與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000及獲取、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記 genSSR3000及獲取方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒（CapicumannuumL.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物。黃瓜花葉 病毒（化州mbermosaicvirus,CMV)是一種毀滅性病害，是危害辣椒的主要病毒之一。 CMV常引起辣椒葉型崎形皺縮，嚴(yán)重時(shí)植株萎縮，果實(shí)小而發(fā)硬，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，品質(zhì)降 低。CMV可嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)，一般年份可造成辣椒減產(chǎn)20% -30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá) 50% -60%。在栽培生產(chǎn)過(guò)程中為防治辣椒CMV病害而頻繁施用的化學(xué)農(nóng)藥，已經(jīng)影響到 辣椒產(chǎn)品的食用安全，對(duì)人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，也對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了污染。實(shí)踐表明， 培育抗病品種是防治病害最經(jīng)濟(jì)有效的方法。同時(shí)發(fā)掘辣椒種質(zhì)資源的優(yōu)異抗CMV基因， 對(duì)其進(jìn)行分子水平的遺傳解析，對(duì)于明確抗病基因作用的分子機(jī)理和抗病育種具有重要意 義。
[0003] 辣椒CMV抗性遺傳規(guī)律復(fù)雜，不同的抗原材料抗病遺傳模式不同。根據(jù)系列研究 報(bào)道和發(fā)明人課題組做過(guò)的遺傳規(guī)律研究，絕大多數(shù)CMV抗性材料抗性表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺 傳模式，大家紛紛針對(duì)手中的CMV抗性材料進(jìn)行了giL定位，但由于抗性材料不同或CMV毒 源不同，Q化定位結(jié)果相互間差異很大，難W比較。根據(jù)W往研究報(bào)道，僅有極少數(shù)材料CMV 抗性由單基因控制，如韓國(guó)報(bào)道B址ang的CMV抗性由單顯性基因控制，并針對(duì)此單顯性基 因開(kāi)發(fā)出了緊密連鎖的分子標(biāo)記。然而至今，尚未有與辣椒CMV抗性單隱性基因緊密連鎖 的分子標(biāo)記的相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000,所述分子標(biāo)記具有序列表 中的SEQIDNO: 1~2的至少一個(gè)的核巧酸堿基序列。
[0007] 所述分子標(biāo)記應(yīng)用辣椒材料中cr基因的檢測(cè)。
[0008] 與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的應(yīng)用，其特征在于：
[0009] 所述檢測(cè)包括W下步驟：
[0010] 辣椒材料基因組DNA提取步驟：對(duì)辣椒材料進(jìn)行提取處理，得到辣椒材料基因組 DNA；
[0011] PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟：W所述分子標(biāo)記作為PCR引物，W該辣椒材料基因組DNA作為 模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012] 分析步驟：將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離處理，顯色處理，再統(tǒng)計(jì)分析所述辣椒材 料是否含有cr基因。
[0013] 在上述檢測(cè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含 有：
[0014] 模板DNA0.5-2.0ng/yL正向、反向引物各l-lOng/yLdNTP各 100-500μπιο1/ レMgCl2l-5mmol/^，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μレ體積百分比為10-20%的10XTaq Buffer;
[001引示例性地，所述PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中各個(gè)成分的含量可W為W下任意值或任意值 之間的范圍：
[001 引模板DNA0. 5ng/μL、Ing/μL、1. 5ng/μL、化g/μL，正向、反向引物各Ing/μL、 2ng/yL、6ng/yL、8ng/yL、10ng/yL，dNTP各 100ymol/L、200ymol/L、300ymol/L、 400μmol/L、500μmol/L，MgClz1mmol/1,. 2mmo1 /T,.3mnio1 /1,.4mmo1 /1,.5mnio1 /1,.TaqDNA 聚合酶 0.lU/yL、0. 2U/yL、0. 3U/yL、0. 4U/yL、0. 5U/yL，10XTaqBuffer:10%、12%、 15%、18%、20% ;
[0017] 優(yōu)選地，所述PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有：
[001引 模板DNA1.6叫/化，正向、反向引物各5叫/化，dNTP各100μL?οΙ/Ι，MgClz Immol/l，TaqDNA聚合酶 0.?υ/μL^，體積百分比為 10%的lOXTaqBuffer。
[0019] 在上述檢測(cè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含 有：
[0020] 體積百分含量為10-50%的模板0臟化5叫/化)，正向、反向引物巧化邑/化）的 體積百分含量各5-15 %，體積百分含量為40-60 %的GoTaq形GreenMastermix;
[0021] 示例性地，所述PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中各個(gè)成分的含量可W為W下任意值或任意值 之間的范圍：
[0022] 模板DNA化 5ng/yL) :10%、20%、30%、40%、50%，正向、反向引物巧0ng/μL) 各：5%、10%、12%、15%，G〇T叫飯GreenMastermix:40%、45%、50%、55%、60% ;
[0023] 優(yōu)選地，PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有：
[0024] 體積百分含量為30%的模板DNA化5ng/μL)，正向、反向引物巧化g/μL)的體積 百分含量各10%，體積百分含量為50%的GoTaq翁'GreenMastermix;
[00巧]更優(yōu)選地，10μL的PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有：
[002引 3μL的模板DNA化5ng/μL)，正向、反向引物巧Ong/μL)各1μL，5μL的 GoTaq巧GreenMastermix。
[0027] 在上述檢測(cè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性4min;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s，34個(gè)循環(huán)；72°C保溫5min。
[0028] 與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的獲取方法，包括W下步 驟：
[0029] 將辣椒供試材料進(jìn)行苗期抗病接種鑒定，W明確CMV抗性由單隱性基因cr控制； 再利用SSR引物和InDel引物進(jìn)行篩選和分離，得到所述與辣椒CMV抗性基因cr緊密連鎖 的分子標(biāo)記genSSR3000。
[0030] 本發(fā)明的有益效果為：
[0031] 本發(fā)明直接將篩選獲得的PCR引物作為分子標(biāo)記使用，可W準(zhǔn)確地檢測(cè)到辣椒材 料是否含有cr基因，本發(fā)明方法方便、快捷、節(jié)約成本。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為實(shí)施例1中CMV抗性由單隱性基因控制的辣椒材料Q132的選育方法的流 程示意圖。
[0033] 圖2為實(shí)施例1中花藥培養(yǎng)步驟中得到的胚狀體的照片。
[0034] 圖3為實(shí)施例1中再生植株培養(yǎng)步驟中得到的再生株的照片。
[003引圖4為實(shí)施例1中馴化移栽步驟中得到的植株的照片。
[0036] 圖5為實(shí)施例2中辣椒幼苗單株CMV病情7級(jí)的植株的照片。
[0037] 圖6為實(shí)施例2中辣椒幼苗單株CMV病情5級(jí)的植株的照片。
[003引圖7為實(shí)施例2中辣椒材料Q132CMV抗性連鎖分析示意圖。
[0039] 圖8為實(shí)施例2中與辣椒cr基因連鎖的genSSR分子標(biāo)記的驗(yàn)證結(jié)果電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] W下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[00川實(shí)施例1 :
[0042] 本實(shí)施例為CMV抗性由單隱性基因控制的辣椒材料Q132的選育方法和鑒定方法。 在獲得CMV抗性由單隱性基因控制的辣椒材料Q132的基礎(chǔ)上，才有可能進(jìn)行與辣椒CMV抗 性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取開(kāi)發(fā)。
[0043] 其中，上述選育方法包括W下步驟，如圖1所示。
[0044] (1)選取雜交材料：選取從國(guó)內(nèi)外引進(jìn)的四份優(yōu)良辣椒雜交種："37-74"、"喜洋 洋"、"帕沃爾"、"圣保羅"。
[0045] 其中/'37-74"購(gòu)自瑞克斯旺（中國(guó)）種子有限公司，"喜洋洋"購(gòu)自昌樂(lè)新盛種業(yè) 有限公司，"帕沃爾"購(gòu)自日本坂田種苗（蘇州）有限公司圣保羅"購(gòu)自紐內(nèi)姆（北京） 種子有限公司。
[004引似雜交對(duì)上述四份雜交材料進(jìn)行兩兩雜交："37-74"與"喜洋洋"雜交得到單交 雜種1，"帕沃爾"與"圣保羅"雜交得到單交雜種2 ;再將單交雜種1和單交雜種2雜交，得 到雙交雜種。
[0047] (3)單倍體培育：將該雙交雜種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)CMV人工接種抗性鑒定，得 到高抗CMV的DH株系Q132 (即為高抗CMV的辣椒材料Q132)。
[0048] ①選取花蕾：在上述雙交雜種中，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害的植株作為供體植株，