專利名稱：構(gòu)建抗黃瓜花葉病毒的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為用基因重組技術(shù)構(gòu)建抗黃瓜花葉病毒(CMV)感染的轉(zhuǎn)基團(tuán)植物的制備方法及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及構(gòu)建CMV-JV株外殼蛋白基因，將外殼蛋白基因和衛(wèi)星RNA基因同時(shí)整合到轉(zhuǎn)移載體中，構(gòu)建出能同時(shí)表達(dá)這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的方法及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。
CMV能引起屬于85科，365屬的755種植物病害，是我國(guó)危害最嚴(yán)重的病害之一。由于在大多數(shù)植物中未找到抗CMV因子，加之其又屬非持久性蚜蟲(chóng)介體傳染，難于進(jìn)行治蚜防病，故無(wú)有效的防治辦法。自從發(fā)現(xiàn)致弱病毒的衛(wèi)星RNA和外殼蛋白可用于植物病毒的防治，已有許多報(bào)導(dǎo)用植物基因工程的方法獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物，證實(shí)了外殼蛋白(CP)基因和衛(wèi)星RNA(Sat)基因的抗病作用。EP-279433號(hào)專利公布了CMV-Y株外殼蛋白的基因，用于產(chǎn)生抗CMV感染的植株的方法。美國(guó)尼普約翰公司從CMV-C株得到了外殼蛋白基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，在植株中表達(dá)(W08905858)。另一種制備抗CMV轉(zhuǎn)基因植物的方法是將衛(wèi)星RNA基因引入植物染色體中，以獲得抗性基因。CMV具有三分段基因組(RNA1，RNA2，RNA3)和一個(gè)為外殼蛋白編碼的亞基因組(RNA4)，此外有些CMV中含有第五種分子量為1.1×105D的小分子RNA(衛(wèi)星RNA)。衛(wèi)星RNA不能獨(dú)立復(fù)制，但能干擾病毒復(fù)制，改變寄主植物中癥狀的表達(dá)，并往往引起癥狀的減弱，衛(wèi)星RNA已用于生物防治(田波等，科學(xué)通報(bào)，31(6)475，1986)。Baulcombe等報(bào)道將衛(wèi)星RNA-1-17N的cDNA引入煙草，轉(zhuǎn)化植株產(chǎn)生了對(duì)CMV的抗性。田波領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道用CMV衛(wèi)星RNA-1構(gòu)建抗CMV的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄(吳世宣等，中國(guó)科學(xué)B輯，1989，9948-956.趙淑珍等，中國(guó)科學(xué)B輯，1990，7708-713.)，具有對(duì)CMV侵染的抗性;含有外殼蛋白基因的抗性植株產(chǎn)生抗病毒侵染的早期抗性，晚期效果不明顯，而衛(wèi)星RNA產(chǎn)生抗病毒復(fù)制的晚期抗性。轉(zhuǎn)單基因的植株，只在不同時(shí)期以不同特性表現(xiàn)出各自不同的抗性，對(duì)完全防治病毒都有一定的局限性。
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因植物的方法，在轉(zhuǎn)基因植物中能同時(shí)表達(dá)衛(wèi)星RNA和外殼蛋白基因，產(chǎn)生高抗性的植株。本發(fā)明的另一目的是提供帶有上述兩種基因的嵌合基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的主要特征是把具有病毒早期抗性的外殼蛋白基因和病毒晚期抗性的衛(wèi)星RNA基因構(gòu)建在同一載體上，一起引入植物中。兩個(gè)基因各自帶有自己的表達(dá)盒，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物能同時(shí)表達(dá)外殼蛋白和衛(wèi)星RNA。
從感染CMV衛(wèi)星RNA-1的煙草葉片中提取衛(wèi)星雙鏈RNA作為模板，合成全長(zhǎng)的衛(wèi)星RNA-1互補(bǔ)DNA，得到含衛(wèi)星RNA-1cDNA的克隆pUI(張春霞等，科學(xué)通報(bào)34(7);540，1989)。該克隆含有


圖1的衛(wèi)星RNA-1基因。
外殼蛋白基因的合成以極強(qiáng)株CMV-JV為材料，接種煙草，兩周后采集病葉，提純病毒，從純化的病毒提取病毒RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板，用3′端及5′端兩個(gè)引物進(jìn)行全長(zhǎng)CP序列cDNA的合成。其引物序列為3′-引物5′-TCAGACTGGGAGTACTCT-3′5′-引物5′-ATGGACAAATCAAA-3′在3′端引物引導(dǎo)下，反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈。堿解模板RNA鏈，再加入5′端引物，合成第二條cDNA鏈，并以T4DNA聚合酶除去伸出的3′端以獲得平端雙鏈cDNA。將合成的CP的雙鏈cDNA連接到E.coli質(zhì)粒pUC19，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在T4多核苷酸激酶的作用下標(biāo)記3′引物的5′端，并以此作為探針。菌落雜交篩選出陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切篩選出插入片段大小在0.7kb左右的陽(yáng)性克隆，測(cè)定插入片段序列，所得的CP序列如圖2。
以ROKⅡ?yàn)橹虚g載體構(gòu)建含有上述兩個(gè)基因的表達(dá)載體。ROKⅡ是由Binl9衍生而來(lái)的，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。它含有T-DNA的左右邊界序列，花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子，藍(lán)曙紅合成酶轉(zhuǎn)錄終止序列，在兩者之間含有5個(gè)單一酶切位點(diǎn)(XbaⅠ，BamHⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ，SacⅠ)，此外還具有既在細(xì)菌中，也在植物中表達(dá)的抗卡那霉素的選擇標(biāo)記。
以XbaⅠ與SacⅠ雙酶切下pUⅠ上的衛(wèi)星cDNA片斷，其方向與ROKⅡ中的35s啟動(dòng)子方向一致，低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收衛(wèi)星cDNA片斷。中間載體RoK-Ⅱ以同樣的酶雙酶切，并以低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收質(zhì)粒片斷。衛(wèi)星cDNA片斷與RoKⅡ進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ca2+方法處理的E.coli感受態(tài)細(xì)胞，制備轉(zhuǎn)化菌落質(zhì)粒，以XbaⅠ與SacⅠ雙酶切并電泳分析插入片斷以確定陽(yáng)性克隆(pRⅠ)。
以BamHⅠ與SacⅠ雙酶切含CP基因質(zhì)粒中外殼蛋白基因片斷，以低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收，構(gòu)建外殼蛋白基因片斷到RoKⅡ中，其方法同上所述。制備轉(zhuǎn)化菌落質(zhì)粒并酶切分析以鑒定篩選插入有外殼蛋白基因片斷的陽(yáng)性克隆(pRCP).
按圖3所示將衛(wèi)星cDNA與殼蛋白基因構(gòu)建到同一ROKⅡ載體中。以BamHⅠ和SacⅠ雙酶切RoRⅡ，以低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收載體片斷，以EcoRⅠ酶切上述含CP的質(zhì)粒pRCP，用大片斷酶補(bǔ)齊，以BamHⅠ酶切并回收有終止序列的外殼蛋白基因片斷(CP-ter片斷)。含有衛(wèi)星RNA基因的質(zhì)粒pRⅠ以HindⅢ酶切，以大片斷酶補(bǔ)齊，然后以SacⅠ酶切，回收連有35S啟動(dòng)子片斷的衛(wèi)星cDNA片斷(35S-Sat片斷)。將CP-ter片斷與35S-Sat片斷連接到上述制備的RoKⅡ上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ca2+方法處理的E.coli感受態(tài)細(xì)胞。制備轉(zhuǎn)化菌落的質(zhì)粒，鑒定插入有CP基因和衛(wèi)星RNA基因的克隆(pRCPⅠ).所得到的植物轉(zhuǎn)化載體(pRCPⅠ)含有兩個(gè)表達(dá)盒，外殼蛋白基因與衛(wèi)星cDNA分別插入到這兩個(gè)表達(dá)盒中(圖3)。
按本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員使用的常規(guī)方法進(jìn)行三菌接合，將上述構(gòu)建的含CP基因和衛(wèi)星RNA基因的載體引入含Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌中，將上述三菌接合的克隆轉(zhuǎn)化植物葉片，轉(zhuǎn)化的植物可以為雙子葉植物的葉片，特別是茄科，十字花科和葫蘆科的植物。
用組織培養(yǎng)的方法從轉(zhuǎn)化的葉片中再生出植株。
在轉(zhuǎn)基因植株中測(cè)定CP和衛(wèi)星RWA的表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因的當(dāng)代植株中測(cè)定CP的表達(dá)，用Western雜交測(cè)定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物中的外殼蛋白。從轉(zhuǎn)基因植株葉中提取蛋白，電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與CMV抗血清反應(yīng)。用Northern雜交測(cè)定植株中CP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA，從轉(zhuǎn)基因植物的葉片中提取總RNA，電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與DNA探針雜交。放射自顯影檢測(cè)雜交結(jié)果。
用電泳法和點(diǎn)雜交兩種方法檢測(cè)衛(wèi)星RNA在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。轉(zhuǎn)化植株和對(duì)照植株分別接種不含衛(wèi)星RNA的CMV-B，提取核酸進(jìn)行電泳、染色，進(jìn)行點(diǎn)雜交。
從上述方法檢測(cè)結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因植株中兩種基因都得到表達(dá)。
用本方法構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物可同時(shí)表達(dá)外殼蛋白和衛(wèi)星RNA，嵌合基因植株接種病毒后，病情指數(shù)明顯下降。
本發(fā)明提供了CMV-JV株外殼蛋白的基因，含有圖2的序列。
本發(fā)明提供一種含有
圖1的衛(wèi)星RNA的基因和圖2的蛋白外殼基因的轉(zhuǎn)化載體，所說(shuō)的外殼蛋白基因和衛(wèi)星RNA基因各帶有花葉菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和藍(lán)曙紅合成酶轉(zhuǎn)錄中止子序列。
一種含有上述的轉(zhuǎn)化載體的細(xì)菌細(xì)胞。
一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，含有CMV-JV株外殼蛋白基因，CMV衛(wèi)星RNA-1基因，所說(shuō)的外殼蛋白基因和衛(wèi)星RNA基因各帶有花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和藍(lán)曙紅合成酶轉(zhuǎn)錄中止子序列。
來(lái)自上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞的雙子葉植株，特別是茄科，十字花科和葫蘆科轉(zhuǎn)化植株，能同時(shí)表達(dá)CMV-JV株外殼蛋白和CMV衛(wèi)星RNA-1，表現(xiàn)對(duì)CMV的高度抗病性。
實(shí)施例
1.CMV衛(wèi)星RNA-1的cDNA合成克隆及序列分析用于cDNA合成的模板RNA為雙鏈衛(wèi)星RNA(dsRNA).將含衛(wèi)星RNA-1的CMV接種于生長(zhǎng)6-8周的普通煙上。兩周后采集感病葉，感病葉在GPS緩沖液(200mM甘氨酸，100mM Na2HPO4，600mM NaCl，pH9.5)及1%SDS中研磨，加酚與氯仿抽提，離心取上清，以2.5倍體積乙醇沉淀上清，沉淀物溶于含15%乙醇的STE溶液(50mM Tris-Cl，100mM NaCL，1mM EDTA，pH7.0)，加入適量微晶纖維素，4℃過(guò)夜，上柱，用15%乙醇-STE平衡，洗柱，換用STE洗脫，在紫外監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)下收集核酸峰。乙醇沉淀，離心即得純度較高的雙鏈RNA。采用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收衛(wèi)星dsRNA.
用Applied Biosystem 381A型DNA合成儀合成兩個(gè)引物。3′-端引物為5′CCCGGGTCCTGTATAGG-3′;5′端引物為5′-GTTTTGTTTGA-TGG-3′。引物在使用前磷酸化。其反應(yīng)條件為50mM Tris-Cl，pH7.6，10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM亞精胺，0.1mMEDTA，2mMATP，5單位T4多核苷酸激酶，37℃保溫30分鐘。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的條件為，50mM Tris-Cl(pH8.0)，10mM MgCl，140mM KCl，100mM巰基乙醇500mM dATP，dGTP，dTTP，dCTP，50單位RNasin，60單位反轉(zhuǎn)錄酶，3-端引物及5′-端引物各150pm，42℃保溫1小時(shí)后，加EDTA至終濃度10mM終止反應(yīng)。酚提取后加入NaOH至0.2M，70℃反應(yīng)25分鐘以降解RNA，后用鹽酸中和。SephadexeG-200柱分離，冷凍干燥后，退火并加DNA聚合酶Ⅰ大片斷酶將cDNA兩端補(bǔ)齊。
克隆載體為pUC12.以SmaⅠ酶解切成平端，70°保溫10分鐘以滅活酶。連接條件為，15mM Tris-Cl，pH7.0，5mM MgCl，5mM DTT，0.25mM亞精胺，1mM ATP，100mg/ml BSA，25mM三氯化六氨鉆，400ng pUC12(SmaⅠ切)，30ng dscDNA，3單位T4DNA連接酶，22℃反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢，轉(zhuǎn)化Ca2+法處理的E.coliJM107的感受態(tài)細(xì)胞，以3′端引物與5′端引物作探針，菌落雜交，分別篩選出3′端部分與5′端部分的克隆，構(gòu)建全長(zhǎng)的cDNA基因(pUI).
將全長(zhǎng)cDNA片斷亞克隆到M13mp18與mp19上，以雙脫氧法進(jìn)行序列分析。RNA-1衛(wèi)星cDNA全長(zhǎng)序列見(jiàn)
圖1。
2.CMVCP基因的合成、克隆、序列分析和表達(dá)用CMV一個(gè)強(qiáng)株系JV為材料，接種生長(zhǎng)6-8周的普通煙，兩周后采收病葉，在含0.1%巰基乙醇的檸檬酸鈉(0.5MpH7.0)緩沖液中勻漿，加等體積氯仿攪拌30分鐘，離心取上清，以10%(w/v)PEG6000沉淀過(guò)夜，沉淀懸浮在含2%Triton-100的檸檬酸鈉(0.05MpH7.0)中，離心取上清，超離心(28000rpm，2小時(shí))，重復(fù)差速離心得病毒純化樣品。
病毒核酸的提取按酚-SDS法，抽提緩沖液為20mMTris-ClpH8.0，100mMNaCl，1mMEDTA，1%SDS，等體積酚氯仿抽提3次，乙醇沉淀三次。
用3′端及5′端兩個(gè)引物進(jìn)行全長(zhǎng)CP基因的合成。用AppliedBiosystem381A型DNA合成儀合成兩個(gè)引物3′-引物5′-TCAGACTCCC-ACTACTCT-3′;5′-引物5′-ATCCACAAATCACAA-3′。將合成的引物溶于TE(10mMTris-Cl，1mMEDTApH8.0)中，用無(wú)水乙醇沉淀。引物使用前需將其5′端磷酸化，反應(yīng)條件為50mM Tris-Cl，10mM MgCl2，5 DTT，0.6mM ATP，pH7.5，5μ F4多核苷酸激酶37℃保溫30分鐘后，在65℃保溫10分鐘以使酶滅活。反轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈，反應(yīng)混合物(50ul)包含50mM Tris-Cl(pH8.3)，75mM KCl，10mM DTT，3mM MgCl2，500uM dNTPs，100ng 3′-引物，5ug模板RNA，500U M-MLV-RTase(BRL)，取5ul反應(yīng)混合物加入5uCi[α-32p]以標(biāo)記第一條鏈的合成。在37℃保溫1小時(shí)后，加入EDTA(pH8.0)至終濃度20mM以終止反應(yīng)，并加入5ul 2mM NaOH及雙蒸水至總體積100ul，置此混合物于65℃保溫30分鐘，然后將其置于冰上，加入12ul 3mM NaAC(pH5.2)以中和堿液，并加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，液氮中放置10分鐘后離心回收DNA.第二條鏈cDNA的合成是在5′-引物引導(dǎo)下以大片斷酶完成延伸的，反應(yīng)混合物(50ul)包含50mM Tris-Cl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT，200ug/ml BAS，500uM dNTPs，5u大片斷酶，取10ul反應(yīng)混合物加入5μCi[α-32P]-dCTP標(biāo)記第二條鏈的合成，37℃保溫1小時(shí)，加入EDTA(pH5.2)到終濃度20mM，用酚-氯仿混合物(1∶1 V/V)抽一次，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀過(guò)夜。
cDNA克隆載體為pUC19，載體以SmaⅠ酶切成平端，連接反應(yīng)的條件為20mMTris-Cl(pH7.6)，10mMDTT，0.6mMATP，100ngpUC19(SmaⅠ)，1/5量的合成cDNA，2uT4DNA連接酶，總反應(yīng)體積20ul，16℃保溫24小時(shí)。
轉(zhuǎn)化受體菌為E.coli JM107，感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2處理的方法，加入連接產(chǎn)物到感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42℃熱擊90秒鐘后加入LB液體培養(yǎng)基并在37℃保溫1小時(shí)，涂布含氨芐青霉素+X-gal+IPTG的LB板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
將白色克隆接種放置于LB培養(yǎng)基(含100ug/ml氨芐青霉素)上的硝酸纖維膜上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，裂解，變性，中和并在80℃處理2小時(shí)固定核酸于膜上，50℃洗膜30分鐘，預(yù)洗液為5xSSC，0.5%SDS，1mMEDTA(pH8.0)，預(yù)雜交液為6xSSC，10xDenhardt溶液，0.1%SDS，125ug/ml小牛胸腺DNA，預(yù)雜交在65℃保溫2-4小時(shí)，預(yù)雜交后，加入以[r-32P]-ATP標(biāo)記的3′-引物作為探針，37℃過(guò)夜，洗膜溶液為6xSSC，溫度為52℃，洗膜時(shí)間5分鐘，-70℃放射自顯影，根據(jù)酶切分析結(jié)果挑選插入片斷在0.7kb左右的重組克隆。以煮沸法提質(zhì)粒，質(zhì)粒以NaOH(0.2M)堿變性(65℃保溫30分鐘)，加入NaAC(pH5.2)中和，加入2.5倍無(wú)水乙醇沉淀，以雙脫氧法進(jìn)行DNA序列分析，分析插入片斷的兩端序列，以確定完整的CP基因(pRCP).
從重組質(zhì)粒pRCP上切下CP片斷，將其亞克隆到M13mp18與mp19上，采用雙脫氧法和用ABI370ADNA序列儀同時(shí)進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)得的DNA序列如圖2。
Westernblotting檢測(cè)CP基因的表達(dá)。將CP基因克隆到pUC18上，用煮沸法小量提取部分重組質(zhì)粒，酶切后電泳檢測(cè)插入片斷的大小，篩選出插入片斷在0.7kb左右的重組克隆，加入IPTG(終濃為1mM)誘導(dǎo)表達(dá)，離心收獲細(xì)胞，用TE懸浮，加入2x上樣緩沖液(0.25MTris-ClpH6.8，20%蔗糖，1%SDS，1.0M硫基乙醇，0.25%溴酚蘭)，煮沸10分鐘，樣品經(jīng)過(guò)12%SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。預(yù)包被液為PBST(10mM磷酸緩沖液，pH7.2，150mMNaCl，0.05%Tween)+4%BSA，預(yù)包被時(shí)間為1小時(shí)(室溫)，加入抗血清在室溫下反應(yīng)2小時(shí)，在經(jīng)3次(每次30分鐘)的PBST洗膜后，加入羊抗兔IgG-HRP室溫反應(yīng)2小時(shí)，以同樣的方法洗膜后，加入硒試劑(100mg3，3′-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶于100ml100mMTris-Cl，pH7.5)與雙氧水顯色。結(jié)果顯示，外源的CP基因獲得相當(dāng)量的表達(dá)，其大小與CMV的外殼蛋白一致(24KD)，說(shuō)明合成的CMV-JV株系的外殼蛋白基因具有表達(dá)活性。
3.構(gòu)建CMV衛(wèi)星cDNA與殼蛋白基因至同一轉(zhuǎn)化載體使用的中間載體RoKⅡ其結(jié)構(gòu)如圖-3所示。含有T-DNA的左右邊界序列，花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子，藍(lán)曙紅合成酶轉(zhuǎn)錄終止序列，在兩者之間含有5個(gè)單一酶切位點(diǎn)(XbaⅠ，BamHⅠ，SmaⅠ，KpnⅠ，SacⅠ)，此外還具有既在細(xì)菌中，也在植物中表達(dá)的抗卡那霉素的選擇標(biāo)記。
以XbaⅠ與SacⅠ雙酶切下pUⅠ上的衛(wèi)星cDNA片斷，其方向與RoKⅡ中35s啟動(dòng)子方向一致。低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收衛(wèi)星cDNA片斷。中間載體RoKⅡ以同樣的酶雙酶切，并以低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收質(zhì)粒片斷。衛(wèi)星cDNA片斷與RoKⅡ的連接反應(yīng)條件為，20mM Tris-Cl(pH7.6)，10mM MgCl2，10mM DTT，0.6mM ATP，50ng衛(wèi)星cDNA片斷(XbaⅠ+SacⅠ)，2u T4 DNA連接酶，反應(yīng)總體積為20ul，整個(gè)反應(yīng)在16℃保溫過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ca2+方法處理的E.coliMCl022感受態(tài)細(xì)胞。小量制備轉(zhuǎn)化菌落質(zhì)粒，以XbaⅠ與SacⅠ雙酶電泳分析插入片斷以確定陽(yáng)性克隆(pRⅠ)將外殼蛋白基因組建到ROKⅡ中。先選出外殼蛋白基因片斷插入方向與RoKⅡ中35s啟動(dòng)子方向一致的克隆，以BamHⅠ與SacⅠ雙酶切下外殼蛋白基因片斷并以低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收。構(gòu)建外殼蛋白基因片斷到RoKⅡ中，其方法同上所述。小量制備轉(zhuǎn)化菌落質(zhì)粒并酶切分析以鑒定篩選插入有外殼蛋白基因片斷的陽(yáng)性克隆(pRCP).
構(gòu)建衛(wèi)星cDNA片斷與外殼蛋白基因到同一RoKⅡ載體中的實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖3。以BamHⅠ與SacⅠ雙酶切RoKⅡ并以低熔點(diǎn)瓊脂糖膠回收載體片斷(RoKⅡ，BamH+SacⅠ)，pRCP經(jīng)EcoRⅠ酶切后以大片斷酶補(bǔ)齊，然后以BamHⅠ酶切并回收連有終止序列的外殼蛋白基因片斷(CP-ter片斷);pRⅠ經(jīng)HindⅢ酶切后以大片斷酶補(bǔ)齊，然后以SacⅠ酶切并回收連有啟動(dòng)子片斷的衛(wèi)星cDNA片斷(35s-Sat片斷)。將CP-ter片斷與35s-Sat片斷連接到RoKⅡ上，其連接條件同前。整個(gè)反應(yīng)在16℃保溫24小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ca2+方法處理的E.coli MC1022感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)小量制備轉(zhuǎn)化菌落質(zhì)粒并酶切分析以鑒定插入有CP基因片斷與衛(wèi)星cDNA片斷的克隆(pRCPⅠ)。pRCPⅠ含有兩個(gè)表達(dá)盒，外殼蛋白基因與衛(wèi)星cDNA片斷分別插入到這兩個(gè)表達(dá)盒中，其排列方向與酶切位點(diǎn)見(jiàn)圖3。
經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析符合圖3嵌合基因中各成分的次序。
4.三菌接合將含pRCPⅠ的E.coliMCl022接種于含25ug/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，含pRD2013的E.coliHB101接種于LB培養(yǎng)液中，兩者都在37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。pAL4404農(nóng)桿菌也接種于LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)。在含卡那霉素培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的MCI022(含pRCPI)離心去上清，沉淀的細(xì)菌懸浮于10mlLB中。從3種培養(yǎng)細(xì)菌中，各取0.2ml的懸浮液，以不同的組合，涂布于不含抗菌素的MT無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)3天，然后將其單克隆在同種培養(yǎng)基的不同平板上分別劃線培養(yǎng)。如此重復(fù)3次以上，得到純化的克隆作為轉(zhuǎn)化用。
5.葉圓片轉(zhuǎn)化和植株再生將經(jīng)0.1%升汞消毒的煙草種籽在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，光照為每天16小時(shí)，光強(qiáng)度2000lx，溫度為25℃，1-1.5個(gè)月以后，將莖尖切下轉(zhuǎn)到新的MS培養(yǎng)基上，4個(gè)星期后再將莖尖轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基上，這樣就能不斷保證苗源供應(yīng)。
接種上述三菌接合的克隆至10ml的含50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，在30℃搖床上培養(yǎng)24小時(shí)，離心，細(xì)胞沉淀懸浮于10mlMS培養(yǎng)液中，從生長(zhǎng)4星期的煙草幼苗上選取健康而平展的葉片，用消毒的打孔器打取小圓片，放入有菌液的平皿中20-30分鐘，不時(shí)輕輕搖動(dòng)。再將這些沾有菌液小圓片放在含NBK培養(yǎng)基的平皿中，此培養(yǎng)皿中預(yù)先加進(jìn)1ml的經(jīng)兩星期培養(yǎng)的煙愈傷組織液，涂平，用消毒過(guò)的新華一號(hào)濾紙覆蓋，小圓片放在濾紙上，培養(yǎng)2天。
將在NBK培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天的葉小圓片移到含100ug/ml卡那霉素，500ug/ml羧芐霉素的NBK培養(yǎng)基中培養(yǎng)，光照條件同莖尖培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4周后，可形成小芽，將此小芽切下，轉(zhuǎn)到含100ug/ml卡那霉素，200ug/ml羧芐霉素的NM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，兩星期后開(kāi)始生根，1個(gè)多月后根系發(fā)達(dá)，移植在溫室花盆中培養(yǎng)。
6.檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中外殼蛋白和衛(wèi)星RNA的表達(dá)(1)外殼蛋白的檢測(cè)提取和制備蛋白。將0.2g轉(zhuǎn)基因煙草去中脈的葉片組織在液氮中研碎，轉(zhuǎn)移到5mleppendorf管中，加入200ul抽提緩沖液(30mM磷酸鉀pH7.5緩沖液，0.4M氯化鈉，10mM2-巰基乙醇)，室溫250rpm搖30分鐘，10000rpm離心10分鐘，取上清液，用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(10%分離膠，3%濃縮膠)。蛋白提取樣品加等體積裂解液(0.125MTris-HClpH6.8，4%SDS，10%2-巰基乙醇，0.04%溴酚蘭，20%甘油，0.1M二硫蘇糖醇)95℃水浴5分鐘，加樣，先100V電泳，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，150V電泳，直到指示劑移動(dòng)到分離膠的3/4處，終止電泳。
將提取和制備的蛋白樣品進(jìn)行Western blot雜交。膠在預(yù)處理液(20%甘油，50mM Tris-HCl pH7.5)中浸30分鐘。電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上。將Whatman濾紙和NC膜在轉(zhuǎn)移緩沖液(10mM NaHCO33mM Na2CO3)中浸潤(rùn)。在電轉(zhuǎn)移陰極依次鋪設(shè)3張濾紙，凝膠，NC膜和3張濾紙(鋪設(shè)中防止氣泡出現(xiàn))，300mA電轉(zhuǎn)移30分鐘，轉(zhuǎn)移完畢，將NC膜于室溫干燥2小時(shí)。
將NC膜在緩沖液PBS(10mMpH7.2磷酸納緩沖液，150mMNaCl)浸潤(rùn)3分鐘，加封閉液(PBS加4%BSA)室溫封閉2小時(shí)，加入1100的CMV抗血清，室溫反應(yīng)2小時(shí)。用PBST(PBS+0.05%Tween20)洗膜3次，每次10分鐘，加封閉液及11000羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)30分鐘，用PBST洗膜三次，每次10分鐘。將膜在顯色緩沖液(0.1MNaCl 0.1MTris，50mM MgCl2pH9.5)浸潤(rùn)3分鐘，加入顯色液(顯色緩沖液3.7ml+16.5ul NBT+13ul BCIP)顯色1-5分鐘。CP帶出，用蒸餾水沖洗NC膜5次，室溫晾干保存。
電轉(zhuǎn)移后的凝膠在染色液(20%甲醇，3.5%乙酸，0.25%考馬斯亮蘭)中染色30分鐘，加入脫色液(10%甲醇，10%乙酸)在搖床上脫色過(guò)夜，對(duì)比膠上分子量標(biāo)準(zhǔn)與NC膜上的色帶。
CP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的Northernblot雜交檢測(cè)。從轉(zhuǎn)基因植株中提取和制備RNA，提取的RNA用甲醛/瓊脂糖變性膠電泳分離。
將樣品電轉(zhuǎn)移到NC膜上。將膠先在水中浸泡，然后浸入50mMNaOH和10mMNaCl室溫保持45分鐘，用0.1MTris-Cl(pH7.5)中和，浸入20xSSC中1小時(shí)。按Westernblot中的同樣設(shè)計(jì)電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)后膜用3xSSC浸泡，空氣干燥1小時(shí)。將NC膜夾在兩張Whatman濾紙之間，固定兩邊，在80℃真空中干燥兩小時(shí)。
將膜放入雜交袋中，加入預(yù)雜交液(3xSSC，0.1%SDS，10xDenharts，100ug/ml鮭魚(yú)精DNA)，65℃預(yù)雜交過(guò)夜。
將25ngDNA95℃10分鐘變性，迅速置冰浴冷卻，加1uldGTP，1uldATP1uldTTP，2ul反應(yīng)混合物(試劑盒)，50uCi[α-32P]dCTP，補(bǔ)水到19ul.加入1ul大片段酶，37℃反應(yīng)30分鐘，將探針在100℃水浴5分鐘變性，加入含有預(yù)雜交液的雜交袋中，65℃雜交過(guò)夜。
將膜小心從雜交袋中取出，用2xSSC0.1%SDS，室溫洗3次，每次10分鐘，65℃洗二次，每次10分鐘，室溫干燥，用保鮮膜包好，
將膜放入雜交袋中，加入預(yù)雜交液(3xSSC，0.1%SDS，10xDenharts，100ug/ml鮭魚(yú)精DNA，65℃預(yù)雜交過(guò)夜。
將25ngDNA95℃10分鐘變性，迅速置冰浴冷卻，加1uldGTP，1uldATP1uldTTP，2ul反應(yīng)混合物(試劑盒)50uCl[-32P]dCTP，補(bǔ)水到19ul.加入1ul大片段酶，37℃反應(yīng)30分鐘，將探針在100℃水浴5分鐘變性加入含有預(yù)雜交液的雜交袋中，65℃雜交過(guò)夜。
將膜小心從雜交袋中取出，用2xSSC0.1%SDS，室溫洗3次，每次10分鐘，65℃洗二次，每次10分鐘，室溫干燥，用保鮮膜包好，放射自顯影。
(2)衛(wèi)星RNA的檢測(cè)不含衛(wèi)星RNA的CMV-B分別接種轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株，接種濃度約為50ug/ml，接種后用水輕輕沖洗，在防蟲(chóng)溫室中培養(yǎng)，測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中CMV濃度時(shí)，將葉片汁液適當(dāng)稀釋后，與未轉(zhuǎn)基因的半葉對(duì)比接種于昆諾黎的葉片上，發(fā)病后計(jì)枯斑數(shù)目。
提取衛(wèi)星dsRNA，將去中脈的0.5g葉片組織在液氮中研碎，迅速轉(zhuǎn)移到10ml離心管中，加入2mlGPS緩沖液(0.2M甘氨酸，0.1M磷酸氫二鈉，0.6M氯化鈉)10%SDS400ul和2-巰基乙醇3ul。室溫200rpm搖10分鐘，加入2ml水飽和酚液，室溫200rpm搖15分鐘。加入1ml氯仿-異戊醇(24∶1)溶液，室溫200rpm搖15分鐘。10000rpm離心15分鐘，取上清液，加入1/4體積的10MLiCl，混勻后放入冰-水浴中2小時(shí)。8000rpm離心20分鐘。取上清液，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH5.5)，2.5倍體積冷乙醇，混勻后，-20℃放置4小時(shí)。10000離心20分鐘，沉淀用70%乙醇洗1次，離心抽干沉淀，溶于200ulTE中，即獲得含有dsRNA的核酸樣品。
衛(wèi)星dsRNA的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。將相當(dāng)于20mg葉片重量的總核酸，加入等體積指示劑(含10%蔗糖，0.02%溴酚蘭，0.02%二甲苯蘭，用TAE配制)，加樣進(jìn)行電泳后進(jìn)行銀染，經(jīng)銀染的膠片，可清楚地顯示出各種核酸樣品的dsRNA區(qū)帶。
為進(jìn)行點(diǎn)雜交分析，從植物組織提取RNA。取0.6克轉(zhuǎn)基因植株葉片，加液氮磨碎后加入1.0ml預(yù)熱到90℃的1∶1體積酚-緩沖液(100mMLiCl，1%SDS，100mMTris-Cl，10mMEDTA，4M異硫氰酸胍，0.1M巰基乙醇)，65℃水浴保溫10分鐘，室溫中振搖10分鐘，加入0.5ml氯仿，振蕩后離心，取上清加入NaAC(pH5.2)及2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀核酸。
以自由引物法制備探針，取50-100ng衛(wèi)星cDNA片斷，100℃處理3分鐘以變性DNA加入自由引物，dATP，dGTP，dTTP和50uCl α-32P-dCTP以及大片斷酶，37℃保溫45分鐘，探針使用前需加熱變性。
取提取的總RNA樣品，加入甲酰胺(終濃度為50%，V/V)，甲醛(7% v/v)，SSC(lx)于68℃保溫15分鐘使RNA變性。將變性的RNA樣品真空抽濾點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上。將膜晾干，于80℃烘烤2小時(shí)后置于雜交袋中，加入預(yù)雜交液(50%甲酰胺，5xSSC，5xDenhardt 0.1% SDS，100ug/ml小牛胸腺DNA，于42℃預(yù)雜交2小時(shí)。雜交液為預(yù)雜交液與32P標(biāo)計(jì)的探針。于42℃雜交過(guò)夜。雜交完畢，取出雜交膜，以2xSSC-0.1% SDS洗膜，(室溫洗三次，再于68℃洗膜(1xSSC，0.1%SDS)1-1.5小時(shí)。將膜取出，晾干，壓片，并于-70℃爆光。
(3)轉(zhuǎn)基因煙草中CP和Sat-RNA的表達(dá)情況轉(zhuǎn)基因的當(dāng)代植株移栽花盆中成活后采樣測(cè)定CP表達(dá)。接種不含衛(wèi)星RNACMV-B兩周后，采樣測(cè)定Sat-RNA的表達(dá)。CP以Western和Northern雜交兩種方法分析，Sat-RNA以電泳和點(diǎn)雜交兩種方法分析。表1是上述結(jié)果的總結(jié)。用兩種方法檢測(cè)基因產(chǎn)物表達(dá)的結(jié)果是一致的。大多數(shù)轉(zhuǎn)嵌合基因的植株都同時(shí)表達(dá)兩種基因產(chǎn)物。

權(quán)利要求
1.一種用植物基因工程技術(shù)構(gòu)建抗黃瓜花葉病毒(CMV)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于將病毒外殼蛋白(CP)基因和衛(wèi)星RNA(SatRNA)基因同時(shí)引入植物染色體中，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物能同時(shí)表達(dá)病毒外殼蛋白和衛(wèi)星RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于外殼蛋白基因來(lái)自CMV-JV株，具有圖2的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法其特征在于衛(wèi)星RNA基因來(lái)自CMV衛(wèi)星RNA-I，具有
圖1的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法其特征在于外殼蛋白基因和衛(wèi)星RNA基因各自帶有自己的表達(dá)盒，將兩種基因同時(shí)引入中間載體，經(jīng)三菌接合，引入農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化植物葉片，再生出植株。
5.來(lái)自CMV-JV株的外殼蛋白基因，具有圖2的序列。
6.一種植物轉(zhuǎn)化載體，含有權(quán)利要求5的外殼蛋白基因和
圖1的衛(wèi)星RNA-1的基因，所說(shuō)的外殼蛋白基因和衛(wèi)星RNA基因各帶有花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和藍(lán)曙紅合成酶轉(zhuǎn)錄中止子序列。
7.一種含有權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化載體的細(xì)菌細(xì)胞。
8.一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，含有CMV-JV株的外殼蛋白基因，CMV衛(wèi)星RNA-1基因，所說(shuō)的外殼蛋白基因和衛(wèi)星RNA基因各帶有花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子和藍(lán)曙紅合成酶轉(zhuǎn)錄中止子序列。
9.一種選自包括權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的茄科植物，葫蘆科植物或十字花科植物。
10.一種按權(quán)利要求9的茄科植物。
11.一種按權(quán)利要求9的十字花科植物。
12.一種按權(quán)利要求9的葫蘆科植物。
全文摘要
本發(fā)明為一種用基因工程技術(shù)構(gòu)建新型的抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因植物的方法及基轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。將CMV外殼蛋白基因和CMV衛(wèi)星RNA基因同時(shí)引入植物染色體中，獲得再生植株，該兩種基因在轉(zhuǎn)基因植物中都得到表達(dá)。該方法適用于茄科，十字花科和葫蘆科等雙子葉植物。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1068144SQ9110407
公開(kāi)日1993年1月20日 申請(qǐng)日期1991年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月22日
發(fā)明者葉寅, 田波 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所