嚴(yán)格按鏡檢結(jié)果選取小抱子發(fā)育處于單核靠邊期一雙核早期的花蕾。
[0049] ②花蕾預(yù)處理：4°C低溫預(yù)處理花蕾1-3天。
[0050] ③花蕾消毒：取合適大小的預(yù)處理后的花蕾，剝?nèi)セ▽：?，先?5%的酒精浸泡 30s，再用8-10%的次氯酸鋼振蕩消毒10-20min，最后用無菌水清洗3次，每次3-5min，得到 消毒后的花蕾。
[0051] ④接種：取消毒后的花蕾，于超凈工作臺上將花藥完好無損的剝離，W每60mm直 徑培養(yǎng)皿12-18枚花藥的密度接種于M-3培養(yǎng)基上。
[0052] 該M-3培養(yǎng)基為固液雙層培養(yǎng)基，其中，固體層包括：NTH基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上， 添加：質(zhì)量百分比為3-6%的薦糖、質(zhì)量百分比為0.5%的活性炭、質(zhì)量百分比為0.8%的瓊 脂粉，于121°C高壓滅菌；
[0053] 液體層包括：NTH基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加：質(zhì)量百分比為3-6 %的薦糖、 IAA0. 5-1. 5mg/L6-BA0. 1-0.6111邑/1^、戊烘草胺 0. 1-0. 5mg/L，抽濾滅菌；
[0054] 該NTH基本培養(yǎng)基的原料包括：
[005引硝酸氨825mg/L硝酸鐘950mg/L二水氯化巧166mg/L屯水硫酸儀185mg/L憐 酸二氨鐘680mg/l，棚酸6. 20mg/L，四水硫酸儘25mg/L，屯水硫酸鋒lOmg/L，二水鋼酸鋼 0. 25mg/L，五水流酸銅0. 025mg/L，六水氯化鉆0. 03mgA，肌醇lOOmg/L，煙酸5mg/L，鹽酸R比 唉醇0. 5mg/l，鹽酸硫胺素0. 5mg/l，甘氨酸2mg/l，葉酸5mg/l，生物素0. 5mg/L。
[0056] ⑥花藥培養(yǎng)：花藥先在28-35Γ條件下黑暗培養(yǎng)1-10天，再轉(zhuǎn)移到25-28Γ條件下 繼續(xù)黑暗培養(yǎng)；培養(yǎng)4-7周時間，即可看到大量胚狀體發(fā)生，如圖2所示。
[0057] ⑧再生株培養(yǎng)：選取子葉型胚狀體，轉(zhuǎn)移到不加激素的MS基本培養(yǎng)基上，培育壯 苗，得到再生株，如圖3所示。
[0058] ⑦鑒定倍性：待再生株長至3-4片真葉，切取葉片，通過流式細(xì)胞儀或保衛(wèi)細(xì)胞葉 綠體計數(shù)法，從細(xì)胞染色體的水平鑒定再生株的倍性。
[0059] ⑨馴化移栽：將鑒定為二倍體的上述再生株移栽至培養(yǎng)±中，進(jìn)行馴化培養(yǎng)；其 中，該培養(yǎng)±由賠石和草炭按質(zhì)量比1:1混合制成，并經(jīng)過高壓滅菌；培養(yǎng)條件為：光照時 間為16小時/天，強(qiáng)度為20001X光照，溫度為22-25Γ;培養(yǎng)得到馴化后的二倍體再生株 (如圖4所示）。
[0060] ⑨CMV人工接種抗性鑒定：
[0061] 采收上述馴化后二倍體再生株系的種子并培養(yǎng)長成植株，再對該植株進(jìn)行CMV人 工接種抗性鑒定，W確定步驟⑦中鑒定為二倍體的再生株的CMV抗性。該抗性鑒定包括如 下步驟：
[006引A、CMV毒源繁殖：將CMV毒源在"屯、葉煙"上繁殖，溫度20-28°C，自然光照。
[0063] B、人工接種：約9-11天，"屯、葉煙"發(fā)病后，采摘發(fā)病的葉片，加入5倍于鮮病葉重 量的0. 03mol/L憐酸緩沖液（pH7. 0)，搗碎后雙層紗布過濾，濾液立即用于接種于上述六世 代聯(lián)合群體的辣椒幼苗；待辣椒幼苗長至2-3片真葉時，葉面撒布一薄層600目的金剛砂， 人工摩擦接種：接種2次，2-3天后重復(fù)接種一次。整個接種鑒定工作都在防蟲控溫溫室內(nèi) 進(jìn)行，保證室溫22-28Γ和自然光照。
[0064] C、調(diào)查和分析：
[0065] 接種后20天，調(diào)查上述植株的發(fā)病情況，2人同時調(diào)查W確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，記錄 病株數(shù)和病級，并計算病情指數(shù)，進(jìn)行抗性歸類，得到由單隱性基因控制的辣椒材料。
[0066] a、辣椒幼苗單株CMV病情分級標(biāo)準(zhǔn)為：
[0067] 0級巧任何癥狀；
[0068] 1級：屯、葉明脈或少數(shù)嫩葉花葉；
[006引 3級：中上部葉片呈現(xiàn)花葉；
[0070] 5級：多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片崎形，植株輕度矮化；
[0071]7級：重花葉，多數(shù)葉片崎形、藤葉，植株矮化；
[0072] 9級：植株嚴(yán)重矮化、停止生長，甚至死亡。
[0073] 病情指數(shù)值I)計算公式為：
[0074] 病情指數(shù)=Σ(各病級數(shù)值X該病級株數(shù)）/(最高病級數(shù)值X調(diào)查總株 數(shù)）X100%
[00巧]植株疫病抗病性分級標(biāo)準(zhǔn)：
[007引 高抗（HR):DI值《10;抗病佩：10《DI值《20;中抗（MR) :20《DI值《40;感病做：DI值> 40。
[0077] b、分析結(jié)果如下：
[0078] 上述植株中，病級《3的單株，鑒定為抗病，其它均W感病統(tǒng)計。通過本步驟鑒定 出來的抗病植株，及其所對應(yīng)的步驟⑧的再生株，可W確定為具有CMV抗性的辣椒材料：高 抗CMV的辣椒材料Q132。
[0079] 接下來，要對上述高抗CMV的辣椒材料Q132進(jìn)行重復(fù)的CMV人工接種抗性鑒定， 高抗CMV的辣椒材料Q132CMV抗性是由單隱性基因控制的。
[0080] 其中，CMV接種毒源為危害我國甜辣椒生產(chǎn)的黃瓜花葉病毒主流株系，即CMV-重 花葉株系，毒源購自中國農(nóng)科院蔬菜花弁研究所植物保護(hù)研究室。
[0081] 上述抗性鑒定方法包括W下步驟：
[008引（1)六聯(lián)合世代群體的構(gòu)建：W實施例1獲得的高抗CMV的辣椒材料Q132、高感 CMV的甜椒自交系FS871為親本，構(gòu)建Pi、P2、Fi、Bi、B2、F2六聯(lián)合世代群體。
[008引構(gòu)建方法如下：
[0084]Fi代：2013年春季，于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中屯、農(nóng)場WQ132為母本，F(xiàn)S871 為父本進(jìn)行雜交，得到Fi代種子；
[00財 F2、Bi、B2代：2013年冬季，于中屯、海南Ξ亞農(nóng)場，F(xiàn)i代自交、并分別與Q132、FS871 回交，分別獲得F2、Bi和B2代的種子。
[0086] 2014年春季和秋季，六個世代的種子經(jīng)消毒后，播種于無菌培養(yǎng)±，溫室內(nèi)育苗。
[0087] 2014年春季Pi、P2、Fi、Bi、Bz、Fz六個世代的樣本容量分別為：27、24、29、131、129、 251。2014年秋季Pi、P2、Fi、Bi、Bz、Fz六個世代的樣本容量分別為：20、23、30、79、76、262。
[0088] 分別設(shè)2012-Z52、FS871為抗感對照。
[0089] (2)CMV人工接種抗性鑒定：將六聯(lián)合世代群體進(jìn)行CMV接種處理，得到接種后的 六聯(lián)合時代群體。
[0090]①CMV毒源繁殖：將CMV毒源在"屯、葉煙"上繁殖，溫度20-28°C，自然光照。
[0091] ②人工接種：約9-11天，"屯、葉煙"發(fā)病后，采摘發(fā)病的葉片，加入5倍于鮮病葉重 量的0. 03mol/L憐酸緩沖液（pH7. 0)，搗碎后雙層紗布過濾，濾液立即用于接種于上述六世 代聯(lián)合群體的辣椒幼苗；待辣椒幼苗長至2-3片真葉時，葉面撒布一薄層600目的金剛砂， 人工摩擦接種：接種2次，2-3天后重復(fù)接種一次。整個接種鑒定工作都在防蟲控溫溫室內(nèi) 進(jìn)行，保證室溫22-28Γ和自然光照。
[009引做調(diào)查和分析：
[0093]接種后20天，調(diào)查上述六聯(lián)合世代群體發(fā)病情況，2人同時調(diào)查W確保結(jié)果的準(zhǔn) 確性，記錄病株數(shù)和病級，并計算病情指數(shù)，進(jìn)行抗性歸類，得到由單隱性基因控制的辣椒 材料。
[0094] ①辣椒幼苗單株CMV病情分級標(biāo)準(zhǔn)為：
[009引 0級巧任何癥狀；
[0096] 1級：屯、葉明脈或少數(shù)嫩葉花葉；
[0097] 3級：中上部葉片呈現(xiàn)花葉；
[0098] 5級：多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片崎形，植株輕度矮化，如圖6所示；
[0099] 7級：重花葉，多數(shù)葉片崎形、藤葉，植株矮化，如圖5所示；
[0100] 9級：植株嚴(yán)重矮化、停止生長，甚至死亡。
[0101] 病情指數(shù)值I)計算公式為：
[0102] 病情指數(shù)=Σ(各病級數(shù)值X該病級株數(shù)）/(最高病級數(shù)值X調(diào)查總株 數(shù)）X100%
[0103] 植株疫病抗病性分級標(biāo)準(zhǔn)：
[0104] 高抗（HR) :DI值《10;抗病佩：10《DI值《20;中抗（MR) :20《DI值《40; 感病做：DI值> 40。
[0105] ②分析結(jié)果如下：
[0106] 上述植株中，病級《3的單株，鑒定為抗病，其它均W感病統(tǒng)計。計算分離比，采用 MicrosoftExcel2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，SAS8. 0對結(jié)果進(jìn)行卡方測驗。
[0107] 綜合兩個季節(jié)的CMV抗性鑒定結(jié)果，實施例1獲得的二倍體再生株（代號為Q132) 和FS871的CMV病指平均分別為4. 20和65. 3 ;Q132XFS871的Fi正反交