專利名稱：一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽的高效表達及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物次生物質代謝技術領域。具體的說，本發(fā)明涉及一種高效表達重組突變的黃粉蟲抗菌肽及其高效表達的應用。
背景技術：
抗菌肽廣泛存在于各種有機體內，包括細菌、昆蟲、植物和脊椎動物，已經(jīng)從多種生物體內分離得到抗菌肽，它們具有廣譜抗菌活性，可以保護機體抵御細菌、病毒、真菌和一些寄生物的侵染，是生物體內先天性防御系統(tǒng)的重要組成成分。目前越來越多的細菌對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了耐藥性，尤其是超級細菌的出現(xiàn)，新型抗生素的研發(fā)速度相對較慢，對付超級細菌已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學面臨的一個難題。與傳統(tǒng)抗生素作用機理不同，抗菌肽通過破壞質膜結構達到抑殺細菌的作用，是目前抗病原微生物藥物開發(fā)研究中的熱點，有望成為新一代的抗菌制劑。近年來，對昆蟲抗菌肽的研究已成為一個迅速發(fā)展的新領域，越來越引起人們的關注和重視。黃粉蟲(Tenebrio molitor)其幼蟲別名面包蟲，既是一種生理、遺傳學實驗材料，又為極具開發(fā)潛力的重要資源昆蟲。雖然黃粉蟲在我國分布廣，資源豐富，但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005%)，成本高未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，獲得黃粉蟲抗菌肽基因的高效表達，為黃粉蟲抗菌肽的研究和開發(fā)具有重要的
眉、ο

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術天然抗菌肽含量少，提取得率低，重組抗菌肽的表達量不高的現(xiàn)狀， 本發(fā)明旨在提供一種高表達的突變黃粉蟲抗菌肽的基因序列和編碼多肽序列，以應用于黃粉蟲抗菌肽的大量制備中。本發(fā)明的技術方案根據(jù)GenBank中的黃粉蟲抗菌肽基因tenecin 1設計特異性引物，從黃粉蟲的3齡幼蟲中克隆到黃粉蟲抗菌肽的tenecin 1 cDNA分子，所編碼的蛋白質富含半胱氨酸；擴增獲得tenecin 1 cDNA分子的開放閱讀框是25^p，為了獲得黃粉蟲抗菌肽的原核高效表達，本發(fā)明設計了特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分核酸序列， 同時獲得帶有更多正電荷的抗菌肽，以利其高抗菌活性的發(fā)揮，將成熟肽部分N端的兩個谷氨酸突變成兩個精氨酸；從而獲得本發(fā)明用于原核細胞高效表達并具有高活性的抗菌肽基因l%bp，命名為TmAMPlm。將突變的黃粉蟲抗菌肽基因TmAMPlm 195bp亞克隆至原核表達載體，轉化大腸桿菌，獲得了突變的黃粉蟲抗菌肽基因的高效表達，抑菌實驗證明所表達的黃粉蟲抗菌肽具有明顯的抑菌活性，為黃粉蟲抗菌肽的大量制備奠定了基礎。具體的，本發(fā)明提供了一種突變的黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，全長為l^bp，其編碼由序列表中序列表SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中65 個氨基酸組成的蛋白質，獲得的重組黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。
同時，本發(fā)明提供了一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽的獲得方法，具體包括如下步驟1.黃粉蟲總RNA的提取和反轉錄合成cDNA。取大約3齡的黃粉蟲幼蟲，放入無RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ；A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉錄酶M-MLV (RNase H-)，反轉錄合成eDNA。2. PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因(tenecin 1)。以上述合成的cDNA為模板，設計上、下游引物，引入限制性內切酶BamHI和)(h01 位點，PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因tenecin 1 ；在1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測PCR結果，回收PCR產(chǎn)物，連接T載體；進行測序分析，鑒定獲得了正確的tenecin 1。3.突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的PCR擴增。設計了特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分基因，將成熟肽部分N端的兩個谷氨酸突變成兩個精氨酸；從而獲得本發(fā)明用于原核細胞高效表達并具有高活性的抗菌肽基因l%bp，命名為TmAMPlm。獲得突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的流程圖見圖1。4.原核表達載體的構建及表達。將回收的PCR產(chǎn)物TmAMPlm基因與表達載體pET30a分別進行雙酶切，對雙酶切的TmAMPlm，pET30a進行過夜連接，獲得pET30a_TmAMPlm重組質粒。pET30a_TmAMPlm轉化感受態(tài)細胞E. coli DH5 α，篩選陽性克隆，陽性克隆大量培養(yǎng)并提取質粒。將提取的質粒 pET30a-TmAMPlm轉化感受態(tài)細胞Ε. coli BL21，卡那霉素篩選獲得陽性克隆。將含重組質粒的陽性克隆在37°C培養(yǎng)，加入IPTG誘導獲得可溶性、突變的黃粉蟲抗菌肽。進一步，本發(fā)明提供了一種突變的黃粉蟲抗菌肽詳細的獲得方法，具體包括如下步驟1.黃粉蟲總RNA的提取操作前實驗臺用紫外燈照射30min后，取一條大約3齡的黃粉蟲幼蟲，放入無RNA 酶的研缽中液氮研磨，粉末移入裝有ImLTrizol試劑的Eppendorf管中，蓋緊蓋激烈震蕩 15s，15 30°C室溫放置3 5min，4°C、12000r/min離心15min，小心的將上清移入干凈 Eppendorf管中，加入氯仿0. 22mL抽提蛋白質，震蕩15s，15 30°C室溫放置3 5min， 4°C、12000rpm離心lOmin，溶液分成上、中、下三層，其中無色上層即為含RNA層。將此層移入潔凈的1. 5mL的Eppendorf管中，加入異丙醇0. 5mL, 15 30°C室溫放置10min，4°C、 12000rpm離心lOmin。棄上清，沉淀部分加入75%乙醇溶液(無RNA酶水配置)lmL，洗滌， 4°C,7500r/min離心5min。棄上清，待沉淀干燥后，加入無RNA酶水，輕輕混勻，使其充分溶解，A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余_70°C保存。2.反轉錄合成cDNAEP管中配制下列模板RNA/引物混合液10 μ L總RNA，10 μ L OligodT-Adaptor引物，31. 5 μ L無RNase的水，70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷^iiin以上。離心數(shù)秒使模板 RNA/引物的變性液聚集于管底。再加入51. 5 μ L上述RNA/引物變性溶液，20 μ L5 XM-MLV 緩沖液，20 μ L dNTP, 2. 5 μ L RNase 抑制劑，6 μ L RNase M-MLV (RNase H-)。42°C保溫 lh, 70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷^iiin以上。3. PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因(tenecin 1)
以上述合成的cDNA為模板，設計上、下游引物，引入限制性內切酶BamHI和B10I 位點，PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因tenecin 1。上游引物Fl CGCGGATCCATGAAGCTTACAATCTTCGC下游引物Rl CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTCPCR 反應體系13. 9μ L dd H2O, 2 μ L 10 X Taq 緩沖液，1· 6 μ L dNTPs, 0. 6 μ LMg2+, 0. 4μ L Primer (Fl) ,0. 4μ L Primer (F2), 1 μ L cDNA。PCR反應條件95°C預變性 lmin，95°C 變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30個循環(huán)。最后72°C溫育IOmin04. PCR產(chǎn)物的電泳檢測及序列分析取5 μ LPCR擴增產(chǎn)物加6 X Loading Buffer，在1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，結果見圖2，M是標準核酸分子量Marker D2000 ；泳道1，2是陰性對照；泳道3，4是大約255bp大小的黃粉蟲抗菌肽基因。采用TIANGEN生物公司的回收試劑盒，回收PCR產(chǎn)物，連接T載體， 進行測序分析。5.突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的PCR擴增克隆突變的成熟肽基因序列引物上游引物MFl :CGCGGATCCTTCCCTCTTAGGAGAGCGGCAACAGCTG
下游引物 MRl CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTCPCR 反應體系13. 9μ L dd H2O, 2 μ L 10 X Taq 緩沖液，1· 6 μ L dNTPs, 0. 6 μ LMg2+, 0. 4μ L Primer (Μ Fl) ,0. 4μ L Primer (MF2)，1 μ L cDNAPCR 反應條件95°C預變性 lmin，95°C變性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin, 35個循環(huán)。最后72°C溫育lOmin。電泳檢測結果見圖3，M是標準核酸分子量Marker D2000 ； 泳道1是大約195bp大小的突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因TmAMPlm。6.原核表達載體的構建將回收的PCR產(chǎn)物TmAMPlm基因與表達載體pET30a分別進行雙酶切。在一微量離心管中分別依次加入下列試劑IOXK Buffer15 μ LTmAMPlm55 μ LBamHI6 μ LXho I6 μ L雙蒸水70 μ L總體系150 μ L輕彈管壁，混勻并離心，37°C酶切6小時。采用TIANGEN生物公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對雙酶切的TmAMPlm，pET30a進行回收，然后進行連接反應；在一個微量離心管中依次加入下列試劑IOX連接緩沖液1 μ L
TmAMPlm7μ L
pET30a0. 7μ L
T4DNA連接酶1 μ L
雙蒸水0. 3μ L
總體積10 μ L
16 °C，過夜連接。7.重組質粒pET30a_TmAMPlm的轉化與鑒定將連接產(chǎn)物與35 μ L感受態(tài)細胞Ε. coliDH5 α混勻，冰浴30min，然后42°C水浴熱休克45s，迅速取出冰浴;3min(不要搖動EP管)。在每管中加入SOOyL LB培養(yǎng)液，混勻， 37°C溫和振蕩培養(yǎng)lh。4°C，3000rpm,離心lmin，吸棄600 μ L上清，輕輕吹打混勻剩余菌液， 在準備好的固體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)上均勻的涂布，37°C過夜培養(yǎng)。將過夜長出的陽性克隆挑取到6mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12_1他。菌液 PCR方法鑒定重組質粒正確。按照堿裂解法提取質粒DNA。8.重組質粒pET30a_TmAMPlm的原核表達將提取的質粒pET30a-TmAMPlm 5 μ L轉化感受態(tài)細胞Ε. coli BL21，卡那霉素篩選獲得陽性克隆。將含重組質粒的陽性克隆在37°C培養(yǎng)過夜，再以比例接種，37°C培養(yǎng) 2 3h，當菌液的吸光度(A_)值達到0. 6時，加入IPTG至終濃度0. 5M，于37°C誘導5h。 取培養(yǎng)液1.511^，12000印111離心；31^11，收集菌體，沉淀用4(^1^ PBS (pH7. 4)重懸，然后加入等體積的SDS緩沖液振蕩后，置沸水浴中5min，12000rpm離心lOmin，SDS-PAGE電泳檢測結果見圖4。M是標準蛋白質分子量marker ；泳道1是沒有誘導的大腸桿菌(含有質粒 pET30a-TmAMPlm)；泳道2是0. 5mM IPTG誘導的大腸桿菌(含有質粒pET30a_TmAMPlm)表達產(chǎn)物；泳道3是誘導后的上清；泳道4是誘導后的沉淀，表明黃粉蟲抗菌肽已高效表達， 且大部分是可溶的。通過上述工藝制備獲得的重組突變黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，其所編碼的抗菌肽成熟肽為65個氨基酸，富含半胱氨酸和精氨酸。其DNA堿基序列TTCCCTCTTAGGAGAGCGGCAACAGCTGAAGAAATCGAACAA
GGCGAACACATTCGAGTAAAGAGAGTGACATGCGACATTCTT
AGTGTGGAAGCTAAAGGTGTTAAACTCAACGACGCAGCCTGTGCT
GCACATTGTCTCTTCAGGGGCAGAAGTGGAGGTTACTGTAACGGAAAG AGG GTC TGC GTT TGC AGA其氨基酸序列FPLRRAATAE EIEQGEHIRV KRVTCDILSV EAKGVKLNDAACAAHCLFRG RSGGYCNGKR VCVCR9.重組突變的黃粉蟲抗菌肽的高效表達及純化將含重組突變的黃粉蟲抗菌肽基因載體的陽性克隆在37°C培養(yǎng)過夜，再以比例接種，37°C培養(yǎng)3 4h，當菌液的吸光度(A_)值達到0. 5-0. 7時，加入IPTG至終濃度 0. 5 1M,于37°C誘導5h。12000rpm離心3min,收集沉淀。將所收集的沉淀溶于50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM imidazole, pH 8· 0 緩沖液后，4°C下進行超聲破菌，超聲波超聲破菌條件400W，每kec間隔kec共50次。4°C， 12000rpm, 20min,離心后收集上清，0. 45 μ m濾膜過濾備用。親和層析將超聲破菌后獲得的上清，在4°C下通過裝有預處理的Ni-NTA瓊脂糖介質柱中，使其自然通過層析柱。用洗雜液洗滌雜蛋白，洗雜液成分50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,20mM imidazole,pH 8· 0。使用含有 300mM 的咪唑緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,300mM imidazole, pH 8. 0)洗脫抗菌肽。凝膠過濾層析將親和層析所獲得的抗菌肽上樣于Superdex 75凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長300mm，直徑10mm，用IO-IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4, pH6. 0-9. 0緩沖液進行洗脫， 收集活性峰。將凝膠過濾層析所獲得的樣品上樣于IOkD濃縮超濾管中，4°C，3300rpm離心 30min,獲得重組突變的黃粉蟲抗菌肽。本發(fā)明也提供了上述純化工藝所獲得的重組突變黃粉蟲抗菌肽相關的生物學特性。具體為，抗菌肽是一小分子肽，具有熱穩(wěn)定性，耐酸、堿特性，耐高鹽特性、能殺耐藥菌、 抗菌肽廣。同時，本發(fā)明提供了一種突變的黃粉蟲抗菌肽在殺滅氨芐青霉素和卡那霉素抗性的大腸桿菌中的應用，其最小抑菌濃度(MIC)為0. 020-0. 011 μ g/ml和0. 022-0. 013 μ g/ml。本發(fā)明提供的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備治療病原微生物感染(耐藥菌)的抗菌藥物、飼料添加劑、保鮮劑中的應用，都具有良好的效果。通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內容，可以達到以下效果1.本發(fā)明提供了一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，全長為l^bp，其編碼由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中65個氨基酸組成的蛋白質，獲得的重組黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。2.本發(fā)明提供的一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽具有很強的熱穩(wěn)定性，在沸水中煮沸他，抑菌活性不變。3.本發(fā)明提供的一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽具耐酸、堿特性pH在2-12的范圍內，重組黃粉蟲抗菌肽的抗菌活力保持不變。4.本發(fā)明提供的一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽能殺滅氨芐青霉素和卡那霉素抗性的大腸桿菌，其最小抑菌濃度(MIC)為0. 020-0. 011 μ g/ml和0. 022-0. 013 μ g/ml。5.本發(fā)明提供的一種重組突變的黃粉蟲抗菌肽具有廣譜抗菌的功能，對微生物具有顯著的抑制作用，所有微生物包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、蘇云金桿菌、普通變形桿菌、化膿放線菌、鏈球菌、布氏桿菌、糞腸球菌、葡萄球菌、桿狀菌、棒狀桿菌等。重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備治療病原微生物感染(包括耐藥菌) 的抗菌藥物、飼料添加劑、保鮮劑等方面中具有廣泛的應用前景。6.重組突變的黃粉蟲抗菌肽的最小抑菌濃度(MIC)重組黃粉蟲抗菌肽對微生物的最小抑菌濃度明顯低于氨芐青霉素，顯示較強的抗菌能力。重組黃粉蟲抗菌肽對微生物的最小抑菌濃度包括大腸桿菌0. 030-0. 056 μ g/ml、金黃色葡萄球菌0. 007-0. Ollyg/ ml、巨大芽孢桿菌0. 010-0. 014μ g/ml、谷氨酸棒桿菌0. 018-0. 021 μ g/ml、蘇云金桿菌 0. 012-0. 016 μ g/ml、普通變形桿菌 0. 013-0. 017 μ g/ml、化膿放線菌 0. 028-0. 033 μ g/ml、 鏈球菌 0. 009-0. 011 μ g/ml、布氏桿菌 0. 005-0. 006 μ g/ml、糞腸球菌 0. 020-0. 025 μ g/ml、 葡萄球菌 0. 013-0. 015 μ g/ml、桿狀菌 0. 005-0. 010 μ g/ml、棒狀桿菌 0. 028-0. 032 μ g/ml寸。


圖1所示為突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因克隆流程圖。
圖2所示為黃粉蟲抗菌肽基因(tenecin 1)的PCR擴增圖，圖中，M為DNA分子量標準DL2000 ； 1，2為陰性對照；3，4是黃粉蟲抗菌肽tenecin 1基因片段。圖3所示為突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因TmAMPlm的PCR擴增圖，圖中，M為DNA 分子量標準DL2000 ；1為突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因TmAMPlm。圖4所示為TmAMPlm表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖，圖中，M是標準蛋白質分子量 marker ；1為沒有誘導大腸桿菌含有質粒pET30a_TmAMPlm ；2為0. 5mM IPTG誘導大腸桿菌含有質粒pET30a-TmAMPlm的表達產(chǎn)物；3為誘導后的上清；4為誘導后的沉淀。圖5所示為TmAMPlm的抑菌實驗圖，圖中，1，6為對照PBS緩沖液；2為陽性對照氨芐青霉素；3-5是重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPlm的抑菌結果。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設備有主要試劑Taq酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、DNA Marker、蛋白質Marker、蛋白胨、酵母浸出粉、丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、異丙基- β -D-硫代半乳糖苷等。主要儀器PCR儀、高壓滅菌鍋、氣浴恒溫振蕩器、電子天平、微波爐、超純水儀、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、熱空氣消毒柜、臺式冷凍離心機、電泳儀、凝膠成像儀等。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一重組突變的黃粉蟲抗菌肽的制備1.黃粉蟲總RNA的提取操作前實驗臺用紫外燈照射30min后，取一條大約5齡的黃粉蟲幼蟲，放入無RNA 酶的研缽中液氮研磨，粉末移入裝有ImLTrizol試劑的Eppendorf管中，蓋緊蓋激烈震蕩 15s，15 30°C室溫放置3 5min，4°C、12000r/min離心15min，小心的將上清移入干凈 Eppendorf管中，加入氯仿0. 22mL抽提蛋白質，震蕩15s，15 30°C室溫放置3 5min， 4°C、12000rpm離心lOmin，溶液分成上、中、下三層，其中無色上層即為含RNA層。將此層移入潔凈的1. 5mL的Eppendorf管中，加入異丙醇0. 5mL, 15 30°C室溫放置10min，4°C、 12000rpm離心lOmin。棄上清，沉淀部分加入75%乙醇溶液(無RNA酶水配置)lmL，洗滌， 4°C,7500r/min離心5min。棄上清，待沉淀干燥后，加入無RNA酶水，輕輕混勻，使其充分溶解，A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余_70°C保存。2.反轉錄合成cDNAEP管中配制下列模板RNA/引物混合液10 μ L總RNA，10 μ L OligodT-Adaptor引物，31. 5 μ L無RNase的水，70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷^iiin以上。離心數(shù)秒使模板 RNA/引物的變性液聚集于管底。再加入51. 5 μ L上述RNA/引物變性溶液，20 μ L5 XM-MLV 緩沖液，20 μ L dNTP, 2. 5 μ L RNase 抑制劑，6 μ L RNase M-MLV (RNase H-)。42°C保溫 lh, 70°C保溫IOmin后迅速在冰上急冷^iiin以上。3. PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因(tenecinl)以上述合成的cDNA為模板，設計上、下游引物，引入限制性內切酶BamHI和)(h01 位點，PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因(tenecin 1)。
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上游引物F 1 :CGCGGATCCATGAAGCTTACAATCTTCGC下游引物Rl CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTCPCR 反應體系13. 9μ L dd H2O, 2 μ L 10 X Taq 緩沖液，1· 6 μ L dNTPs, 0. 6 μ LMg2+, 0. 4μ L Primer (Fl) ,0. 4μ L Primer (F2), 1 μ L cDNA。PCR反應條件95°C預變性 lmin，95°C 變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30個循環(huán)。最后72°C溫育IOmin04. PCR產(chǎn)物的電泳檢測及序列分析取5 μ LPCR擴增產(chǎn)物加6 X Loading Buffer，在1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，結果見圖2，M是標準核酸分子量Marker D2000 ；泳道1，2是陰性對照；泳道3，4是大約255bp大小的基因片段。采用TIANGEN生物公司的回收試劑盒，回收PCR產(chǎn)物，連接T載體，進行測序分析結果證明約255bp大小的基因片段是黃粉蟲抗菌肽基因tenecin 1的開放閱讀框序列。5.突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的PCR擴增克隆突變的成熟肽基因序列引物上游引物MFl :CGCGGATCCTTCCCTCTTAGGAGAGCGGCAACAGCTG下游引物MRl :CCGCTCGAGTTATCTGCAAACGCAGACCCTCPCR 反應體系13. 9μ L dd H2O, 2 μ L 10 X Taq 緩沖液，1· 6 μ L dNTPs, 0. 6 μ LMg2+, 0. 4μ L Primer (Μ Fl) ,0. 4μ L Primer (MF2)，1 μ L cDNAPCR 反應條件95°C預變性 lmin，95°C變性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin, 35個循環(huán)。最后72°C溫育lOmin。電泳檢測結果見圖3，M是標準核酸分子量Marker D2000 ； 泳道1是大約195bp大小的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因TmAMPlm。測序分析結果證明約195bp 大小的基因片段是突變的黃粉蟲抗菌肽基因TmAMPlm序列。6.原核表達載體的構建將回收的PCR產(chǎn)物TmAMPlm基因與表達載體pET30a分別進行雙酶切，輕彈管壁， 混勻并離心，37°C酶切6小時。在一微量離心管中分別依次加入下列試劑IOXK Buffer15 μ LTmAMPlm55 μ LBamHI6 μ LXho I6μ L雙蒸水70 μ L總體系150 μ L采用TIANGEN生物公司的PCR產(chǎn)物回收試劑盒，對雙酶切的TmAMPlm，pET30a進行回收，然后進行連接反應；在一個微量離心管中依次加入下列試劑IOX連接緩沖液1 μ L
TmAMPlm7μ L
pET30a0. 7μ L
T4DNA連接酶1 μ L
雙蒸水0. 3μ L
總體積10 μ L
16 °C，過夜連接。7.重組質粒pET30a-TmAMPlm的轉化與鑒定將連接產(chǎn)物與35 μ L感受態(tài)細胞E. coli DH5 α混勻，冰浴30min，然后42°C水浴熱休克45s，迅速取出冰浴3min (不要搖動EP管)。在每管中加入800 μ L LB培養(yǎng)液，混勻，37°C溫和振蕩培養(yǎng)lh。4°C，3000rpm，離心lmin，吸棄600 μ L上清，輕輕吹打混勻剩余菌液，在準備好的固體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)上均勻的涂布，37°C過夜培養(yǎng)。將過夜長出的陽性克隆挑取到6mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素)中培養(yǎng)12_1他。菌液 PCR方法鑒定重組質粒正確。按照堿裂解法提取質粒DNA。獲得的重組突變黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，其所編碼的抗菌肽成熟肽為65個氨基酸，富含半胱氨酸和精氨酸。其DNA堿基序列TTCCCTCTTAGGAGAGCGGCAACAGCTGAAGAAATCGAACAA
GGCGAACACATTCGAGTAAAGAGAGTGACATGCGACATTCTT
AGTGTGGAAGCTAAAGGTGTTAAACTCAACGACGCAGCCTGTGCTGCACATTGTCTCTTCAGGGGCAGAAGTGGAGGTTACTGTAACGGAAAG AGG GTC TGC GTT TGC AGA其氨基酸序列FPLRRAATAE EIEQGEHIRV KRVTCDILSV EAKGVKLNDAACAAHCLFRG RSGGYCNGKR VCVCR實施例二 重組質粒pET30a-TmAMPlm的原核表達將提取的質粒pET30a-TmAMPlm5yL轉化感受態(tài)細胞E. coli BL21，卡那霉素篩選獲得陽性克隆。將含重組質粒的陽性克隆在37°C培養(yǎng)過夜，再以比例接種，37°C培養(yǎng) 2 3h，當菌液的吸光度(A_)值達到0. 6時，加入IPTG至終濃度0. 5M，于37°C誘導5h。 取培養(yǎng)液1. 5mL, 12000rpm離心3min,收集沉淀，沉淀用40 μ L PBS (ρΗ7· 4)重懸，然后加入等體積的SDS緩沖液振蕩后，置沸水浴中5min，12000rpm離心lOmin，SDS-PAGE電泳檢測結果見圖4。M是標準蛋白質分子量marker ；泳道1是沒有誘導的大腸桿菌(含有質粒 pET30a-TmAMPlm)；泳道2是0. 5mM IPTG誘導的大腸桿菌(含有質粒pET30a_TmAMPlm)表達產(chǎn)物；泳道3是誘導后的上清；泳道4是誘導后的沉淀，表明突變的黃粉蟲抗菌肽已高效表達，且大部分是可溶的。實施例三重組突變的黃粉蟲抗菌肽的抑菌活性檢測方法首先取出通過表達獲得的抗菌肽2 μ 1。以金黃色葡萄球菌為實驗菌種，在LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 5，參照瓊脂孔穴擴散法，取10 μ 1菌懸液與3ml固體培養(yǎng)基 (含0.8%瓊脂)在45°C混勻，并鋪在直徑6cm無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后于4°C保存?zhèn)溆茫皇褂脮r，在平皿中打直徑為2mm的若干小孔，并在孔中分別滴入2 μ 1待測產(chǎn)物，37°C條件下培養(yǎng)16-24h。測量抑菌圈大小。根據(jù)抑菌圈的大小判定抗菌肽的活性。圖5所示為表達產(chǎn)物的抑菌圈1，6為對照PBS緩沖液；2為陽性對照氨芐青霉素；3-5是重組突變的黃粉蟲抗菌肽TmAMPlm的抑菌結果。結果表明重組突變黃粉蟲抗菌肽TmAMPlm具有明顯的抑制金黃色葡萄球菌生長的作用。實施例四重組突變的黃粉蟲抗菌肽的高效表達及純化
將含重組突變的黃粉蟲抗菌肽基因載體的陽性克隆在37°C培養(yǎng)過夜，再以比例接種，37°C培養(yǎng)3 4h，當菌液的吸光度(A6tltl)值達到0. 6時，加入IPTG至終濃度0. 5 1M,于37°C誘導5h。12000rpm離心3min,收集沉淀。將所收集沉淀溶于50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM imidazole, pH 8· 0 緩沖液后，4°C下進行超聲破菌，超聲波超聲破菌條件400W，每kec間隔kec共50次。4°C， 12000rpm, 20min,離心后收集上清，0. 45 μ m濾膜過濾備用。親和層析將超聲破菌后獲得的上清，在4°C下通過裝有預處理的Ni-NTA瓊脂糖介質柱中，使其自然通過層析柱。用洗雜液洗滌雜蛋白，洗雜液成分50mMNaH2P04，300mM NaCl, 20mM imidazole,pH 8· 0。使用含有 300mM 的咪唑緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 300mM imidazole, pH 8. 0)洗脫抗菌肽。凝膠過濾層析將親和層析所獲得的抗菌肽上樣于Superdex 75凝膠過濾柱，凝膠過濾柱長300mm，直徑10mm，用IO-IOOmM Na2HPO4-NaH2PO4, pH6. 0-9. 0緩沖液進行洗脫， 收集活性峰。將凝膠過濾層析所獲得的樣品上樣于IOkD濃縮超濾管中，4°C，3300rpm離心 30min,獲得重組突變的黃粉蟲抗菌肽。實施例五重組突變的黃粉蟲抗菌肽抗菌譜和最小抑菌濃度(MIC)按照實施例三提供的方法，檢測重組突變的黃粉蟲抗菌肽抗菌譜和最小抑菌濃度。重組突變的黃粉蟲抗菌肽能殺滅氨芐青霉素和卡那霉素抗性的大腸桿菌。其最小抑菌濃度(MIC)為 0. 020-0. 011 μ g/ml 和 0. 022-0. 013μ g/ml。其它細菌包括大腸桿菌DH5 α 0.050-0. 065 μ g/ml、大腸桿菌 BL210. 053-0. 068 μ g/ml、金黃色葡萄球菌0. 004-0. 021 μ g/ml、表皮葡萄球菌 0. 005-0. 023 μ g/ml、葡萄球菌 0. 013-0. 015 μ g/ml、谷氨酸棒桿菌 0. 028-0. 031 μ g/ ml、巨大芽孢桿菌0. 020-0. 034 μ g/ml、蠟樣芽孢桿菌0. 022-0. 035 μ g/ml、普通變形桿菌 0. 023-0. 027 μ g/ml、鏈球菌 0. 01-0. 021 μ g/ml、變形鏈球菌 0. 02-0. 0 μ g/ml、蘇云金桿菌 0. 02-0. 036 μ g/ml、化膿放線菌 0. 038-0. 043 μ g/ml、布氏桿菌 0. 008-0. 01 μ g/ ml、雞沙門氏菌0. 009-0. 012 μ g/ml、粘性放線菌0. 020-0. 031 μ g/ml、內氏放線菌 0. 022-0. 032 μ g/ml、糞腸球菌 0. 022-0. 035 μ g/ml、桿狀菌 0. 007-0. 011 μ g/ml、棒狀桿菌 0. 029-0. 036 μ g/ml、嗜酸乳桿菌 0. 025-0. 030 μ g/ml 等。本發(fā)明提供的重組突變的黃粉蟲抗菌肽具有廣譜抗菌的功能。重組突變黃粉蟲抗菌肽在制備治療病原微生物感染(包括耐藥菌)的抗菌藥物、飼料添加劑、保鮮劑等方面中具有廣泛的應用前景。
權利要求
1.一種突變的黃粉蟲抗菌肽，其特征在于，所述的一種突變的黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，全長為l%bp，其編碼由序列表中序列表SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列中65個氨基酸組成的蛋白質，獲得的重組黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。
2.一種如權利要求1所述的突變的黃粉蟲抗菌肽的獲得方法，其特征在于，具體包括如下步驟(1)黃粉蟲總RNA的提取和反轉錄合成cDNA 取大約3齡的黃粉蟲幼蟲，放入無RNA酶的研缽中液氮研磨，使用Trizol試劑提取總RNA ；A260/A280鑒定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測；以總RNA為模板，Oligo dT為引物，使用反轉錄酶M-MLV (RNase H-)，反轉錄合成 eDNA ；PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因(tenecin 1)以步驟1合成的cDNA為模板，設計上、下游引物，引入限制性內切酶BamHI和BioI位點，PCR擴增黃粉蟲抗菌肽基因tenecin 1 ；在 1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測PCR結果，回收PCR產(chǎn)物，連接T載體；進行測序分析，鑒定獲得了正確的tenecin 1 ；(3)突變的黃粉蟲抗菌肽成熟肽基因的PCR擴增設計了特異性突變引物用于擴增其成熟肽部分基因，將成熟肽部分N端的兩個谷氨酸突變成兩個精氨酸；從而獲得用于原核細胞高效表達并具有高活性的抗菌肽基因l%bp，命名為TmAMPlm ；(4)原核表達載體的構建及表達將回收的PCR產(chǎn)物TmAMPlm基因與表達載體pET30a 分別進行雙酶切，對雙酶切的TmAMPlm，pET30a進行過夜連接，獲得pET30a-TmAMPlm重組質粒；pET30a-TmAMPlm轉化感受態(tài)細胞E. coli DH5a，篩選陽性克隆，陽性克隆大量培養(yǎng)并提取質粒；將提取的質粒pET30a-TmAMPlm轉化感受態(tài)細胞E. coli BL21，卡那霉素篩選獲得陽性克??；將含重組質粒的陽性克隆在37°C培養(yǎng)，加入IPTG誘導獲得可溶性、突變的黃粉蟲抗菌肽。
3.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在殺滅氨芐青霉素的大腸桿菌中的應用，其特征在于，所述的其殺滅氨芐青霉素的大腸桿菌的抑菌濃度(MIC)為 0.020-0. 011 μ g/ml。
4.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在殺滅卡那霉素抗性的大腸桿菌中的應用，其特征在于，所述的其殺滅卡那霉素抗性的大腸桿菌的抑菌濃度(MIC)為 0.022-0. 013 μ g/ml。
5.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備治療病原微生物感染的抗菌藥物中的應用。
6.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備耐藥菌的抗菌藥物中的應用。
7.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備飼料添加劑中的應用。
8.如權利要求1所述的重組突變的黃粉蟲抗菌肽在制備保鮮劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種突變的黃粉蟲抗菌肽及其制備獲得方法及其應用。所述的突變的黃粉蟲抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列，全長為195bp，其編碼由序列表中序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中65個氨基酸組成的蛋白質，獲得的重組突變黃粉蟲抗菌肽屬于富含半胱氨酸類抗菌肽，富含半胱氨酸和精氨酸。本發(fā)明獲得重組突變的黃粉蟲抗菌肽具有很強的熱穩(wěn)定性，在沸水中煮沸8h，抑菌活性不變，耐酸、堿特性，pH在2-12的范圍內，抗菌活力保持不變，廣譜抗菌的功能突出，對微生物具有顯著的抑制作用，尤其是對耐藥菌具有顯著的抑制作用，具有廣泛的應用領域。
文檔編號C12N15/12GK102167734SQ20111000991
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月18日 優(yōu)先權日2011年1月18日
發(fā)明者劉忠淵, 唐馨, 張富春 申請人:新疆大學