靠地檢測耐鹽等位基因，以適用于水稻分子輔助育種，有必要發(fā)展操作更為簡便、快速的特異分子標(biāo)記。本發(fā)明針對5K7和基因，根據(jù)已公布的粳稻日本晴和秈稻9311全基因組測序結(jié)果，在基因及其5’上游和3’下游區(qū)域設(shè)計插入/缺失(InDel)標(biāo)記，從中挑選出擴增效果好、且可特異性鑒定Nona Bo kra等位基因的標(biāo)記。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記對NonaBokra控制水稻耐鹽等位基因SKCl和的檢測具有普遍應(yīng)用價值，可以廣泛地應(yīng)用于Nona Bokra控制水稻耐鹽等位基因SKCl和的轉(zhuǎn)育研究中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是設(shè)計和開發(fā)4個檢測耐鹽秈稻品種Nona Bokra控制水稻耐鹽等位基因5K7和的特異性分子標(biāo)記。申請人將這4個分子標(biāo)記分別命名為Firll466、Th32637、Th32638 和 Th32639，所述片段如序列表 SEQ ID NO: 1-8 所示。具體地，本發(fā)明設(shè)計開發(fā)的4個分子標(biāo)記的核苷酸序列如下:
Firll466的的上游引物序列為5’ - GCTTCCCAATAATTTCGACCT-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示。Firll466的下游引物序列為5’ - CCCACCAATACTAAAGATCCTG-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示。Th32637的上游引物序列為5’ - TCGTATAGTAGGCTTTCATGGC-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示。Th32637的下游引物序列為5’ - TTTCACAGGTGCGAGAGCTT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示。Th32638的的上游引物序列為5’ - AGAGAAGCCAAGAAATCGAC-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:5所示。Th32638的下游引物序列為5’ - TCCAAGCTCCACCTACTCC-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:6所示。Th32639的的上游引物序列為5’ - CTATTTGGCTTCGCAAGGACA-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:7所示。Th32639的下游引物序列為5’ - CGCCCACTTTAATCATATTCCCT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:8所示。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:根據(jù)已公布的粳稻品種日本晴和秈稻品種9311基因組序列，對和基因及其5’上游和3’下游區(qū)域進行序列比對，挑選具有InDel差異的基因組區(qū)域，應(yīng)用Oligo 7.0軟件，設(shè)計出21個InDel標(biāo)記。將這21個InDel標(biāo)記應(yīng)用于日本晴和9311進行多態(tài)性驗證,并進一步應(yīng)用耐鹽秈稻品種Nona Bokra和鹽敏感粳稻品種越光、中花11以及鹽敏感秈稻品種IR64、特青，篩選出4個擴增效果好、特異性高，且在水稻耐鹽品種Nona Bokra中檢測到特異片段的標(biāo)記。這4個標(biāo)記可用于鑒定待測材料是否在SKCl和DST座位上攜帶水稻耐鹽品種Nona Bokra控制水稻耐鹽等位基因,進而鑒定待測材料是否具有耐鹽能力。


圖1為7個水稻品種分子標(biāo)記Firll466的檢測結(jié)果圖。圖2為7個水稻品種分子標(biāo)記Th32638的檢測結(jié)果圖。圖3為7個水稻品種分子標(biāo)記Th32637的檢測結(jié)果圖。圖4為7個水稻品種分子標(biāo)記Th32639的檢測結(jié)果圖。其中，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:水；2:Nona Bokra ;3:越光；4:中花11 ;5:日本晴；6:9311 ；7:IR64 ；8:特青。
具體實施例方式根據(jù)已公布的日本晴和9311的基因組序列，對位于第I染色體的SKCl基因及其5’上游和3’下游區(qū)域以及位于第3染色體的基因及其5’上游和3’下游區(qū)域進行比對，挑選具有InDel差異、PCR產(chǎn)物長度大約在100-500 bp的片段進行分子標(biāo)記開發(fā)，引物設(shè)計軟件為Oligo 7.0 (Lasergene公司)。設(shè)計了 21個InDel標(biāo)記。應(yīng)用下述步驟檢測日本晴和9311以及已報道的耐鹽秈稻品種Nona Bokra和鹽敏感粳稻品種越光、中花11和鹽敏感秈稻品種IR64、特青,篩選出在Nona Bokra檢測到特異片段的分子標(biāo)記4個。1.DNA微量提取
(I)剪取水稻幼苗葉片2 3 cm，剪成0.5 cm長的碎片，放入2.0 mL離心管中。(2)加入450 ML DNA提取液和一顆鋼珠，應(yīng)用組織研磨儀進行研磨。(3)加入450 ML氯仿萃取液，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。(4)11，000 rpm離心2分鐘至清晰分相。吸取上清液400 ML，轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管中，棄槍頭。(5)加入800 ML預(yù)冷的無水乙醇，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。_20°C放置30分鐘。(6) 11，000 rpm離心3分鐘至沉淀附于離心管底部，棄上清液。
(7)用70%乙醇洗滌沉淀2遍，將1.5 ml離心管倒置于紙上，自然干燥。(8)加入50 ML的1/10XTE緩沖液溶解沉淀。(9 )取 IML 進行 PCR 擴增。2.PCR 擴增
反應(yīng)體系如下:TriS-HCLCpH 8.8)33.5 mM, (NH4)2SO4 8.0 mM,MgCl2 1.5 mM, TWEEN-20
0.05%, dNTPs 0.2 mM,上、下游引物各 3.3 ng/ML，Taq DNA 聚合酶 0.5 單位；1ML DNA,總體積10 Ml。擴增條件如下:94°C2 分鐘；94°C 45 秒，50。。(或 55°C) 45 秒，72。。I 分鐘，30循環(huán)；72°C 8分鐘；10°C 10分鐘。其中，？化11466和！1132639的退火溫度為501:，其余的退火溫度為55°C。3.PCR產(chǎn)物檢測
擴增產(chǎn)物中加入加樣緩沖液，標(biāo)記Firl 1466、Th32637和Th32638的樣品取2 W上樣于6%非變性聚丙烯酰胺膠；接通電極，在120V恒定電壓下電泳4-5小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，銀染顯色。標(biāo)記Th32639的樣品取4 W上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠，在100V恒定電壓下電泳1.5小時，進行染色和凝膠成像。如圖1所示,所篩選出的4個InDel標(biāo)記能將Nona Bokra和其他材料區(qū)別開:NonaBokra呈現(xiàn)特異帶型，其余6 個水稻品種則呈現(xiàn)不同的帶型。
權(quán)利要求
1.檢測水稻品種控制水稻耐鹽等位基因的特異性PCR分子標(biāo)記，包含I個特異性標(biāo)記Firll466的引物各一對， Firll466的的上游引物序列為5’ - GCTTCCCAATAATTTCGACCT-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示； Firll466的下游引物序列為5’ - CCCACCAATACTAAAGATCCTG-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示。
2.檢測水稻品種控制水稻耐鹽等位基因的特異性PCR分子標(biāo)記，包含3個特異性標(biāo)記Th32637、Th32638 和 Th32639 的引物各一對， Th32637的上游引物序列為5’ - TCGTATAGTAGGCTTTCATGGC-3’，它的核苷酸序列如序列表 SEQ ID No:3 所示； Th32637的下游引物序列為5’ - TTTCACAGGTGCGAGAGCTT-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4 所示； Th32638的的上游引物序列為5’ - AGAGAAGCCAAGAAATCGAC-3’，它的核苷酸序列如序列表 SEQ ID No:5 所示； Th32638的下游引物序列為5’ - TCCAAGCTCCACCTACTCC-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:6 所示；` Th32639的的上游引物序列為5’ - CTATTTGGCTTCGCAAGGACA-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:7所示； Th32639的下游引物序列為5’ - CGCCCACTTTAATCATATTCCCT-3’，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:8所示。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測水稻品種Nona Bokra控制水稻耐鹽等位基因SKC1的1個特異性PCR標(biāo)記Fir11466以及DST的3個特異性PCR標(biāo)記Th32637、Th32638和Th32639，特征在于其PCR引物。利用這4個標(biāo)記對水稻苗期所提取的DNA進行鑒定，可以檢測待測材料是否攜帶水稻品種Nona Bokra控制水稻耐鹽等位基因SKC1以及DST。整個檢測過程操作簡單且準(zhǔn)確性高。
文檔編號C12N15/11GK103103270SQ20131002631
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者樊葉楊, 朱玉君, 莊杰云, 董峰 申請人:中國水稻研究所