一種大鼠Kif11基因干擾shRNA及其重組腺相關病毒和抗腫瘤應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體設及一種大鼠Kifll基因干擾ShRNA及其重 組腺相關病毒干擾載體和抗腫瘤應用。
【背景技術】
[0002] Kifll化inesin family member 11，又稱Eg5)是驅動蛋白家族成員之一，通常認 為其在增殖組織細胞中高表達，定位于有絲分裂期的微管，是細胞分裂過程中染色體的定 位、中屯、體的分離W及雙極紡鍵體的形成和分離的關鍵分子。隨著Kifll抑制劑monastrol 的發(fā)現(xiàn)，能夠用于抗腫瘤的Kifll小分子抑制劑已經(jīng)成為國際上眾多制藥公司的研發(fā)熱 點。有研究顯示Kifll在非分裂的神經(jīng)細胞中也有表達，與調節(jié)神經(jīng)軸突的生長有關，但是 否發(fā)揮其他功能尚未明確。
[0003] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的一種生物學現(xiàn)象， 能特異干擾祀基因的表達。其作用機制是：核糖核酸酶HI家族的Dicer酶，與dsRNA結合， 將其剪切成21-2：3nt及3'端突出的siRNA，隨后siRNA與RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex,RISC)結合，解旋成單鏈，活化的RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列 特異性地結合到祀信使RNA (mRNA)上并將其切斷，引發(fā)祀mRNA的特異性分解，能特異性阻 斷祀基因的表達。
[0004] 目前人工實現(xiàn)RNAi的主要方法之一是直接將體外合成的siRNA序列導入細胞，主 要缺點在于轉染效率低，效果不穩(wěn)定，作用持續(xù)時間短。另一種是通過轉染載體持續(xù)穩(wěn)定表 達siRNA，主要優(yōu)點在于穩(wěn)定大量的表達短發(fā)夾RNA (shRNA)，shRNA末端在體內被加工、處 理成約2化P的類SiRNA分子，SiRNA將啟動RNAi因此可用于長時間干擾祀基因的表達。常 用的載體包括腺相關病毒（adeno-associated vi;rus，AAV)、逆轉錄病毒、慢病毒。與后兩 者相比，腺相關病毒AAV的突出優(yōu)勢在于安全性高，免疫原性低，宿主范圍廣，攜帶的轉染 基因能長期穩(wěn)定表達，體外和體內均可應用，具有多種血清型，能滿足針對不同組織的轉染 要求，具有廣闊的應用范圍和前景。
[0005] 目前已經(jīng)有針對Kifll的小干擾RNA產(chǎn)品，例如圣克魯斯的生產(chǎn)的SiRNA、shRNA 質粒和慢病毒顆粒，但是祀基因針對小鼠Kifll,病毒滴度也不高，每毫升含有IX 1〇6慢病 毒轉導顆粒。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種大鼠Kifll基因干擾ShRNA及其重組腺相關病毒干擾 載體和抗腫瘤應用。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術方案來實現(xiàn)： 陽00引本發(fā)明公開了一種大鼠Kifll基因干擾shRNA, shRNA正義鏈的核巧酸序列如SEA I化NO. 1所示；shRNA反義鏈的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。 W09] 本發(fā)明還公開了含有大鼠Kifll基因干擾shRNA序列的重組腺相關病毒 rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kif11。
[0010] 該重組腺相關病毒rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll為9型重組腺相關病毒。
[0011] 本發(fā)明還公開了重組腺相關病毒rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll在制備抗腫瘤藥 物中的應用。
[0012] 所述的藥物為抑制腫瘤細胞Kifll基因表達的藥物。
[0013] 進一步地，所述的藥物為抗腎上腺嗜銘細胞瘤的藥物。
[0014] 所述的藥物為抑制腫瘤細胞增殖的藥物
[0015] 進一步地，所述的藥物為抗黑色素瘤的藥物。
[0016]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有W下有益的技術效果：
[0017] 本發(fā)明提供的大鼠Kifll基因干擾shRNA，其正義鏈和反義鏈的核巧酸序列如 沈化I化NO. 1和沈Q. I化NO. 2所示。大鼠Kifll基因干擾shRNA能夠起到抑制Kifll基因 表達的作用。
[001引本發(fā)明提供的含有大鼠Kifll基因干擾shRNA序列的重組腺相關病毒 rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll，具有抑制Kifll基因表達及抑制腫瘤細胞增殖的作用。本發(fā) 明制備的含有Kifll基因干擾shRNA的重組腺相關病毒滴度高，每毫升含有1 X 10"病毒轉 導顆粒，能顯著抑制腫瘤細胞Kifll基因表達，抑制腫瘤細胞增殖反應，在腫瘤治療方面具 有應用前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1為干擾質粒rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kifll酶切鑒定結果圖；
[0020] 圖2為PCR檢測rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kif 11重組腺相關病毒轉染腎上腺嗜銘細 胞瘤PC12后Kifll mRNA相對表達量； 陽02U 其中，（a)為 Kifll, (b)為內參 0 -actin ;
[0022] 圖3為MIT法檢測rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kif 11重組腺相關病毒對黑素瘤細胞增 殖的影響結果圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面將結合附圖，對本發(fā)明的進行詳細的描述，所用試劑如無特殊說明均購自 Invintrogen，實施例中的實驗方法按照常規(guī)條件，參考分子克隆實驗指南（第=版，J.薩 姆布魯克等著）和試劑說明書中所述的條件。
[0024] 1、祀向大鼠Kifll基因shRNA序列的獲得 陽0巧]根據(jù)NCBI公開的大鼠Kifll基因序列（Genbank:NM_001169112. 1)設計shRNA序 列，具體設計參考美國Invintrogen公司網(wǎng)站（其網(wǎng)址ht1:p://;rnaidesigne;r. invitrogen. com/;rnaiexpress/so;rt. do)提供的 RNAi 在線設計軟件。
[0026]祀基因序列 5' -GTGCTGCAAGGATCGATTGAT-3'（SEQ. ID. NO. 3);
[0027] shRNA序列由Invinrogen公司合成，具體如下（下劃線字體為BamH I、Hindlll 酶切位點）：
[0037] 2、將干擾序列導入rAAV9-ZsGreen-shaiRNA質粒載體
[0038] 將上述干擾序列在95°C條件下解鏈4分鐘，75°C條件下退火10分鐘，將單鏈序列 退火形成帶粘性末端的雙鏈序列。質粒載體rAAV9-ZsGreen-shRNA(百恩維生物科技有限 公司）用限制性內切酶BamHI+HindIII雙酶切。DNA連接酶進行連接，22°C水浴反應過 夜。連接體系見表1。
[0039] 表1質粒載體連接反應體系
[0040]
[0041] 3、rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kif11 干擾質粒載體酶切鑒定
[0042] 轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，然后涂于Ampicillin抗性的LB平板上，倒置， 37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取若干單克隆菌落，接種于Ampicillin抗性的培養(yǎng)液中， 37°C恒溫搖床培養(yǎng)過夜，然后用小量質粒提取試劑盒小提質粒（具體步驟按試劑盒說明操 作）。rAAV9-ZsGreen-化RNA-rEG5陽性克隆可酶切得到90化P的條帶。如圖1所示，1為 DNA Marker,從上到下 SOOObp, 3000bp, 2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp。2-3 為 陽性克隆。
[0043] 4、干擾載體rAAV9-ZsGreen-化RNA-Kifll重組9型腺相關病毒包裝 W44] 1)轉染目的質粒到細胞
[0045] 常規(guī)復蘇和膜酶消化肥K293細胞，完全培養(yǎng)基稀釋細胞至2X lOVml，37°C培養(yǎng) 箱中解育24h。轉染按試劑盒說明書操作，在420 y L滅菌水中加入包裝質粒及含目的基 因的質粒DM共30 iil，再加入50 yL buffer B，使S者總體積達到500 iil。再將等體 積buffer A溶液逐滴加入，混勻后靜置2min后，將1ml混合液逐滴加入上述單層細胞的 細胞培養(yǎng)基中，輕搖混勻。37°C培養(yǎng)箱中解育4-化后換液繼續(xù)培養(yǎng)。次日早上更換新鮮 完全培養(yǎng)基（含1%雙抗）。換液48小時后，用吸管將細胞從培養(yǎng)皿中吹下來收集到離 屯、管中，置于-80°C和37°C水浴鍋中反復凍融S次，300化pm離屯、lOmin，收集上清，濃縮； rAAV9-ZsGreen-aiRNA-Kifll第一代毒種（P1)可于-80°C長期保存。2ml P1代病毒感染一 個75cm的細胞培養(yǎng)瓶的細胞，可用于病毒擴增。
[0046] 2)巧光定量PCR測定病毒滴度
[0047] 構建的重組腺相關病毒載體中含有hGH polyA(184