與辣椒抗黃瓜花葉病毒緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及與辣椒抗黃瓜花葉病毒緊密連鎖的分子標(biāo)記。所述分子標(biāo)記位于辣椒12號染色體上，該位點(diǎn)與側(cè)翼SNP標(biāo)記UN54228_1146的遺傳距離為1cM。通過該分子標(biāo)記可對辣椒抗CMV抗性進(jìn)行鑒定，提高了育種效率。相比之前發(fā)現(xiàn)的其它分子標(biāo)記，本發(fā)明的SNP標(biāo)記UN54228_1146與抗性位點(diǎn)的遺傳距離為1cM，在辣椒抗CMV育種中有重要意義。
【專利說明】
與辣椒抗黃瓜花葉病毒緊密連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及與辣椒抗黃瓜花葉病毒緊密連鎖的分子標(biāo) 記。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒在世界范圍內(nèi)廣泛種植，是我國第二大蔬菜作物。然而，隨著辣椒種植面積的 不斷增長，病害對辣椒生產(chǎn)的危害也愈發(fā)嚴(yán)重，其中黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV)成為為害我國辣椒成產(chǎn)的主要病毒病之一。辣椒受CMV為害后嚴(yán)重影響品質(zhì)和 產(chǎn)量，因而培育辣椒抗CMV品種成為辣椒抗性育種的目標(biāo)之一。然而目前與辣椒抗CMV連鎖 標(biāo)記的報(bào)道較少，目前還沒有可用于辣椒抗黃瓜花葉病毒輔助育種的分子標(biāo)記。因而探究 與辣椒抗CMV相關(guān)的分子標(biāo)記有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種與辣椒抗黃瓜花葉病毒緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0004] 根據(jù)本發(fā)明用于輔助抗黃瓜花葉病毒分子標(biāo)記可通過以下步驟獲得：
[0005] 本發(fā)明以辣椒抗病品種Perennial和感病品種83-58及其構(gòu)建的RIL群體118個(gè)株 系為試驗(yàn)材料，以基于轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SNP標(biāo)記，采用KASPar基因分型技術(shù)構(gòu)建遺傳圖譜，再 結(jié)合表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，結(jié)果在12號染色體上定位到一個(gè)與辣椒抗CMV相關(guān)的QTL位點(diǎn)， 該位點(diǎn)與側(cè)翼SNP標(biāo)記UN54228_1146的遺傳距離為lcM，可以有效地用來輔助育種工作。
[0006] 本發(fā)明的用于辣椒抗CMV特異性篩選的KASPar引物，其信息如下所示。
[0007]
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是不通過抗病性鑒定，只是在苗期對辣椒植株的DNA檢測，就可以判 斷辣椒對于CMV的抗性，可以廣泛應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助育種。并且該標(biāo)記可用KASPar基因分 型技術(shù)進(jìn)行大批量檢測，可以提高效率，縮短鑒定時(shí)間。
[0009]本發(fā)明提供的分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了在苗期對辣椒植株抗CMV的鑒定，大大縮短了育種 時(shí)間，節(jié)約了人力物力。通過利用本發(fā)明提供的特異性引物采用KASPar基因分型技術(shù)，加以 抗性感親本Perennial、83-58作對照，與抗性親本Perennial同基因型的及雜合基因型的具 有抗性，與感病親本83-58具有相同基因型的不具有抗性。通過該分子標(biāo)記可對辣椒抗CMV 抗性進(jìn)行鑒定，提高了育種效率。相比之前發(fā)現(xiàn)的其它分子標(biāo)記，本發(fā)明的SNP標(biāo)記 UN54228_1146與抗性位點(diǎn)的遺傳距離為lcM，在辣椒抗CMV育種中有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0011] 本發(fā)明以辣椒抗病品種Perennial和感病品種83-58兩者的Fi及其所構(gòu)建的RIL (F8)群體的118個(gè)株系為試驗(yàn)材料，以三生煙為病毒擴(kuò)繁材料。
[0012] 1、RIL群體抗性鑒定
[0013]雙親、F1、RIL群體的118個(gè)株系，每個(gè)種植三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)種植10棵。于辣椒種 植前一個(gè)月種植三生煙，用于CMV病原的擴(kuò)繁。
[0014]將煙草鮮病葉稱重保存?zhèn)溆?，待煙草幼苗長至5-6片葉時(shí)，按照鮮病葉與3mM pH = 8的PBS緩沖液質(zhì)量體積比1: 5，在冰浴中研磨成勻漿，3000rpm離心，上清液即為接種液，置 于冰中備用。在長至5、6片葉的煙草幼苗葉片上撒少許600目金剛砂，采用摩擦接種法，手指 蘸取少量接種液，輕輕摩擦葉面，30min后用水沖去葉面多余汁液;3天后再接種一次。接種 后材料的生長溫度控制在28°C左右。采集接種后10d的有明顯病癥的煙草葉片作為辣椒接 種病原，此時(shí)黃瓜花葉病毒的致病能力最強(qiáng)。將采集的煙草病原葉轉(zhuǎn)接到長至三、四片葉的 辣椒植株，接種方法同上，接種辣椒幼苗的第1、2片真葉，用連續(xù)加樣器每片葉片接種20yL 接種液，即每株接種40yL接種液。接種后材料的生長溫度控制在28 °C左右。接種25d后參照 國家"八五"辣椒抗病育種攻關(guān)組分級標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行抗性鑒定，三個(gè)重復(fù)的均值作為該材 料對CMV抗性水平的反應(yīng)。
[0015]病情指數(shù)(DI)計(jì)算公式:病情指數(shù)(?Ι) = [Σ(各級發(fā)病株數(shù)X病級數(shù))/(9X調(diào)查 株數(shù))]X100。
[0016] 抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn):免疫（I):DI = 0;高抗(HR):0〈DI彡5;抗病(R): 5〈DI彡15;中抗 (MR) :15〈DI彡30;感?。⊿) :30〈DI彡40;高感(HS) :DI>40。
[0017] 表1國家"八五"辣椒抗病育種攻關(guān)組分級標(biāo)準(zhǔn)
[0018]
[0019] 2、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建
[0020] 2.1KASPar 標(biāo)記
[0021]本發(fā)明所采用的每對KASPar分子標(biāo)記含有3條引物序列:六1^2、(：。其中41^2僅僅 是末端的SNP位點(diǎn)存在差異，在A1、A2的5 '端分別加有共同的接頭序列：5 ' GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3'、5'GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3'。此兩段序列與Master Mix里帶 有熒光的序列互補(bǔ)，配對后會激發(fā)熒光，C為反向互補(bǔ)序列。
[0022]引物預(yù)混
[0023] 表2 KASPar引物預(yù)混
[0024]
[0025] 熒光值的讀取在Roche 480Π 熒光定量儀，按照37°Clmin，Read fluorescence Is 進(jìn)行，再按照Endpt Geno分析讀取焚光值。對RIL群體多態(tài)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與親本Perennial相 同的Allele X型記為"a"，與親本83-58相同的Allele Y型記為帶型"b"，雜合位點(diǎn)（Both Alleles)記為"h"，未能識別的記為。利用Joinmap4.0軟件進(jìn)行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，對 RIL群體基因分型的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范化處理，并轉(zhuǎn)化為軟件要求的具體格式;再將所得到 的數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件進(jìn)行計(jì)算分析并構(gòu)建連鎖圖譜。參數(shù)設(shè)置為L0D多3,步長為0.5。用Kosambi 函數(shù)進(jìn)行遺傳距離的計(jì)算，結(jié)果用厘摩爾根(cM)表示。
[0026] 3、抗黃瓜花葉病毒SPN標(biāo)記的獲得
[0027]基于已構(gòu)建的連鎖圖譜，結(jié)合表型鑒定數(shù)據(jù)，利用MapQTL 4.0軟件進(jìn)行QTL定位。 采用區(qū)間作圖方法（IM，Interval Mapping)，結(jié)合Permutation Test檢驗(yàn)確定QTL位點(diǎn)存在 時(shí)對應(yīng)的L0D值，并將連鎖群上L0D值最高的點(diǎn)看作一個(gè)QTL位點(diǎn)，并分析QTL的加性效應(yīng)及 表型變異的貢獻(xiàn)率。結(jié)果在12號染色體上定位到三個(gè)位點(diǎn)(表3)。
[0028]表3辣椒抗黃瓜花葉病毒QTL的基本信息
[0029]
[0030] 其中標(biāo)記UN54228_1146與主效QTL位點(diǎn)CMV12.3緊密連鎖?？捎糜诶苯房笴MV分子 標(biāo)記輔助育種。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與辣椒抗黃瓜花葉病毒緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記位于辣椒 12號染色體上，該位點(diǎn)與側(cè)翼SNP標(biāo)記UN54228_1146的遺傳距離為lcM。2. 用于辣椒抗CMV特異性篩選的KASPar引物，其特征在于，所述引物的序列為： 前引物Al: TGGATTGGCAAACAACACGAATGACC; 前引物A2: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATG; 后引物C: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATT。3. -種鑒定辣椒抗CMV性的方法，其特征在于所述方法包括使用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增的 步驟： 所述引物的序列為： 前引物Al: TGGATTGGCAAACAACACGAATGACC; 前引物A2: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATG; 后引物C: GCATCTTGAATGGAGATTTTCTTGACACGATT。4. 權(quán)利要求1所述與辣椒抗黃瓜花葉病毒緊密連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK105907755SQ201610405984
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月10日
【發(fā)明人】張寶璽, 王立浩, 張正海, 曹亞從, 王興興
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所