專利名稱：使用硫酯酶變異體的含有脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用硫酯酶變異體的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法。另外，本發(fā)明還涉及含有編碼硫酯酶變異體的基因的轉(zhuǎn)化體。
背景技術(shù)：
脂肪酸是脂質(zhì)的主要構(gòu)成成分之一，在生物體內(nèi)與甘油形成酯鍵而構(gòu)成三?；视偷戎|(zhì)，是在很多的動植物中作為能量源被儲存利用的物質(zhì)。在動植物中儲存的脂肪酸和脂質(zhì)作為食用或者工業(yè)用而被廣泛利用，例如作為單?；视汀⒍；视偷鹊氖称分虚g原料和其他各種工業(yè)制品的添加劑、中間原料而被利用。另外，還原碳原子數(shù)為12 18左右的聞級脂肪酸得到的聞級醇的衍生物被作為表面活性劑而使用。例如燒基硫酸酷鹽和燒基苯磺酸鹽等作為陰離子表面活性劑，另外，聚氧化烯烷基醚和烷基聚葡萄糖苷等作為非 離子性表面活性劑，都可以作為清洗劑或者殺菌劑而被利用。同樣，作為高級醇的衍生物的烷基胺鹽和單烷基季胺鹽或者二烷基季胺鹽作為纖維處理劑和毛發(fā)護(hù)發(fā)素或者殺菌劑，苯甲烷銨型季銨鹽作為殺菌劑和防腐劑而被日常利用。進(jìn)而，碳原子數(shù)為18左右的高級醇作為植物的成長促進(jìn)劑也有用。這樣脂肪酸類的利用覆蓋多方面，因此，嘗試在動植物等中提高在生物體內(nèi)的脂肪酸和脂質(zhì)的生產(chǎn)率。例如，提出有通過乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)的導(dǎo)入來提高種子中的脂質(zhì)量的方法(專利文獻(xiàn)I、非專利文獻(xiàn)I、專利文獻(xiàn)5);通過酵母sn-2酰基轉(zhuǎn)移酶(SLCl-I)的導(dǎo)入來提高種子中的脂質(zhì)量的方法(專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3以及非專利文獻(xiàn)2);通過二?；视王；D(zhuǎn)移酶基因(DGAT)的導(dǎo)入來提高種子中的脂質(zhì)量的方法(專利文獻(xiàn)4和非專利文獻(xiàn)3)等?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :特開2002-335786號公報專利文獻(xiàn)2 :特表平11-506323號公報專利文獻(xiàn)3 :國際公開第2008/076377號小冊子專利文獻(xiàn)4 :國際公開第2000/036114號小冊子專利文獻(xiàn)5 :美國專利第5，925，805號說明書非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Madoka Y, Tomizawa K, Mizoi J, Nishidal, Nagano Y, SasakiY. , uChloroplast transformation with modified accD operon increases acetyl-CoAcarboxylase and causes extension of leaf longevity and increase in seed yieldin tobacco”，Plant Cell Physiol. , 2002 Dec, 43 (12)，p. 1518-1525非專利文獻(xiàn)2 :Zou J, Katavic V, Giblin EM, Barton DL, MacKenzie SL, KellerWA, Hu X, Taylor DC. , “Modification of seed oil content and acyl compositionin the brassicaceae by expression of a yeast sn-2acyItransferase gene，，，PlantCell,1997 Jun，9 (6),p.909-923非專利文獻(xiàn)3 :Jako C, Kumar A, Wei Y, Zou J, Barton DL, Giblin EM, CovelloPS, Taylor DC.，“Seed-specific over-expression of an Arabidopsis cDNA encoding adiacylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight”, PlantPhysiol. , 2001, 126 (2) ,p. 861-87
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供使用改變了野生型硫酯酶的氨基酸序列的硫酯酶變異體，制造生產(chǎn)率優(yōu)異的脂肪酸或者含有此脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法。另外，本發(fā)明的課題在于提供含有硫酯酶變異體的、脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)生產(chǎn)能力提高的轉(zhuǎn)化體。 本發(fā)明者們?yōu)榱颂岣邉又参锏戎械闹|(zhì)生產(chǎn)率而進(jìn)行了詳細(xì)探討。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在將來自加州月桂(Umbellularia californica)的硫酯酶的氨基酸序列的一部分改變后，導(dǎo)入該硫酯酶變異體的轉(zhuǎn)化體中，與導(dǎo)入野生型硫酯酶的轉(zhuǎn)化體相比較，脂肪酸及含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)率顯著提高。本發(fā)明是基于此發(fā)現(xiàn)完成的。本發(fā)明涉及使用下述(a) (c)中的任意種的硫酯酶變異體的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法。(a)具有在序列號I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶變異體、(b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體、(c)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中與序列號I所示的氨基酸序列的從第84位至第382位相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄校揖哂辛蝓ッ富钚缘牧蝓ッ缸儺愺w。另外，本發(fā)明涉及提高含有脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)率的方法，該方法包含通過向宿主中導(dǎo)入編碼上述(a廣(C)中的任意種的硫酯酶變異體的基因，從而得到脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生廣能力提聞的轉(zhuǎn)化體的工序。進(jìn)一步，本發(fā)明還涉及向宿主中導(dǎo)入編碼上述(a廣(C)中的任意種的硫酯酶變異體的基因，從而得到脂肪酸或含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力提高的轉(zhuǎn)化體。根據(jù)本發(fā)明，可以提供使用硫酯酶變異體、生產(chǎn)率優(yōu)異的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供含有硫酯酶變異體的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力提高的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的制造方法以及轉(zhuǎn)化體可以適用于脂肪酸和脂質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明的上述以及其他的特征和優(yōu)點(diǎn)可以參照適合的附圖，從下述的記載中更明確。


[圖I]表示導(dǎo)入野生型硫酯酶基因或者硫酯酶變異體基因并轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中各脂肪酸的生產(chǎn)量的圖。另外，圖中的標(biāo)尺表示從連續(xù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差。[圖2]表示導(dǎo)入野生型硫酯酶基因或者硫酯酶變異體基因并轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中總脂肪酸生產(chǎn)量的圖。另外，圖中的標(biāo)尺表示從連續(xù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差。[圖3]表示由擬南芥野生株WT、導(dǎo)入野生型硫酯酶基因的擬南芥Pnapin_BTE、以及導(dǎo)入硫酯酶變異體基因的擬南芥=Pnapin-BTE (T231K)得到的種子中含有的總脂肪酸量的圖。[圖4]在導(dǎo)入硫酯酶變異體(BTE(MRR197RRH))基因的大腸桿菌、導(dǎo)入野生型硫酯酶(BTE)基因的大腸桿菌、以及導(dǎo)入硫酯酶變異體(BTE (T231K))基因的大腸桿菌中，比較各自的總脂肪酸生產(chǎn)量的圖。另外，總脂肪酸生產(chǎn)量通過合計C12 0到C18 1的各脂肪酸算出。各圖中的誤差棒(error bar)表示從來自3個獨(dú)立的克隆的培養(yǎng)液中所含的總脂 肪酸生產(chǎn)量算出的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法是使用下述(a) (c)中的任意種的硫酯酶變異體的方法。通過將該硫酯酶變異體用于脂肪酸或者脂質(zhì)的制造中，與使用野生型的硫酯酶的情況相比，可以顯著提高脂肪酸以及含有脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)率。I.硫酯酶變異體本發(fā)明中所用的硫酯酶變異體是下述的(a) (c)的硫酯酶變異體。(a)具有在序列號I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列(即，序列號3所表示的氨基酸序列)的硫酯酶變異體。作為本發(fā)明中使用的硫酯酶變異體的第I方式，是具有在序列號I所表示的氨基酸序列中與第231位相當(dāng)?shù)陌被釓奶K氨酸(Thr)取代為賴氨酸(Lys)而成的氨基酸序列的硫酯酶變異體。序列號I所表示的氨基酸序列為來自加州月桂(Umbellulariacalifornica,也稱作California bay)的硫酯酶的氨基酸序列(以下僅稱為野生型硫酯酶，簡記為BTE)。在序列號I所表示的野生型硫酯酶中，與第231位相當(dāng)?shù)陌被釓奶K氨酸取代為賴氨酸而成的硫酯酶變異體具有水解?；??；d體蛋白的硫酯鍵的活性(硫酯酶活性)。(b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體。作為第2方式，可以列舉具有在序列號I所表示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸，進(jìn)一步在該氨基酸序列的除第231位以外的位置上I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體。通常已知，編碼酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列不一定是必須全部區(qū)域的序列加以保留才顯示酶活性，也存在即使氨基酸序列改變了也不會影響酶活性的區(qū)域。在這樣的對于酶活性不必須的區(qū)域中，即使導(dǎo)入氨基酸的缺失、取代、插入或者添加這樣的變異，也可以維持酶本來的活性。在本發(fā)明中，可以使用通過由此保持了硫酯酶活性并且氨基酸序列的一部分缺失等改變了的變異體。這種情況下，被缺失、取代、插入、和/或添加的氨基酸優(yōu)選為f 10個，進(jìn)一步優(yōu)選為I飛個，特別優(yōu)選為廣2個。進(jìn)一步優(yōu)選具有在序列號I所示的氨基酸序列中氨基酸被保留如下、且第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的變異體，其中，該氨基酸被保留為第113位氨基酸為纈氨酸或者異亮氨酸，第114位氨基酸為精氨酸，第117位氨基酸為谷氨酸，第118位氨基酸為纈氨酸或者異亮氨酸，第134位氨基酸為谷氨酸或者精氨酸，第135位氨基酸為谷氨酸或者天冬氨酸，第136位氨基酸為蘇氨酸或者丙氨酸，第145位氨基酸為甘氨酸、第154位氨基酸為蘇氨酸或者丙氨酸，第162位氨基酸為亮氨酸，第163位氨基酸為異亮氨酸、苯丙氨酸或者蛋氨酸，第165位氨基酸為纈氨酸，第176位氨基酸為酪氨酸或者組氨酸，第177位氨基酸為脯氨酸，第179位氨基酸為色氨酸，第181位氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸或者天門冬氨，第185位氨基酸為異亮氨酸、纈氨酸或者蛋氨酸，第201位氨基酸為色氨酸或者苯丙氨酸，第215位氨基酸為丙氨酸或者半胱氨酸，第216位氨基酸為絲氨酸或者蘇氨酸，第217位氨基酸為絲氨酸，第222位氨基酸蛋氨酸、第226位氨基酸為蘇氨酸、第227位氨基酸為精氨酸或者賴氨酸，第229位氨基酸為亮氨酸、苯丙氨酸或者異亮氨酸、第239位氨基酸為谷氨酸或者賴氨酸，第257位氨基酸為賴氨酸或者精氨酸，第260位氨基酸為賴氨酸、精氨酸或者組氨酸，第300位氨基酸為脯氨酸，第309位氨 基酸為亮氨酸或者異亮氨酸，第314位氨基酸為亮氨酸、蛋氨酸或者纈氨酸，第315位氨基酸為谷氨酸或者天冬氨酸，第316位氨基酸為酪氨酸，第317位氨基酸為精氨酸或者賴氨酸，第318位氨基酸為精氨酸或者賴氨酸，第319位氨基酸為谷氨酸。另外，也優(yōu)選具有在序列號I所示的氨基酸序列中除了上面所舉的位置以外的區(qū)域內(nèi)I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且硫酯酶活性被保持的變異體。這種情況下，被缺失、取代、插入、和/或添加的氨基酸優(yōu)選為f 10個，進(jìn)一步優(yōu)選為Γ5個，特別優(yōu)選為I 2個。特別地，優(yōu)選使用具有與序列號I中第8Γ230位以及第232 382位的區(qū)域相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄斜槐Ａ簟⑶业?31位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列，而且硫酯酶活性被保持的變異體。另外，還優(yōu)選具有在序列號I所表示的氨基酸序列中除了上述所舉的位置以外的區(qū)域內(nèi)I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且硫酯酶活性被保持的變異體。在這種情況下，被缺失、取代、插入、和/或添加的氨基酸優(yōu)選為廣10個，進(jìn)一步優(yōu)選為Γ5個，特別優(yōu)選為Γ2個。(c)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中與序列號I所示的氨基酸序列的從第84位至第382位相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄?，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體。作為第3方式，可以舉上述(C)的變異體。這是在本發(fā)明中特別優(yōu)選的方式。已知在序列號I所表示的野生型硫酯酶的氨基酸序列中，從第84位至第382位的區(qū)域內(nèi)對于作為硫酯酶發(fā)揮作用特別重要，該蛋白質(zhì)是顯示硫酯酶活性非常必要的區(qū)域(參照 Voelker, T. A. , A. C. Worrell, L. Anderson, J. Bleibaum, C. Fan, D. H. Hawkins, S.E. Radke, and Η. M. Davies, “Fatty acid biosynthesis redirected to medium chainsin transgenic oilseed plants，，，Science, 1992，257，p. 72-74)。具有在序列號 I 所不的氨基酸序列中至少與從第84位至第382位的區(qū)域相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄械牡鞍踪|(zhì)能夠顯示硫酯酶活性。因此，具有在上述(a)或(b)的氨基酸序列中至少與序列號I所表示的氨基酸序列的從第84位至第382位的區(qū)域的氨基酸序列相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)也可以作為本發(fā)明的硫酯酶變異體使用。以下，將本發(fā)明中所用的上述(a) (c)的硫酯酶變異體統(tǒng)稱為硫酯酶變異體，簡記為 BTE (T231K)。
硫酯酶是作為參與甘油三酯生物合成體系的酶的?；?酰基載體蛋白(Acyl-ACP )硫酯酶，是水解作為葉綠體內(nèi)或者色素體中脂肪酸生物合成過程的中間體的?；??；d體蛋白(由作為脂肪酸殘基的酰基和?；d體蛋白構(gòu)成的復(fù)合體)的硫酯鍵，生成游離脂肪酸的酶。通過硫酯酶的作用，在?；d體蛋白上的脂肪酸合成結(jié)束，游離的脂肪酸從色素體被輸送供給到甘油三酯的合成中。已知硫酯酶根據(jù)構(gòu)成作為基質(zhì)的酰基-?；d體蛋白酶的脂肪酸殘基的種類不同而顯示不同的反應(yīng)特異性，因此被認(rèn)為是決定生物體內(nèi)的脂肪酸組成的重要因素。具有序列號I所表示的氨基酸序列的野生型硫酯酶在?；蠋в性鹿鹚?12 0)殘基的基質(zhì)上具有特別高的特異性。已知如果將野生型硫酯酶導(dǎo)入到大腸桿菌或者擬南芥中進(jìn)行轉(zhuǎn)化的話，在轉(zhuǎn)化體內(nèi)積累月桂酸(Journal of Bacteriology, Vol. 176, No. 23, p. 7320-7327，1994、特表平7-501924號公報)。另外，報道有在序列號I所表示的野生型硫酯酶的氨基酸序列中分別將第197位氨基酸從蛋氨酸取代為精氨酸，將第199位氨基酸從精氨酸取代為組氨酸，以及將第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而得到的酶變異體中， 特別高的基質(zhì)特異性從碳原子數(shù)為12 (C12 :0)的脂肪酸向碳原子數(shù)為14 (C14 :0)的脂肪酸變化(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92，pp. 10639-10643，1995)。進(jìn)一步，在該文獻(xiàn)中，記載了在僅將第231位氨基酸單獨(dú)從蘇氨酸取代為賴氨酸而得到的酶變異體中，在該基質(zhì)識別上沒有變化。但是，改變了野生型硫酯酶的氨基酸序列的硫酯酶變異體與野生型硫酯酶相比，提高在生物體內(nèi)的脂肪酸以及含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)率，對于此沒有任何的報告，這是這次本發(fā)明者們新得到的發(fā)現(xiàn)。作為本發(fā)明中使用的得到硫酯酶變異體的方法沒有特別限定，可以通過通常的遺傳工程學(xué)的方法得到。例如，獲取野生型硫酯酶的氨基酸序列信息或者堿基序列信息，基于這些信息通過部位特定變異導(dǎo)入法等對所希望的位置的氨基酸序列或者堿基序列進(jìn)行取代(變異)。野生型硫酯酶的氨基酸序列(序列號I)以及編碼此氨基酸序列的堿基序列(例如序列號2)可以由GenBank等數(shù)據(jù)庫中得到(例如,在GenBank中，蛋白質(zhì)序列AAA34215. I,mRNA序列M94159. I)。基于得到的序列，可以通過人工合成取得編碼野生型硫酯酶的基因?；虻娜斯ず铣煽梢岳肐rwitrogen公司等的服務(wù)。另外，也可以通過從加州月桂克隆編碼的野生型硫酯酶的基因而獲得，例如，可以通過Molecular Cloning-A LABORATORYMANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David ff. Russell, Cold Spring HarborLaboratory Press (2001)]記載的方法等進(jìn)行。作為部位特異變異的導(dǎo)入方法，可以列舉后述實(shí)施例中使用的利用重疊延伸拼接(Splicing overlap extension) (SOE) PCR 反應(yīng)(Horton et al. , Gene 77, 61-68, 1989)的方法、ODA 法(Hashimoto-Gotoh et al. , Gene, 152, 271-276，1995)、Kunkel 法(Kunkel,T. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985，82，488)等。另外，也可以利用定點(diǎn)突變系統(tǒng)(Site-Directed Mutagenesis System) Mutan-Super Express Kmi式劑盒(TAKARA ΒΙΟINC.)、轉(zhuǎn)化子 TM 定點(diǎn)突變(Transformer TM Site-Directed Mutagenesis)試劑盒(Clonetech公司)、K0D-Plus_Mutagenesis試劑盒(東洋紡社)等市售的試劑盒。其中，在本發(fā)明中優(yōu)選通過SOE-PCR法進(jìn)行。
作為調(diào)制編碼本發(fā)明中所用的硫酯酶變異體的基因的具體方法，首先用限制性內(nèi)切酶處理人工合成的野生型硫酯酶基因的堿基序列(例如，序列號2所表示的堿基序列)，并引入載體(vector)中。接著，將得到的載體DNA作為模板，例如，分別使用含有編碼在序列號I所表示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列的堿基序列的寡核苷酸(例如，具有序列號7或8所表示的堿基序列的寡核苷酸)作為一個引物，使用含有硫酯酶基因的兩個末端附近的堿基序列的寡核苷酸(例如，具有序列號5或6所表示的堿基序列的寡核苷酸)作為另一個引物，用PCR法擴(kuò)增2種DNA片段。將得到的2種DNA片段作為模板，再次使用含有硫酯酶基因的兩個末端附近的堿基序列的寡核苷酸引物(例如，具有序列號5或6所表示的堿基序列的寡核苷酸)，通過重疊延伸拼接(SOE) PCR可以得到具有序列號3所表示的氨基酸序列所對應(yīng)的堿基序列(例如，序列號4)的DNA片段。在此，作為PCR的反應(yīng)條件的優(yōu)選例子，可以舉在94° C下進(jìn)行將雙鏈DNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湹臒嶙冃苑磻?yīng)30秒鐘，再在55° C下進(jìn)行將引物對雜交于單鏈DNA上的退火反應(yīng)約30秒鐘， 再在72° C下進(jìn)行使DNA聚合酶作用的伸長反應(yīng)約70秒鐘，并將此作為一個循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)。2.轉(zhuǎn)化體本發(fā)明能夠提供如下轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體是向宿主中導(dǎo)入編碼上述(a廣(C)中的任意種的硫酯酶變異體的基因而得到的轉(zhuǎn)化體，并且脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力得到提高。具有編碼硫酯酶變異體的基因的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，與具有野生型硫酯酶基因的轉(zhuǎn)化體相比，脂肪酸和含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力顯著提高。另外，在本發(fā)明中，關(guān)于野生型硫酯酶以及硫酯酶變異體的脂肪酸和含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力，可以通過實(shí)施例中使用的方法進(jìn)行測定。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以通過將編碼硫酯酶變異體的基因通過常用的基因工程學(xué)的方法導(dǎo)入宿主中得到。具體而言，可以通過調(diào)制能使編碼硫酯酶變異體的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體，并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中使宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化而制作。接下來通過在適宜條件下培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體，可以在轉(zhuǎn)化體內(nèi)制造脂肪酸和含有脂肪酸的油脂。編碼硫酯酶變異體的基因的堿基序列可以從上述(a) (c)的硫酯酶變異體的氨基酸，通過通常的方法得到。具體來說，作為編碼硫酯酶變異體的基因的堿基序列，可以舉下述的(d) (f)的堿基序列，但是不限定于此。(d)序列號2所表示的堿基序列中編碼第69f693位的蘇氨酸的堿基被取代為編碼賴氨酸的堿基而成的堿基序列(例如，序列號4所表示的堿基序列)。(e)在(d)的堿基序列中除第691飛93位以外的I個至數(shù)個堿基被缺失、取代、插入、和/或添加而成的喊基序列，通過由該喊基序列構(gòu)成的DNA所編碼的蛋白質(zhì)具有硫酷酶活性。另外，對于被缺失、取代、插入和/或添加的堿基的位置以及個數(shù)，可以參照上述(b)的硫酯酶變異體的氨基酸序列的保留區(qū)域，以保持硫酯酶活性的方式進(jìn)行適當(dāng)設(shè)計。(f)至少含有在(d)或者(e)的堿基序列中與序列號2所示的堿基序列的從第250位至第1149位相當(dāng)?shù)膲A基序列的堿基序列。作為轉(zhuǎn)化體的宿主沒有特別限定，可以使用微生物、植物體、動物體。即使是本來不具有識別碳原子數(shù)為12的脂肪酸作為基質(zhì)的硫酯酶的生物也可以作為宿主使用。在本發(fā)明中，從制造效率和得到的脂肪酸以及脂質(zhì)的利用性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用微生物和植物體作為宿主。作為微生物，可以使用屬于埃希氏菌(Escherichia)屬的微生物和屬于芽孢桿菌(Bacillus)屬的微生物等原核生物，或者酵母和絲狀菌等真核微生物，其中，優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtil is)、圓紅冬抱酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、被抱霉菌(Mortierella巫_)，特另Il優(yōu)選大腸桿菌。作為植物體，優(yōu)選擬南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜籽、椰子、蹤櫚(palm)、萼距花(Cuphea)、麻瘋樹(Jatropha),特別優(yōu)選擬南芥。作為所使用的載體，只要是可以向宿主中導(dǎo)入編碼硫酯酶變異體的基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)可以表達(dá)該基因的載體都可以。例如，可以使用如下載體，該載體是具有與所導(dǎo)入的宿主的種類對應(yīng)的啟動子和終止子等的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域的表達(dá)載體，并且具有復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記等。另外，也可以是在質(zhì)粒等的染色體外自行增殖 復(fù)制的載體，也可以是引入至染色體內(nèi)的載體。
作為具體的載體，在將微生物作為宿主的情況下，例如可以列舉pBluescript IISK(-) (Stratagene 公司制造)、pUCl 19 (寶酒造公司制造)、pET 類載體(TAKARA BIO INC.制造)、pGEX類載體(GE Healthcare公司制造)、pCold類載體(TAKARA BIO INC.制造)、PHY300PLK (TAKARABIO INC.制造)、pUBllO (Mckenzie, T. et al.，(1986)，Plasmidl5(2) ;ρ· 93-103)、pBR322 (TAKARA BIO INC.制造)、pRS403 (STRATAGENE JAPAN Κ. K.制造)、PMW218/219 (NIPPON GENE CO. , LTD.制造)等。在將植物細(xì)胞作為宿主的情況下，例如，pRI類載體(TAKARABIO INC.制造)、pBI類載體(Clontech公司制造)、IN3類載體(INPLANTA INNOVATIONS INC.制造)等。特別在使用大腸桿菌作為宿主的情況下，優(yōu)選使用 pBluescript II SK(-) (Stratagene 公司制造)、pMW218/219 (NIPPON GENE CO. , LTD.制造)，在使用擬南芥作為宿主的情況下，優(yōu)選使用pRI類載體(TAKARA BIO INC.制造)、pBI類載體(Clontech公司制造)。啟動子和終止子等的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域和選擇標(biāo)記的種類也沒有特別限定，可以根據(jù)通常使用的導(dǎo)入啟動子和標(biāo)記等的宿主的種類進(jìn)行適當(dāng)選擇使用。具體來說，作為啟動子，可以舉Iac啟動子、trp啟動子、tac啟動子、trc啟動子、T7啟動子、SpoVG啟動子、花椰菜花葉病毒(Cauliflower mosaic virus) 35SRNA啟動子、肌動蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等看家基因(housekeeping gene)的啟動子、來自油菜籽的Napin基因啟動子、來自植物的Rubisco啟動子等。另外，作為選擇標(biāo)記，可以列舉抗生素抗性基因(氨芐青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、大觀霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、殺稻瘟素S抗性基因、雙丙氨磷抗性基因、以及潮霉素抗性基因)等抗藥基因。進(jìn)一步，也可以使用關(guān)系到營養(yǎng)要求性的基因的缺損等作為選擇標(biāo)記基因。可以通過將編碼硫酯酶變異體的基因通過限制內(nèi)切酶處理或者連接反應(yīng)等通常的方法引入這樣的載體中來構(gòu)筑轉(zhuǎn)化體用載體。作為轉(zhuǎn)化方法，只要是能向宿主中導(dǎo)入目標(biāo)基因的方法，就沒有特別限定。可以使用例如用I丐離子的方法、一般的感受態(tài)細(xì)胞(competent cells)轉(zhuǎn)化方法(J.Bacterial. 93,1925 (1967))、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(Mol. Gen. Genet. 168，111 (1979))、電穿孔法(FEMSMicrobiol. Lett. 55，135 (1990))或者 LP 轉(zhuǎn)化方法(T. Akamatsu 和 J.Sekiguchi, Archives ofMicrobiology, 1987, 146，ρ· 353-357;Τ· Akamatsu和 H. Taguchi, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65, 4, p. 823-829)等。
另外，導(dǎo)入目標(biāo)基因片段的轉(zhuǎn)化體的選擇可以利用選擇標(biāo)記等進(jìn)行。例如，來自載體的抗藥基因在轉(zhuǎn)化時與目標(biāo)DNA片段同時導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的結(jié)果，轉(zhuǎn)化體獲得抗藥性作為指標(biāo)進(jìn)行。另外，也可以通過將基因組作為模板的PCR法等，確認(rèn)目標(biāo)DNA片段的導(dǎo)入。3.脂肪酸以及含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法本發(fā)明的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法可以使用上述的硫酯酶變異體。具體來說，可以列舉使用含有編碼硫酯酶變異體的基因的轉(zhuǎn)化體的方法。另外，也可以使用精制的Acyl-ACP和硫酯酶通過在體外進(jìn)行從Acyl-ACP上分離脂肪酸的方法(Yuanet al.，PNAS, 1995，(92)，p. 10639-10643)等的方法來制造脂肪酸和脂質(zhì)。在本發(fā)明的制造方法中，優(yōu)選使用具有編碼硫酯酶變異體的基因的轉(zhuǎn)化體，在該變異體內(nèi)產(chǎn)生脂肪酸和含有該脂肪酸的脂質(zhì)，并進(jìn)行收集的方法。具體來說，優(yōu)選在得到導(dǎo)入上述的編碼硫酯酶變異體的基因的轉(zhuǎn)化體(重組體)之后，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)·繁殖該轉(zhuǎn)化體，并從培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)化體中收集脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)·繁殖條件可以根據(jù)基因被導(dǎo)入的宿主的種類進(jìn)行選擇，可以采用適當(dāng)優(yōu)選的條件。作為一個例子，可以舉在使用大腸桿菌作為宿主的轉(zhuǎn)化體的情況下，在LB培養(yǎng)基中在3(T37° C下進(jìn)行O. 5 1天培養(yǎng)?；蛘?，在使用擬南芥作為宿主的轉(zhuǎn)化體的情況下，在溫度條件為2(Γ25° C、連續(xù)照射白色光或者以明期為16小時且暗期為8小時等的光條件下進(jìn)行Γ2個月培育。另外，從脂肪酸和脂質(zhì)的生產(chǎn)效率的觀點(diǎn)出發(fā)，也可以在培養(yǎng)基中添加例如作為硫酯酶的基質(zhì)或者與脂肪酸生物合成體系相關(guān)的前體物質(zhì)的甘油、醋酸、丙二酸等。在培養(yǎng)·繁殖轉(zhuǎn)化體并產(chǎn)生脂肪酸和脂質(zhì)之后，通過從培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)化體中將脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)進(jìn)行分離、精制等，從而回收。作為分離、回收在轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的方法不特別限定，可以通過在分離通常生物體內(nèi)的脂質(zhì)成分等時候所用的方法進(jìn)行。例如，可以通過過濾、離心分離、細(xì)胞的破碎、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、氯仿/甲醇提取法、己烷提取法、乙醇提取法等從培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)化體中分離、回收脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)成分。另外，在更大規(guī)模的情況下，可以通過從培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)化體中壓榨或者提取油分進(jìn)行回收之后，進(jìn)行脫膠、脫酸、脫色、脫蠟、脫臭等一般的精制而得到脂質(zhì)。在分離了含有該脂肪酸的脂質(zhì)成分之后，可以通過水解分離了的脂質(zhì)來得到脂肪酸。作為從脂質(zhì)成分中分離脂肪酸的方法，具體來說可以列舉在堿溶液中以70° C左右的高溫進(jìn)行處理的方法、進(jìn)行脂肪酶處理的方法、使用高壓熱水進(jìn)行分解的方法等。 這樣可以使用硫酯酶變異體來制造脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)。特別地，本發(fā)明的制造方法優(yōu)選用于碳原子數(shù)為12以上的長鏈脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造，進(jìn)一步優(yōu)選用于碳原子數(shù)為12 18的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造，更加優(yōu)選用于碳原子數(shù)為12 14的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造，特別優(yōu)選用于制造月桂酸或者含有該月桂酸的脂質(zhì)的制造。通過本發(fā)明的制造方法、轉(zhuǎn)化體得到的脂肪酸和脂質(zhì)，除了用于食用之外，還可以作為乳化劑配合于化妝品等中，作為肥皂和洗劑等的洗滌劑、纖維處理劑、毛發(fā)護(hù)發(fā)素、或者殺菌劑和防腐劑來利用。實(shí)施例
以下，基于實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)地說明，但本發(fā)明不限定于此。實(shí)施例I將硫酯酶變異體[BTE (T231K)]基因?qū)氪竽c桿菌中的轉(zhuǎn)化體的構(gòu)筑以及轉(zhuǎn)化體中脂肪酸和脂質(zhì)的制造I.野生型硫酯酶(BTE)基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)筑將由序列號2所表示的堿基序列所構(gòu)成的編碼野生型硫酯酶的基因作為模板，通過使用下述表I所示的序列號5和序列號6的引物對的PCR反應(yīng)，得到野生型硫酯酶基因的DNA片段。另外，具有序列號2的堿基序列的基因利用Invitrogen (株)提供的定制合成服務(wù)獲得。用限制性內(nèi)切酶I消化由PCR反應(yīng)獲得的野生型硫酯酶基因片段。另外，用Xba I 消化質(zhì)粒載體 pBluescriptll SK(-) (Stratagene 公司，San Diego, California),之后進(jìn)行脫磷酸化處理。通過將這兩個限制性內(nèi)切酶消化物由連接反應(yīng)進(jìn)行連接，從而在pBluescriptll SK(-)的^ I位點(diǎn)上插入野生型硫酯酶基因片段(序列號2所表示的堿基序列中，第249位 第1149位堿基序列)，以與來自載體的LacZ蛋白質(zhì)的N末端側(cè)的第27位的氨基酸融合的形態(tài)來構(gòu)筑野生型硫酯酶表達(dá)的質(zhì)粒。所得到的質(zhì)粒通過DNA測序法確認(rèn)插入了編碼野生型硫酯酶的基因。2.硫酯酶變異體(BTE (T231K))基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)筑將上述I.中構(gòu)筑的野生型硫酯酶表達(dá)質(zhì)粒作為模板，通過使用下述表I所示的序列號5和序列號8的引物對、以及序列號6以及序列號7的引物對的PCR反應(yīng)來擴(kuò)增2種基因片段。將這兩種片段作為模板，再次使用序列號5以及序列號6的引物對進(jìn)行重疊延伸拼接法(SOE)PCR反應(yīng)(Horton et al.，Gene，77，61 — 68，1989)，獲得作為序列號2所表示的野生型硫酯酶的第691飛93位的堿基序列的ACA (Thr)被取代為AAG (Lys)而成的硫酯酶變異體基因的DNA片段。將得到的硫酯酶變異體基因的DNA片段用限制性內(nèi)切酶迪旦
I消化。另外，用Xba I消化質(zhì)粒載體pBluescriptll SK(-) (Stratagene公司),之后進(jìn)行脫磷酸化處理。通過將這兩種消化物用連接反應(yīng)進(jìn)行連接，從而在pBluescriptll SK(-)的Sm I位點(diǎn)上插入硫酯酶變異體基因片段(在序列號4所表示的堿基序列中，第249位"1149位的堿基序列)，以與來自載體的LacZ蛋白質(zhì)的N末端側(cè)第27位的氨基酸融合的形式來構(gòu)筑硫酯酶變異體表達(dá)的質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒通過DNA測序法，確認(rèn)插入了編碼硫酯酶變異體的基因。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其中， 所述制造方法使用下述(a) (C)中的任意種的硫酯酶變異體， Ca)具有在序列號I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶變異體、 (b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體、 (C)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中與序列號I所示的氨基酸序列的從第84位至第382位相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄?，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體。
2.如權(quán)利要求I所述的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其中， 所述制造方法包括 向宿主中導(dǎo)入編碼上述(a廣(C)中的任意種的硫酯酶變異體的基因，從而得到脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生廣能力提聞的轉(zhuǎn)化體的エ序；和從得到的轉(zhuǎn)化體中提取含有脂肪酸的脂質(zhì)的エ序。
3.如權(quán)利要求I或2所述的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其中， 所述脂肪酸為碳原子數(shù)為12以上的長鏈脂肪酸。
4.如權(quán)利要求Γ3中任一項所述的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其中， 所述脂肪酸為月桂酸。
5.如權(quán)利要求2 4中任一項所述的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其中， 所述宿主為植物或者微生物。
6.如權(quán)利要求2飛中任一項所述的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其中， 所述宿主為擬南芥或者大腸桿菌。
7.一種提高含有脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力的方法，其中， 所述方法包括向宿主中導(dǎo)入編碼下述(a廣(C)中的任意種的硫酯酶變異體的基因，從而得到脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力提高的轉(zhuǎn)化體的エ序， Ca)具有在序列號I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶變異體、 (b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體、 (C)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中與序列號I所示的氨基酸序列的從第84位至第382位相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄?，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體。
8.一種轉(zhuǎn)化體，其中， 所述轉(zhuǎn)化體是向宿主中導(dǎo)入編碼下述(a) (c)中的任意種的硫酯酶變異體的基因而得到的，并且提高脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力， Ca)具有在序列號I所示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列的硫酯酶變異體、 (b)具有在(a)的氨基酸序列中除第231位以外的I個至數(shù)個氨基酸被缺失、取代、插入、和/或添加而成的氨基酸序列，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體、 (C)至少具有在(a)或(b)的氨基酸序列中與序列號I所示的氨基酸序列的從第84位至第382位相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄?，而且具有硫酯酶活性的硫酯酶變異體。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述宿主為植物或者微生物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的轉(zhuǎn)化體，其中， 所述宿主為擬南芥或者大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用硫酯酶變異體的脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的制造方法，其中所述硫酯酶變異體具有在序列號1所示的氨基酸序列中第231位氨基酸從蘇氨酸取代為賴氨酸而成的氨基酸序列，并且，本發(fā)明還提供一種具有編碼該硫酯酶變異體的基因，并且能夠提高脂肪酸或者含有該脂肪酸的脂質(zhì)的生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體。
文檔編號C12N15/09GK102686737SQ201080058720
公開日2012年9月19日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者東條卓人, 遠(yuǎn)藤圭二 申請人:花王株式會社