5ng/μL)，正向、反向引物巧Ong/yL)各lyL，5yLGoTaq電Green Mastermix(Promega，Wisconsin,USA)；
[0152] ?〇?反應(yīng)程序?yàn)椋?4°(：預(yù)變性4111111;94°(：變性153,55°(：退火153,72°(：延伸303,34 個(gè)循環(huán)；72°C保溫5min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用6. 0%非變性聚丙締酷胺凝膠， 150V恒功率電泳分離比，銀染顯色后在膠片觀察燈下進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)分析。
[0153] 結(jié)果表明：針對(duì)分子標(biāo)記genSSR3000, 24份材料中有2份材料帶型與表型結(jié)果不 相符，正確率為91. 7% (見(jiàn)圖8,表3)。
[0154] 表3 :利用24份WQ132與FS871為親本構(gòu)建的Bi株系對(duì)標(biāo)記genSSR3000進(jìn)行 準(zhǔn)確性驗(yàn)證度1群體為（Q132XFS871)XQ132)。圖8中的條帶由左自右分別為地1-地24、 Q132、FS871。
[0155]
[0156]
[0157] 實(shí)施例3:
[015引本實(shí)施例是上述與cr基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000在鑒別不同遺傳背景 的辣椒材料中是否含有cr基因的應(yīng)用。
[0159] 上述分子標(biāo)記genSSR3000作為PCR引物，對(duì)于不同辣椒材料的基因組DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，再將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙締酷胺凝膠電泳，銀染顯色 后，進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)分析，W確定辣椒材料是否含有cr基因。
[0160] 上述與cr基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000應(yīng)用于鑒定辣椒材料中是否含有 cr基因的方法，包括W下步驟：
[0161] (1)辣椒材料基因組DNA提?。翰捎锰旄参锘蚪MDNA提取試劑盒值P305-2)提 取辣椒材料的基因組DNA，提取方法詳見(jiàn)試劑盒的操作說(shuō)明，得到辣椒材料基因組DNA。
[0162] 上述辣椒材料為對(duì)CMV表現(xiàn)為感病的辣椒材料：茄口、Y化0WONDER,對(duì)CMV表現(xiàn)為 抗病的辣椒材料：湘301、Tombak(中抗）；
[0163] 上述感病辣椒材料的直接來(lái)源于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中屯、辣椒種質(zhì)資源 庫(kù)。
[0164] (2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：W該分子標(biāo)記genSSR3000作為PCR引物，W該辣椒材料基因組 DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0165] 優(yōu)選地，該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)的體系中包括：
[0166] 模板DNA0.5-2.0ng/yL正向、反向引物各l-lOng/yLdNTP各 100-500μπιο1/ レMgCl2l-5mmol/^，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μレ體積百分比為10-20%的10XTaq Buffer;
[0167] 更優(yōu)選地，該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括：
[0168] 模板DNA1.6ng/yL，正向、反向引物各 5ng/yL，dNTP各 100ymol/L，MgClz Immol/l，TaqDNA聚合酶 0.?υ/μL^，體積百分比為 10%的lOXTaqBuffer;
[0169] 其中，上述化qDNAPolymerase及其Buffer購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司， dNTPs購(gòu)自TaKaRa公司；
[0170] 作為一種優(yōu)選的方案，該P(yáng)CR擴(kuò)增反應(yīng)采用W下的10μL體系：
[0171] 3yL的模板DNA化5ng/yL)，正向、反向引物巧Ong/yL)各1yL，5yL的 GoTaq?GreenMastermix(P;romega，Wisconsin,USA);上述GoTaq?GreenMastermix 購(gòu)自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)為M7122。
[0172] 該P(yáng)CR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s， 34個(gè)循環(huán)；72°C保溫5min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0173] (3)電泳和染色：將該擴(kuò)增產(chǎn)物用6.0%的非變性聚丙締酷胺凝膠，于150V恒功率 電泳分離Ih;再銀染顯色（參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟③）后，在膠片觀察燈下進(jìn)行帶型統(tǒng)計(jì)分 析（參見(jiàn)實(shí)施例2的步驟③）。
[0174] 結(jié)果表明：針對(duì)分子標(biāo)記genSSR3000,4份抗感明確的辣椒材料中均不含有cr基 因，正確率為100 %。因此，該分子標(biāo)記genSSR3000可W應(yīng)用于檢測(cè)辣椒材料是否含有cr 基因。
[0175] 本發(fā)明中，所采用的試劑和儀器均為市場(chǎng)常規(guī)產(chǎn)品。
[0176] 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施方式僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所做的舉例，而并非是 對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還 可W做出其他不同形式的變化或變動(dòng)。運(yùn)里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予W窮舉。凡是屬于本 發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000,其特征在于：所述分子標(biāo)記 具有序列表中的SEQ ID NO: 1~2的至少一個(gè)的核巧酸堿基序列。2.與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的應(yīng)用，其特征在于：所述分 子標(biāo)記應(yīng)用辣椒材料中Cr基因的檢測(cè)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的應(yīng)用， 其特征在于： 所述檢測(cè)包括W下步驟： 辣椒材料基因組DNA提取步驟：對(duì)辣椒材料進(jìn)行提取處理，得到辣椒材料基因組DNA; PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟：W所述分子標(biāo)記作為PCR引物，W所述辣椒材料基因組DNA作為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 分析步驟：將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離處理，顯色處理，再統(tǒng)計(jì)分析所述辣椒材料是 否含有Cr基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的應(yīng)用， 其特征在于： 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有： 模板DNA 0. 5-2. Ong/ y L正向、反向引物各I-IOng/ y L dNTP各100-500 y mol/レMgCl2l-5mmol/^，l'aqDNA聚合酶0.1-0.5U/yレ體積百分比為10-20%的10Xl'aq Buffer ; 優(yōu)選地，所述PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有： 模板DNA1.6ng/]iL正向、反向引物各 5ng/]iLdNTP各lOOjimol/LMgClzImmol/L TaqDNA聚合酶0.lU/yL體積百分比為10%的IOXhqBuffer。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的應(yīng)用， 其特征在于： 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有： 體積百分含量為10-50 %的模板DNA化5ng/yL)，正向、反向引物巧化g/yL)的體積 百分含量各5-15%，體積百分含量為40-60 %的GoTTaq取IGreenMastermix; 優(yōu)選地，PCR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有： 體積百分含量為30%的模板DNA化5ng/yL)，正向、反向引物巧化g/yL)的體積百分 含量各10%，體積百分含量為50%的GoTMq輸Green Mastermix。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的 應(yīng)用，其特征在于： 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟中，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4min;94°C變性15s，55°C退火 15s，72°C延伸 30s，：34個(gè)循環(huán)；72°C保溫 5min。7.與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000的獲取方法，其特征在于： 所述獲取方法包括W下步驟： 將辣椒供試材料進(jìn)行苗期抗病接種鑒定，W明確CMV抗性由單隱性基因Cr控制；再利 用SSR引物和InDel引物進(jìn)行篩選和分離，得到所述與辣椒CMV抗性基因Cr緊密連鎖的分 子標(biāo)記genSSR3000。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000及獲取方法和應(yīng)用。與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記genSSR3000，具有序列表中的SEQ？ID？NO:1～2的至少一個(gè)的核苷酸堿基序列。所述分子標(biāo)記應(yīng)用辣椒材料中cr基因的檢測(cè)，所述檢測(cè)包括辣椒材料基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、分析等步驟。本發(fā)明直接將篩選獲得的PCR引物作為分子標(biāo)記使用，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)到辣椒材料是否含有cr基因，本發(fā)明方法方便、快捷、節(jié)約成本。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105368927
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510591517
【發(fā)明人】張曉芬, 耿三省, 陳斌, 孫宏賀
【申請(qǐng)人】北京市農(nóng)林科學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年9月16日