專利名稱：單純皰疹病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請主要涉及可用于免疫患者以抵抗與慢性生殖器潰瘍相關(guān)的單純皰疹病毒2型(HSV-2)感染的疫苗。疫苗利用已被工程改造以表達(dá)高水平HSV- 2糖蛋白D抗原(gD2)的復(fù)制缺陷型HSV-2病毒。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HSV-2病毒還表達(dá)ー種或多種免疫調(diào)節(jié)基因，例如IL15和/或HSV-I或HSV-2主要抗原例如gB或gC。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(HSV)和HSV感染單純皰疹病毒2型(HSV-2)是生殖器潰瘍疾病的首要原因。其可引起急性生產(chǎn)性感染和特征在于不可預(yù)測的周期性流行的長期潛伏感染出6)。除了引起終生復(fù)發(fā)性生殖器潰瘍外，HSV感染還是AIDS患者的主要擔(dān)憂。已證明，生殖器HSV-2感染使性行為感染HIV感染(sexuallyacquiring HIV infection)的風(fēng)險(xiǎn)增加至3倍(20),并且在亞洲，該風(fēng)險(xiǎn)的增加可促成25-35%的伴隨性HIV感染(incident HIV infection) (I)。雖然大多數(shù)具有癥狀的HSV原發(fā)感染的嚴(yán)重度和持續(xù)時(shí)間可通過利用阿昔洛韋、伐昔洛韋或泛昔洛韋的ロ服或靜脈內(nèi)治療減輕，但抗病毒療法既不能防止從原發(fā)感染建立潛伏感染，也不能減少隨后的復(fù)發(fā)(66)。過去20年中生殖器皰疹在美國的持續(xù)傳播(19)和抗現(xiàn)有抗病毒藥物的HSV的遞增的發(fā)病率表明，需要抗HSV感染的安全有效的疫苗(31，60)。此外，HSV抑制療法導(dǎo)致感染了 HSV-2和HIV的婦女的生殖器粘膜和血漿中的HIV水平顯著降低的發(fā)現(xiàn)(52)表明，有效的HSV疫苗還可對HIV感染的控制具有重大影響(1，31)。HSV-2 糖蛋白 D(gD2)HSV糖蛋白D(gD)是在感染的細(xì)胞的表面(21)以及病毒包膜(24)上表達(dá)的最主要的病毒抗原之一。gD是病毒進(jìn)入細(xì)胞所必需的并且是抗HSV感染的中和抗體的主要靶(12、49、53)。此外，gD是HSV感染的人和鼠模型中的⑶4+T細(xì)胞(包括⑶4+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性)和CD8+T細(xì)胞的主要病毒革巴(27，28，30，34，47，65，75)。由于這些原因，gD已成為HSV亞單位疫苗開發(fā)的主要焦點(diǎn)(32，60)。在第3期臨床試驗(yàn)中，Stanberry等人顯示，利用來自HSV-2的重組gD(gD2)與佐劑AS04的組合的接種在保護(hù)HSV-血清陰性婦女免受生殖器皰疹疾病的發(fā)展中提供了73-74%的功效(62)。然而在男性和對于HSV-I呈血清陽性的受試者中未觀察到顯著的功效。雖然在免疫的宿主中檢測到gD2特異性體液和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，但還不清楚gD2/AS04在引發(fā)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中是否有效(31，32)。該研究表明，存在對引發(fā)針對gD2和其它HSV病毒抗原的更廣泛的體液以及⑶4和⑶8T細(xì)胞應(yīng)答的HSV疫苗的需要(29，31，32)。病毒疫苗已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，能夠在宿主中從頭合成免疫原的活病毒疫苗誘導(dǎo)比僅由肽或蛋白質(zhì)組成的疫苗更廣和更持久的免疫應(yīng)答。已開發(fā)了多種形式的復(fù)制缺陷型HSV和神經(jīng)減毒的(neuroattenuated)、具有復(fù)制能力的突變體,并且經(jīng)測試它們具有作為抗HSV感染的疫苗的潛能(US 7，223，411; (18))。因?yàn)閺?fù)制缺陷型病毒和神經(jīng)減毒的突變體可與野生型病毒一起共復(fù)制或在野生型病毒的背景中變得具有復(fù)制能力，因此它們用作人疫苗的用途導(dǎo)致了安全問題，特別是在具有潛伏HSV感染的個(gè)體中(33)。復(fù)制缺陷型HSV-I突變體可使嚙齒類動物腦中的潛伏HSV-I立即早期啟動子再活化的觀察結(jié)果已引起了關(guān)于下述可能性的另外的安全問題此類重組體觸發(fā)潛伏感染的個(gè)體中的生產(chǎn)性病毒感染的爆發(fā)的可能性出3)。因此，理想的復(fù)制缺陷型重組HSV疫苗不僅應(yīng)當(dāng)具有表達(dá)廣譜的病毒編碼的抗原的能力，而且還應(yīng)當(dāng)編碼當(dāng)在相同細(xì)胞內(nèi)遭遇時(shí)可阻止野生型HSV的裂解性感染的獨(dú)特功能。這樣的安全機(jī)制可使通過疫苗載體與野生型病毒在宿主中的重組引起的疫苗病毒的潛在爆發(fā)降至最低水平。、
發(fā)明概述一般而言，本發(fā)明基于四環(huán)素基因開關(guān)技術(shù)(tetracycline gene-switchtechnology) (T-REx, Invitrogen) (73)和HSV-1UL9多肽的顯性陰性突變體形式(例如UL9-C535C)用于開發(fā)抗HSV-2感染的安全有效的重組病毒疫苗的用途。在其第一方面，本發(fā)明涉及復(fù)制缺陷型、顯性陰性單純皰疹病毒2 (HSV-2)重組病毒。所述病毒的基因組至少具有，可操作地連接至第一啟動子的編碼第一 HSV-2糖蛋白D(gD2)的第一序列和，優(yōu)選地，可操作地連接至第二啟動子的編碼第二 HSV-2gD2的第二序列。將啟動子分別可操作地連接至第一四環(huán)素操縱子(tet-Ο)序列和第二 tet-Ο序列，當(dāng)不存在tet阻遏物時(shí)，所述操縱子序列各自允許進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)被阻遏物結(jié)合時(shí)，所述操縱子序列各自阻斷轉(zhuǎn)錄?；蚪M還包括連接至第三啟動子的編碼至少HSV-I或HSV-2UL9蛋白的第一顯性陰性突變體形式的第三序列和，優(yōu)選地，連接至第四啟動子的編碼HSV-I或HSV-2UL9蛋白的第二顯性陰性形式的第四序列。與第一和第二啟動子一祥，第三和第四啟動子各自可操作地連接至tet-Ο序列，其如果被tet阻遏物結(jié)合則阻斷轉(zhuǎn)錄。此外，病毒的基因組的特征在于，編碼功能性ICPO蛋白的序列的不存在。為了增強(qiáng)其抗原性，基因組應(yīng)當(dāng)優(yōu)選還表達(dá)免疫調(diào)節(jié)基因，例如IL12或IL15和/或HSV-I或HSV-2主要抗原例如gB或
gCo術(shù)語“可操作地連接”是指，以使它們能夠進(jìn)行它們的正常功能的方式連接在一起的基因元件。例如，當(dāng)基因的轉(zhuǎn)錄處于啟動子的控制之下并且該轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致由所述基因正常編碼的產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)，所述基因可操作地連接至啟動子。當(dāng)操縱子在結(jié)合的tet阻遏物存在的情況下阻斷從啟動子的轉(zhuǎn)錄，但在所述阻遏物不存在的情況下允許轉(zhuǎn)錄吋，tet操縱子序列可操作地連接至啟動子。術(shù)語“重組體”是指具有核酸序列的病毒，所述核酸序列有時(shí)通過核酸序列和序列元件的重組以及這些重組序列至病毒或至祖先病毒中的引入形成。優(yōu)選，所使用的啟動子是具有TATA元件的啟動子，并且連接至啟動子的tet操縱子序列具有兩個(gè)通過2至20個(gè)連接核苷酸連接在一起的op2阻遏物結(jié)合位點(diǎn)。操縱子序列的定位對于實(shí)現(xiàn)啟動子的有效控制是非常重要的。特別地，操縱子序列中的第一核苷酸必須位于TATA元件的最后ー個(gè)核苷酸的3’端的6至24個(gè)核苷酸之間。編碼例如gD或UL9的顯性陰性突變體多肽的結(jié)構(gòu)序列位于操縱子的3’端。其中特別優(yōu)選的啟動子為hCMV立即早期啟動子和HSV-I或HSV-2立即早期啟動子。特別優(yōu)選的是HSV-I或HSV-2ICP4啟動子。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明涉及可用于預(yù)防性或治療性抗HSV表達(dá)并且以單位劑量形式包含ー種或多種上述重組病毒的疫苗。術(shù)語“單位劑量形式”是指單個(gè)藥物施用實(shí)體例如片劑或膠囊。優(yōu)選，“單位劑量形式”可以是溶液，其中以這樣的濃度將藥物溶解在所述溶液中，當(dāng)通過注射給患者施用選擇的體積(単位劑量)并且所述體積見于注射瓶時(shí)，所述濃度提供治療性或預(yù)防性效果?；谛∈笾惺褂玫挠行┝?2x IO6PFU),據(jù)信人中的最小有效劑量應(yīng)當(dāng)為約Ix 107pfu。因此，單位劑量應(yīng)當(dāng)具有至少該量的病毒，通常為Ix IO7-IxIO9Pfu0可將疫苗以凍干的形式貯存并且在施用之前于藥學(xué)上可接受的載體中重建。或者，可將制劑本身貯存在媒介物中。單個(gè)劑量的疫苗的體積可發(fā)生變化，但一般說來，應(yīng)當(dāng)為約O. Iml至IOml，更常見地約O. 2ml至5ml。本發(fā)明還包括，通過給患者施用上述疫苗來免疫患者以抗HSV-I或HSV-2感染和由這樣的感染引起的病況(例如，生殖器皰疹潰瘍)的方法。還可給已被感染的患者提供 疫苗，以防止或減少病毒的爆發(fā)。用于給患者施用疫苗且不導(dǎo)致病毒的破壞的任何方法與本發(fā)明相客。通常，可通過胃腸外方法例如通過肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行施用?？墒褂帽绢I(lǐng)域的常規(guī)方法來確定疫苗施用的劑量和時(shí)間安排?？梢砸詥未位蚨啻巫⑸涫┯弥苿?。附圖概述圖IA和IB:圖IA顯示用于構(gòu)建顯性陰性和復(fù)制缺陷型HSV-2重組N2-C535C和CJ2-gD2的質(zhì)粒的示意圖。質(zhì)粒pHSV-2/ICPO是包含覆蓋HSV-2 ICPO開放閱讀框架(灰色框)的上游268bp至ICPO編碼序列的polyA信號的下游40bp的HSV-2ICP0序列的質(zhì)粒。通過用含XhoI的多克隆序列(MCS)替代含Xho I-ICP ODNA片段的序列來構(gòu)建pHSV2.ICP0-V。通過將LacZ基因(條紋框)插入pHSV2. ICPO-V的MCS區(qū)來產(chǎn)生pHSV2. ICPO-lacZ。通過用在含tetO的hCMV主要立即早期啟動子(線盒，CMVT0)控制下的編碼UL9-C535C的DNA序列(黑框)替代pHSV2. ICPO-IacZ的指定的含IacZ的片段來構(gòu)建p021acZ-T0C535C。通過用在含tetO的HSV-I立即早期ICP4啟動子(空心框，ICP4T0)控制下的編碼gD2基因的 DNA 序列(梯度框(gradient box))替代 p021acZT0-C535C 的指定的 SnaB I/PstI 片段來構(gòu)建 p021acZT0-gD2. C535C。圖IB 顯示野生型 HSV-2、HSV-2 ICPO 無效突變體(N2_lacZ)、N2_C535C 和 CJ2_gD2的基因組的示意圖。UL和US分別表示HSV-2基因組的獨(dú)特長區(qū)域和獨(dú)特短區(qū)域，所述區(qū)域側(cè)翼連接它們的相應(yīng)的反向重復(fù)區(qū)域(空心框)。以相反的取向用N2-lacZ的IacZ基因和用DNA序列對兩個(gè)拷貝的ICPO編碼序列的替代示于HSV-2基因組的擴(kuò)展的ICPO編碼序列下面，所述DNA序列(I)編碼處于N2-C535C中的含tetO的hCMV主要立即早期啟動子的控制之下的UL9-C535C和(2)編碼處于指定的含tetO的啟動子之下的UL9-C535C和gD2。圖2A和2B:這些圖顯示在Vero細(xì)胞的CJ2_gD2感染后gD2和UL9-C535C的高水平表達(dá)。在圖2A中，模擬(mock)感染或以10PFU/細(xì)胞的MOI用野生型HSV-2、N2_lacZ、N2-C535C或CJ2-gD2感染一式兩份的Vero細(xì)胞。在感染后9小吋，制備感染的細(xì)胞的提取物。在圖2B中，以10PFU/細(xì)胞的MO I用野生型HSV-I株系K0S、CJ9_gD、野生型HSV-2或CJ2-gD2感染VeiO細(xì)胞。在感染后9小時(shí)，制備感染的細(xì)胞的提取物。將感染的細(xì)胞的提取物中的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，隨后用抗HSV-lgD(R45)、UL9的多克隆抗體或特異于ICP27和gB的單克隆抗體(Santa Cruz)進(jìn)行免疫印跡。
圖3:圖 3 顯示 CJ2-gD2-感染的 VCEP4R-28 細(xì)胞中 tetR 對 gD2 和 UL9-C535C 表達(dá)的調(diào)節(jié)。以5x IO5細(xì)胞/60-mm培養(yǎng)皿接種VCEP4R-28細(xì)胞。在接種后第40小時(shí)，在四環(huán)素存在或不存在的情況下，模擬感染或以10PFU/細(xì)胞的MO I用野生型HSV-2或CJ2-gD2感染一式兩份的細(xì)胞。在感染后第9小時(shí)制備感染細(xì)胞提取物，然后用抗HSV gD和UL9的多克隆抗體以及特異于ICP27的單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。
圖4A和4B:這些圖顯示CJ2_gD2對野生型HSV-2的復(fù)制的反式顯性陰性效應(yīng)。在圖4A中，用2PFU/細(xì)胞的MO I的野生型HSV-2株系186、用2PFU/細(xì)胞的MOI的186和5PFU/細(xì)胞的MOI的CJ2-gD2、或用2PFU/細(xì)胞的MOI的186和5PFU/細(xì)胞的MOI的N2_lacZ感染一式三份的Vero細(xì)胞。在圖4B中，用5PFU/細(xì)胞的MOI的野生型HSV-2單獨(dú)感染、以對于兩種病毒都為5PFU/細(xì)胞的MOI用186和CJ2_gD2共感染、或用15PFU/細(xì)胞的MOI的186單獨(dú)感染、以及用15PFU/細(xì)胞的MOI的186和5PFU/細(xì)胞的MOI的CJ2_gD2共感染一式三份的Vero細(xì)胞。在感染后第18小時(shí)收獲感染的細(xì)胞，在Vero細(xì)胞單層上測定病毒滴度。病毒滴度表示為平均值+/-SD。圖頂部的數(shù)字表示単獨(dú)感染與共感染之間野生型病毒產(chǎn)量的倍數(shù)減少。圖5A和5B:這些圖顯示在腦內(nèi)接種后野生型HSV-2、株系186、N2-1 acZ、N2_C535C和CJ2-gD2在BALB/c小鼠中的神經(jīng)毒カ。將4至6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分配至5個(gè)組中，每組8只小鼠。用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，然后通過在4mm的深度上以20 μ I的體積腦內(nèi)注射入腦的左額葉來用DMEM、25PFU/小鼠的野生型HSV-2株系186、lx IO6PFU/小鼠的N2-lacZ、2. 5x IO6PFU/小鼠的CJ2_gD2或N2-C535C接種小鼠。在接種后檢查小鼠的疾病的體征和癥狀，進(jìn)行35天。圖5A顯示注射后不同天時(shí)的疾病的評分，圖5B顯示小鼠存活的百分比。圖6A和6B:圖6A和6B涉及gD2特異性抗體和HSV-2-中和應(yīng)答的誘導(dǎo)。用 DMEM(n=7，6，8，8)假免疫或用 CJ 2_gD2 (n=7，6，8，8)、N2-C535C (n=7，8，6)或 CJ9-gD(n=6, 8，6)以2x IO6PFU/小鼠的劑量免疫雌性4至6周齡BALB/c小鼠，2周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在初始免疫后4-5周，從小鼠的尾靜脈獲得血液。在圖6A中，將來自單個(gè)組的小鼠的血清混合并且加熱滅活。測定HSV-2特異性中和抗體的滴度。結(jié)果表示為平均滴度土SEM。在圖6B中，將來自假免疫的、CJ2-gD2、N2-C535C或CJ9_gD免疫的小鼠的血清與從用表達(dá)gD2的質(zhì)粒p02. 4T0-gD2轉(zhuǎn)染的U20S細(xì)胞制備的細(xì)胞提取物一起溫育。用蛋白A沉淀gD/小鼠IgG特異性復(fù)合物，在SDS-PAGE上進(jìn)行分離，用gD特異性多克隆抗體R45進(jìn)行探測。圖7A-7D:這些圖涉及HSV-2-特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答在CJ2_gD2免疫小鼠中的誘導(dǎo)。以2周的間隔假免疫或用CJ2-gD2免疫(2x IO6PFU/小鼠)雌性BALB/c小鼠2次。在圖7A和7B中，在加強(qiáng)免疫后9-10周，模擬感染或以Ix IO4PFU/小鼠的劑量用野生型HSV-2皮下感染假免疫的小鼠和免疫的小鼠(n=3)。在攻擊后第5天，通過IFN- Y ELISP0T測定，利用各自純化的使用Dynal小鼠⑶4-和⑶8-陰性試劑盒從小鼠脾分離的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞分析⑶4+和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。在圖7C和7D，在加強(qiáng)免疫后5_6周，模擬感染或用野生型HSV-2感染假免疫的和CJ2-gD2免疫的小鼠，然后在感染后第4天進(jìn)行I FN-Y ELISP0T測定(n=3)。IFN-Y斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的數(shù)目表示為平均值土 SEM/百萬CD4+或CD8+T細(xì)胞。
圖8:圖8顯示用CJ2_gD2免疫的小鼠中攻擊性HSV-2陰道復(fù)制的減少。將雌性4至6周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分配至4組，每組10只小鼠。用DMEM模擬免疫或以2x IO6PFU/小鼠的劑量用CJ2-gD2、N2-C535C或CJ9_gD免疫小鼠。2周后加強(qiáng)免疫小鼠。第5周，用甲羥孕酮預(yù)處理小鼠，然后用5x IO5PFU的HSV-2株系G陰道內(nèi)攻擊小鼠。在攻擊后第I、
2、3、5和7天獲取陰道拭樣。通過在Veix)細(xì)胞單層上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)噬斑測定來估量拭樣材料中的感染性病毒。病毒滴度表示為單個(gè)陰道拭樣的平均值土SEM。圖9A和9B:這些圖顯示用CJ2_gD2免疫的小鼠中HSV-2疾病的預(yù)防。在用野生型HSV-2攻擊后，在21天的隨訪期中觀察圖8的圖例中描述的單個(gè)小鼠的生殖器和傳播性HSV-2疾病的發(fā)病率(圖9A)以及存活率(圖9B)，使用下列等級0=無體兆，1=輕微生殖器紅斑和浮腫，2=中度生殖器炎癥，3=化膿性生殖器損傷和/或全身性疾病，4=后肢癱瘓， 5=死亡。

圖10:圖 10 顯示 HSV-1UL9-C535C 編碼序列(SEQ ID NO: 2) UL9-C535C 由 UL9 的氨基酸l-10、Thr-Met-Gly三肽以及UL9的氨基酸535至851組成(參見Yao，等人出9))。發(fā)明詳述本發(fā)明基于概念使用四環(huán)素基因開關(guān)技術(shù)和HSV-1UL9的顯性陰性突變體多肽來開發(fā)HSV重組病毒，所述HSV重組病毒是復(fù)制缺陷型的并且能夠抑制野生型HSV感染(顯性-陰性)。CJ9-gD為原型顯性-陰性、復(fù)制缺陷型HSV-I重組病毒并且不依賴于HSV病毒DNA復(fù)制地表達(dá)高水平的HSV-I主要抗原糖蛋白D(gD) (7)。在其最優(yōu)選形式中，本發(fā)明使用編碼2個(gè)拷貝的由含tetO的HSV-I主要立即早期ICP4啟動子驅(qū)動的HSV_2gD (gD2)基因的顯性-陰性和復(fù)制缺陷型HSV-2重組體(CJ2-gD2)。CJ2-gD2與野生型HSV-2 —樣有效地表達(dá)gD2，并且可在共感染的細(xì)胞中對野生型HSV-2的復(fù)制產(chǎn)生強(qiáng)大的反式抑制作用。利用CJ2-gD2的免疫引發(fā)有效的HSV-2特異性中和抗體以及T細(xì)胞應(yīng)答，并且在小鼠中提供完全的抗野生型HSV-2的陰道內(nèi)感染的保護(hù)作用。CJ2_gD2在抗野生型HSV-2生殖器感染和疾病的保護(hù)作用方面是比CJ9_gD更有效的疫苗。此外，高劑量的CJ2-gD2的腦內(nèi)注射不會引起小鼠的死亡或發(fā)病。總體來說，這些觀察結(jié)果表明，CJ2-gD2在抗人的HSV-2生殖器感染和疾病的保護(hù)中具有優(yōu)于常規(guī)復(fù)制缺陷型病毒疫苗和HSV-2亞單位疫苗的有利方面。Tet操縱子/阻遏物開關(guān)和重組DNA本發(fā)明涉及，特別地，具有其表達(dá)受四環(huán)素操縱子和阻遏蛋白調(diào)節(jié)的基因的病毒。之前已描述了可用于產(chǎn)生包含這些元件和DNA序列的重組DNA分子的方法(參見US
6,444, 871;US 6，251，640和US5，972，650)并且包含四環(huán)素可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄開關(guān)的質(zhì)粒是商購可得的(T-REx , Inv i trogen, CA)。本發(fā)明的DNA的基本特征是，可操作地連接至啟動子(優(yōu)選具有TATA元件)的基因的存在。Tet操縱子序列位于啟動子的TATA元件中的最后ー個(gè)核苷酸的3’端的6至24個(gè)核苷酸之間和基因的5’端?？蓪⒉《九囵B(yǎng)在細(xì)胞中，所述細(xì)胞表達(dá)tet阻遏物以阻斷基因轉(zhuǎn)錄和允許病毒復(fù)制。tet阻遏物與操縱子序列的結(jié)合強(qiáng)度通過使用包含兩個(gè)通過2-20，優(yōu)選1-3或10-13個(gè)核苷酸連接的op2阻遏物結(jié)合位點(diǎn)(每ー個(gè)這樣的結(jié)合位點(diǎn)具有核苷酸序列TCCCTATCAGTGATAGAGA(SEQ IDNO:1))的操縱子形式來增強(qiáng)。當(dāng)阻遏物結(jié)合該操縱子時(shí)，連接的基因不轉(zhuǎn)錄或幾乎不轉(zhuǎn)錄。如果具有這些特征的DNA存在于也表達(dá)四環(huán)素阻遏物的細(xì)胞中，那么可阻止病毒感染的基因的轉(zhuǎn)錄將被與操縱子結(jié)合的阻遏物阻斷，并且將發(fā)生病毒的復(fù)制。啟動子和基因的選擇在生產(chǎn)性感染過程中，HSV基因表達(dá)基于表達(dá)的時(shí)間順序分成3個(gè)主要種類立即早期レ)、早期(β)和晩期U)，晩期基因進(jìn)ー步細(xì)分成兩個(gè)組Y I和Y 2。立即早期基因的表達(dá)不需要從頭病毒蛋白質(zhì)合成，并且當(dāng)病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)被與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子一起的病毒體相關(guān)蛋白VP16激活。立即早期基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物被稱為感染細(xì)胞多肽ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，并且正是這些基因的啟動子優(yōu)選被用于指導(dǎo)本文中論述的重組基因的表達(dá)。ICPO在增強(qiáng)HSV從潛伏再活化中起著主要作用，并且以低感染復(fù)數(shù)賦予病毒顯著的生長優(yōu)勢。ICP4是HSV-I的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，其激活病毒早期和晩期基因的表達(dá)。ICP27是生產(chǎn)性病毒感染所必需的并且是有效的病毒DNA復(fù)制以及病毒Y基因和一個(gè)亞組的病毒β基因的最佳表達(dá)所需要的。ICP47在HSV感染過程中的功能似乎是，下調(diào)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類在感染的細(xì)胞表面上的表達(dá)。HSV-1UL9-C535C的編碼區(qū)的HSV-1基因組序列的全長序列示于圖10 (SEQ IDNO:2)中。用于重組病毒的其它序列在本領(lǐng)域中都是公知的。例如HSV-I的全長基因組序列可見于GenBank序列Χ14112。HSV-1ICP4序列可見于GenBank號Χ06461 ；HSV-1糖蛋白D 可見于 GenBank 序列 J02217 ;HSV_2 糖蛋白 D 可見于 GenBank 號 KO1408 ;并且 HSV-1UL 9基因可見于GenBank序列M19120 (其全都通過引用整體并入本文)。Tet阻遏物的包含和病毒的產(chǎn)生HSV ICPO和ICP4啟動子的序列以及其調(diào)控受它們內(nèi)源控制的基因的序列在本領(lǐng)域中是公知的(43，44，56)，并且先前已描述了用于產(chǎn)生包含這些元件的病毒載體的方法(參見美國公開申請2005-0266564)。這些啟動子不僅在促進(jìn)基因表達(dá)中非?；钴S，而且它們還被VP16 (當(dāng)HSV-I或HSV-2感染細(xì)胞時(shí)釋放的反式激活物)特異性誘導(dǎo)。一旦產(chǎn)生適當(dāng)?shù)腄NA構(gòu)建體，可使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法(通常參見，Yao等人
(68))將它們整合入HSV-2病毒中。免疫方法通常通過將本文中描述的病毒作為疫苗進(jìn)行注射來將所述病毒用于免疫個(gè)體和/或患者?？深A(yù)防性使用疫苗以預(yù)防HSV-I或HSV-2感染或可治療性使用疫苗以減輕已發(fā)生的HSV-I或HSV-2感染的嚴(yán)重性。為了制備疫苗，可將病毒懸浮在任何藥學(xué)上可接受的溶液中，包括無菌等滲鹽水、水、磷酸緩沖鹽溶液、1，2-丙ニ醇、與水混合的聚こニ醇、林格液等。待施用的病毒的確切數(shù)目對于本發(fā)明不是至關(guān)重要的，但應(yīng)當(dāng)為“有效量”，即足以引發(fā)強(qiáng)度足以抑制HSV感染的免疫應(yīng)答的量。通常，預(yù)期最初施用的病毒的數(shù)目(PFU)為IxIO7 至 Ix IO10 個(gè)?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法測試對攻擊HSV是有效的抗體的存在，從而估量劑量的有效性以及總體治療的有效性?？筛鶕?jù)需要，重復(fù)免疫學(xué)注射多次。
實(shí)施例 本實(shí)施例描述了 HSV-2重組病毒的產(chǎn)生和測定其免疫學(xué)效果的測試。
I.材料和方法細(xì)胞在100U/ml青霉素G和100 U g/ml硫酸鏈霉素(GIBCO，Carlsbad, CA)存在的情況下，將非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞和骨肉瘤系U20S細(xì)胞培養(yǎng)和維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM;Sigma Aldrich)中(71)。U20S細(xì)胞能夠在功能上互補(bǔ)HSV-1ICP0缺失(71)。U2CEP4R11細(xì)胞是維持在DMEM+10%FBS和50 u g/ml的潮霉素B中的表達(dá)tetR的U20S細(xì)胞(73)。VCEP4R-28細(xì)胞是維持在DMEM+10%FBS和50 u g/ml的潮霉素B中的表達(dá)tetR的Vero細(xì)胞(73)。質(zhì)粒 質(zhì)粒pHSV2/1CPO是pUC19衍生的質(zhì)粒，其編碼覆蓋HSV-21CPO開放閱讀框架(ORF)的上游268bp至ICPO編碼序列的poly A信號的下游40bp的PCR擴(kuò)增的HSV-2ICP0序列。pHSV2. 10 0-￥為肥￥-210 0克隆質(zhì)粒，其通過用含有乂110 I的多克隆序列(MCS)替代包含ICPO的起始密碼子的上游25bp序列至ICP00RF的終止密碼子的上游397bp的XhoI-ICP ODNA 片段而從質(zhì)粒 pHSV2/ICP0 產(chǎn)生。質(zhì)粒 pHSV2. ICPO-IacZ 通過將 pcDNA3_lacZ的含HindIII-Not I-LacZ基因的片段于Hind III-Not I位點(diǎn)處插入pHSV2. I CP0-V而產(chǎn)生。pcmvtet0-UL9C535C是編碼在含tetO的hCMV立即早期啟動子的控制之下的UL9-C535C的質(zhì)粒(68)。通過用 pcmvtet0UL9-C535C(69)的含有EcoRI/Hind III-hcmvtet0_UL9C535C的片段替代PHSV2. ICPO-IacZ的含EcoR I/Age I-IacZ的片段，構(gòu)建了表達(dá)由含tetO的hCMV主要立即早期啟動子驅(qū)動的UL9-C535C的p021acZ_T0C535C(圖1A)。pAzgD-HSV-2 是 Dr. Patricia Spear (Northwestern University)饋贈的編碼HSV-2gD2的質(zhì)粒。pICP4T0-hEGF表達(dá)處于含tetO的HSV-I立即早期ICP4啟動子控制之下的人表皮生長因子，所述啟動子由從_377bp至_19bp(相對于ICP4基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))的HSV-IICP4啟動子序列組成。與質(zhì)粒pcmvtetO-hEGF(73)中的含tetO的hCMV主要立即早期啟動子相似，含tetO的ICP4啟動子在ICP4TATA元件TATATGA的下游IObp處包含2個(gè)串聯(lián)拷貝的tet操縱子。因此，與pcmvtetO-hEGF —祥，從pICP4T0_hEGF進(jìn)行的hEGF表達(dá)在tetR存在的情況下可受到四環(huán)素的密切調(diào)控，tetO的插入在tetR不存在的情況下對ICP4啟動子的活性沒有影響。與pICP4T0-hEGF中的具有tetO的ICP4啟動子相關(guān)的另外的獨(dú)特性質(zhì)是，不存在ICP4DNA結(jié)合序列ATCGTCCACACGGAG (SEQ ID NO: 3),所述序列在野生型ICP4啟動子中覆蓋ICP4基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(51)。因此，與受到ICP4的自我調(diào)節(jié)的野生型ICP4啟動子(16，57)不同，pICP4T0-hEGF中具有tetO的ICP4啟動子將不被HSV-I主要調(diào)節(jié)蛋白ICP4抑制。為了克隆處于含tetO的ICP4啟動子的控制之下的gD2，我們首先通過將pICP4T0-hEGF 中的含 Sma I-Bam HI tetO 的 ICP4 啟動子克隆入載體 pHSV2. ICPO-V 的 MCS中來構(gòu)建質(zhì)粒p02ICP4-T0。p02. 4T0-gD2為p02ICP4_T0衍生的質(zhì)粒，其編碼處于具有tetO的ICP4啟動子控制之下的pAzgD-HSV-2的gD2基因。P021acZT0-gD2.C535C是編碼處于具有tetO的hCMV立即早期啟動子(在hCMV啟動子的_236bp處具有5’截?cái)?控制之下的UL9-C535C和處于tetO_ICP4啟動子控制之下的gD2基因的質(zhì)粒(圖1A)，其通過用p02. 4T0-gD2的含有Hind III/Pst I_gD2的片段替代 p021acZT0-C535C 的 SnaB !/PstI 片段而產(chǎn)生。在 p021acZT0_gD2. C535C 中，UL9-C535C基因和gD2基因的轉(zhuǎn)錄處于相反取向。病毒在Veix)細(xì)胞上進(jìn)行野生型HSV-2，株系186和G的繁殖和空斑試驗(yàn)。N2_lacZ為編碼處于HSV-2 ICPO啟動子控制之下的Lac Z基因的HSV-2ICP0無效突變體，其中通過用Nhe I-線性化的pHSV2. ICPO-IacZ轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞，然后如先前所述(74)用HSV-2超感染U20S細(xì)胞，從而通過同源重組用pHSV2. ICPO-IacZ中的Lac Z基因替代兩個(gè)拷貝的ICPO基因。ICPO基因座上Lac Z基因?qū)CPO基因的替代可利用側(cè)翼于I CPO基因的引物和特異于lac Z基因的引物，通過N2-lacZ病毒DNA的PCR分析來進(jìn)行確認(rèn)(41，74)。N2-C535C是N2_lacZ的衍生物，其中兩個(gè)拷貝的Lac Z基因都被編碼處于質(zhì)粒p021acZ-T0C535C的含tetO的hCMV啟動子控制之下的UL9-C535C的DNA序列替代(圖1B)。簡而言之,利用Lipofectamine2000，用線性化的p021acZ_T0C535C和感染性N2_lacZ病毒DNA共轉(zhuǎn)染U2CEP4R11細(xì)胞。利用標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)，就包含cmvtet0UL9_C535C的DNA序列對N2-lacZ的IacZ基因的重組替代篩選轉(zhuǎn)染的后代。轉(zhuǎn)染后96小時(shí)，用5_溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)對空斑進(jìn)行染色。分離反映兩個(gè)拷貝的I acZ基因都被編碼UL 9-C535C DNA的序列取代的白色空斑。分離株之一(命名為N2-C535C)在4輪空斑純化后產(chǎn)生一致的白色空斑。通過用編碼處于具有tetO的hCMV主要立即早期啟動子控制之下的UL9-C535C和處于含tetO的HSV-IICP4啟動子控制之下的gD2的DNA序列替代N2_lacZ的ICPO基因座上的兩個(gè)拷貝的Lac Z基因來構(gòu)建CJ2-gD2(圖1B)，所述HSV-1ICP4啟動子由從_377bp至-19bp (相對于ICP4基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))的HSV-1ICP4啟動子序列組成(71)。SDS-PAGE 和 Western 印跡分析模擬感染或用10PFU/細(xì)胞的MOI的指定的病毒感染以7. 5x IO5個(gè)細(xì)胞/皿接種在60mm培養(yǎng)皿中的Vero細(xì)胞。在感染后第9小時(shí)或16小時(shí)制備細(xì)胞提取物(72)。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) (9%丙烯酰胺)分離細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟こ烯(PVDF)膜上，用抗HSV-IgD的多克隆抗體(R45，Dr s. Gary H. Cohen和Roselyn J Eisenberg的禮物)、抗UL9的多克隆抗體(Mark Challberg的禮物)或特異于 ICP27 和 gB 的單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)進(jìn)行探測。小鼠4-6 周齡的雌性 BALB/c 小鼠購自 Charles River Laboratories(Wilmington, MA)。將小鼠關(guān)在金屬籠中，每籠4只小鼠，在12小時(shí)的光照/黑暗周期下進(jìn)行維持。使小鼠適應(yīng)關(guān)養(yǎng)環(huán)境I周，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照由哈佛醫(yī)學(xué)院動物區(qū)常務(wù)委員會(Harvard Medical Area Standing Committee on Animals)和美國獸醫(yī)T力、會(AmericanVeterinary Medical Association)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行所有動物實(shí)驗(yàn)。免疫和攻擊將BALB/c小鼠隨機(jī)分成幾個(gè)組并且修剪它們左后肋上的毛發(fā)。使用配備有27規(guī)針的Iil注射器在左后肋以30iil的體積用2x IO6PFU/小鼠的CJ2-gD2、N2-C535C、CJ9-gD皮下接種小鼠或用DMEM皮下模擬接種小鼠。2周后對小鼠進(jìn)行增強(qiáng)免疫，在第2次免疫后3周用野生型HSV-2株系G進(jìn)行攻擊。在攻擊之前5天，以20 Ul的體積用3mg/小鼠的甲輕孕酮(SIC0R Pharmaceuticals, Inc. , Irvine, CA)在頸部皮下注射小鼠(7,50)。為了進(jìn)行陰道內(nèi)攻擊，麻酔所有組中的小鼠，用藻酸鈣拭子(無菌尿道-生殖器藻酸鈣鑲齒的敷料器,Puritan Medical Produc tscompany LLC, Guilford, Maine USA)預(yù)先進(jìn)行拭抹,然后用20 ill含有5x IO5PFU (50LD50)的HSV-2株系G的培養(yǎng)基陰道內(nèi)接種所有組中的小鼠(50)。在麻酔的影響下使小鼠背躺著，且其后部被抬高，在感染后進(jìn)行30-45分鐘。急性感染測定和臨床觀察在攻擊后第1、2、3、5和7天，用藻酸鈣拭抹陰道粘膜(7)。通過標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)在Vero細(xì)胞單層上估量拭樣材料中的感染性病毒。在用野生型HSV-2攻擊后，在21天的隨訪期中每天評估小鼠的生殖器損傷和全身性疾病的體征。如下對疾病的嚴(yán)重度評分0=無皰診感染跡象，1=輕微生殖器紅斑和浮腫，2=中等生殖器炎癥，3=化膿性生殖器損傷和/或全身性疾病，4=后肢癱瘓以及5=死亡(8，50)。、HSV-2特異性中和抗體的檢測在初始免疫后4周，從免疫的和模擬免疫的小鼠的尾靜脈收集血液。如之前所述，在補(bǔ)體存在的情況下(5-7)用250PFU的野生型HSV-2株系186測定中和血清抗體滴度。中和抗體滴度表示為達(dá)到HSV PFU的50%減少(相對于在培養(yǎng)基+單獨(dú)的補(bǔ)體中獲得的HSVPFU)所需的最終血清稀釋度。免疫沉淀在接種后24小時(shí)，利用Iipofectamine 2000，模擬轉(zhuǎn)染或用10 ii gp 02. 4T0_gD轉(zhuǎn)染以7. 5x IO6個(gè)細(xì)胞/100-mm皿接種的U20S細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)制備細(xì)胞提取物(72)。通過將IOiU從模擬免疫的小鼠和免疫的小鼠收集的混合血清與70iU的上述制備的細(xì)胞提取物混合，進(jìn)行免疫沉淀。用蛋白A(Pierce Classic IP試劑盒，PierceBiotechnology, Rockford, IL)沉淀gD/小鼠IgG特異性復(fù)合物,將其在SDS-PAGE上分離，用兔抗gD特異性多克隆抗體R45進(jìn)行探測，然后與綴合有HRP的山羊抗兔IgG (Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA)進(jìn)ィ丁反應(yīng)。IFN-Y ELISP0T 測定以2周的間隔用DMEM假免疫或以2x IO6PFU/小鼠的劑量用CJ 2_gD2免疫雌性BALB/c小鼠兩次。在第二次免疫后5至10周，模擬攻擊或以Ix IO4PFU/小鼠的劑量用野生型HSV-2株系186皮下攻擊假免疫的和CJ2-gD2免疫的小鼠。在攻擊后第4或5天，從單個(gè)組的小鼠(n=3)分離脾細(xì)胞。如先前所描述的(42)，進(jìn)行⑶4+和⑶8+T細(xì)胞ELISP0T測定。簡而言之，使用Dyna I小鼠⑶4或⑶8陰性分離試劑盒從脾細(xì)胞分離⑶4+和⑶8+T細(xì)胞，以7.5x IO4或1.5x IO5個(gè)細(xì)胞/孔將所述細(xì)胞以一式四份接種在用抗小鼠IFN-Y特異性單克隆抗體(AN18)預(yù)包被的96孔過濾板中。在37°C下溫育20小時(shí)后，洗滌孔，在室溫下與生物素化的IFN-Y特異性單克隆抗體(R4-6A2，Mabtech)反應(yīng)，然后用鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶(Mabtech)進(jìn)行溫育。通過加入BCIP/NBT底物檢測IFN-Y點(diǎn)形成細(xì)胞。在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)點(diǎn)，將I FN-Y點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的數(shù)目表示為平均值土SEM/百萬CD4+或 CD8+T 細(xì)胞。定量實(shí)時(shí)PCR在加強(qiáng)免疫后16天或用5x IO5PFU的HSV-2株系G陰道內(nèi)攻擊后21天，從9或10只已用CJ2-gD2或CJ9-gD免疫的小鼠收集脊柱的下腰和骶骨部分(包括脊髄和背根神經(jīng)節(jié))。將脊柱切成4片，每一片分別保持在0. 5ml的正常生長培養(yǎng)基中并且于_80°C下貯存，以待進(jìn)一步處理。使用DNeasy tissue kit (Qiagen, Santa Clarita, CA)從姆一個(gè)背根神經(jīng)節(jié)分離總DNA，將其懸浮于400 u I AE緩沖液中。如之前所述(8)，利用IOOng神經(jīng)節(jié)DNA和特異于HSV DNA聚合酶的引物(正向5’GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C(SEQ ID NO:4),反向5’CGG GGC GCT CGG CTA AC (SEQ ID NO: 5))通過實(shí)時(shí) PCR (Applied Biosystems7300Real-Time PCR System)定量HSV-2DNA的存在?？扇菀椎貦z測到的HSV-2病毒DNA的最少拷貝為I個(gè)拷貝/反應(yīng)。統(tǒng)計(jì)分析為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行非配對學(xué)生t檢驗(yàn)。當(dāng)P值小于0. 05時(shí)，結(jié)果被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
II.結(jié)果CJ2_gD2 的構(gòu)建作為產(chǎn)生表達(dá)gD2和UL9-C535C的顯性-陰性和復(fù)制缺陷型HSV-2重組病毒的第一步驟，我們構(gòu)建了 HSV-2ICP0缺失突變體N2-lacZ，其中HSV-2株系186中的兩個(gè)拷貝的ICPO基因都被處于HSV-2ICP0啟動子控制之下的LacZ基因替代(圖1B)。我們顯示，與HSV-I ICPO無效突變體7314(11)類似，N2-lacZ在人骨肉瘤系U20S細(xì)胞上的空斑形成效率為Vero細(xì)胞中的425倍，這表明U20S細(xì)胞中的細(xì)胞活性也可功能性替代HSV-2ICP0。與野生型HSV-2相比較，N2-lacZ在Vero細(xì)胞中的復(fù)制效率在0. IPFU/細(xì)胞的MOI時(shí)降低至1/600以下。與該發(fā)現(xiàn)一致，以Ix IO5和5x IO5PFU/小鼠進(jìn)行的N2-1 acZ的陰道內(nèi)接種導(dǎo)致無局部疾病或全身性疾病，然而用Ix IO4PFU/小鼠的野生型HSV-2感染的小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的生殖器皰疹，并且到感染后11天為止，全部死亡。此外，N2-lacZ在以5xIO5PFU/小鼠的劑量陰道內(nèi)感染后不能建立可再活化的潛伏感染。這些結(jié)果表明，與HSV-IICP0(10, 11，37，64)類似，HSV-2 ICPO的缺失顯著減弱病毒在體內(nèi)引發(fā)急性和可再活化的潛伏感染的能力。為了獲得顯性-陰性和復(fù)制缺陷型HSV-2病毒重組體的gD2表達(dá)的最高水平，我們通過用編碼由具有tetO的HSV-I主要早期立即ICP4啟動子驅(qū)動的gD2基因和處于含tetO的hCMV主要立即早期啟動子(在hCMV立即早期啟動子的全長的_236bp處具有截?cái)?控制之下的UL9-C535C的DNA序列替代N2_lacZ中的兩個(gè)拷貝的Lac Z基因，構(gòu)建了顯性-陰性和復(fù)制缺陷型HSV-2重組體(CJ2-gD2)(圖IB)。因此，與在HSV-1UL9基因座上編碼單個(gè)拷貝的由含tetO的hCMV啟動子驅(qū)動的插入的HSV-IgD基因的CJ9_gD(41)不同，CJ2-gD2包含2個(gè)拷貝的由具有tetO的HSV-I立即早期ICP4啟動子控制的gD2基因，所述啟動子由從_377bp至-19bp (相對于ICP4基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))的HSV-I ICP4啟動子序列組成。N2-C535C為HSV-2重組體，其中N2_lacZ中的兩個(gè)拷貝的Lac Z基因都被處于全長的具有tetO的hCMV立即早期啟動子的控制之下的UL9-C535C替代。CJ2-gD2在感染的Vero細(xì)胞中表達(dá)高水平的gD2和UL9-C535C為了檢查gD2和UL9-C535C分別從具有tetO的HSV-1立即早期ICP4啟動子和hCMV立即早期啟動子的表達(dá)，以10PFU/細(xì)胞的MOI用野生型HSV-2、N2-lacZ、N2-C535C和CJ2-gD2感染Vero細(xì)胞，在感染后9小時(shí)收獲細(xì)胞。利用HSV-1/2ICP27單克隆抗體、UL9多克隆抗體和gDl多克隆抗體(R45)通過western印跡測定分析感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)。由于gB2與gD2 —祥，是中和抗體以及T細(xì)胞應(yīng)答的主要靶并且為Y I產(chǎn)物，因此也用gB特異性單克隆抗體探測感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)。圖2A顯示，CJ2-gD2和N2-C535C表達(dá)的HSV-2立即早期蛋白ICP27水平與由野生型HSV-2和N2-lacZ表達(dá)的相似。雖然在CJ2_gD2和N2-C535C感染的細(xì)胞中檢測到顯著量的UL9-C535C，但在N2-C535C感染的細(xì)胞中幾乎未檢測到gD2或gB2。然而，與N2-C535C感染相反，CJ2_gD2對Vero細(xì)胞的感染導(dǎo)致gD2以高水平表達(dá)，與由野生型HSV-2感染的細(xì)胞中的gD2的水平相似，并且gD2表達(dá)對gB2表達(dá)沒有影響。結(jié)果還表明，與HSV-I ICPO無效突變體7134(71) 一祥，N2_lacZ中HSV-2ICP0的缺失大大減少了 gD2的表達(dá)。由于UL9以極低水平從其真實(shí)HSV早期啟動子表達(dá)(68)，因此在被這4種不同病毒感染的細(xì)胞中未檢測到野生型UL9。此外，我們觀察到，UL9-C535C在CJ2-gD2感染的細(xì)胞中的表達(dá)水平一致地高于由N2-C535C感染的細(xì)胞中的水平，這表明存在于HSV-1ICP4啟動子中的HSV VP16效應(yīng)元件TAATGARAT (71)可導(dǎo)致增強(qiáng)的UL9-C535C 從描述的雜合ICP4/hCMV啟動子系統(tǒng)的hCMV立即早期啟動子的表達(dá)。圖2B中顯示的利用gDl多克隆抗體(R45)的Western印跡分析顯示,在野生型HSV-I感染的細(xì)胞中檢測到比用野生型HSV-2感染的細(xì)胞中更高的gD水平，并且在CJ9-gD感染的細(xì)胞中檢測到的gD水平顯著低于CJ2-gD2感染的細(xì)胞中的水平。該發(fā)現(xiàn)表明，CJ2-gD2表達(dá)gD2比CJ9-gD表達(dá)gDl更有效。為了證明在CJ2-gD2_感染的Vero細(xì)胞中表達(dá)的UL9-C535C和gD2確實(shí)處于具有tetO的啟動子控制之下，我們隨后在四環(huán)素不存在或存在的情況下以IOPFU/細(xì)胞的MOI用野生型HSV-2和CJ2-gD2感染穩(wěn)定表達(dá)tetR的Vero細(xì)胞系、VCEP4R-28細(xì)胞。在感染后第9小時(shí)收獲來自感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)，并通過western印跡分析所述蛋白質(zhì)。如可觀察到的(圖3)，雖然在四環(huán)素不存在和存在的情況下，在野生型HSV-2和CJ2-gD2感染的VCEP4R-28細(xì)胞中都檢測到相似水平的ICP27，但僅當(dāng)四環(huán)素存在時(shí)在CJ2-gD2感染的VCEP4R-28細(xì)胞中檢測到UL9-C535C，并且在四環(huán)存在的情況下檢測到顯著更高的gD2水平(與四環(huán)素不存在的情況相比)。CJ2_gD2不能在Vero細(xì)胞中復(fù)制由于不存在ICPO并且UL9-C535C從含tetO的hCMV主要立即早期啟動子高水平表達(dá)，因此CJ2-gD2必須進(jìn)行構(gòu)建并且在表達(dá)tetR的ICPO互補(bǔ)U20S細(xì)胞系U2CEP4R11中進(jìn)行增殖(68)。我們在Vero細(xì)胞單層上空斑測定了 6. 65x IO7PFU的CJ2_gD2，并且未檢測到感染性病毒，這表明與其互補(bǔ)U2CEP4R11細(xì)胞相比較，CJ2-gD2在Vero細(xì)胞中的空斑形成效率降低至少6. 65x IO7倍。CJ2-gD2對野生型HSV-2復(fù)制的抑制我們隨后通過共轉(zhuǎn)染測定來測試由CJ2-gD2表達(dá)的高水平UL9-C535C對野生型HSV-2病毒復(fù)制的顯性-陰性效應(yīng)(圖4)。圖4A顯示，5PFU/細(xì)胞的MOI的CJ2_gD2和2PFU/細(xì)胞的MOI的野生型HSV-2對Vero細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致野生型HSV-2的產(chǎn)量減少至接近1/500(與由相同MOI的野生型HSV-2單獨(dú)感染的細(xì)胞相比較)，無論病毒滴度是在Vero細(xì)胞中測定的還是在U2CEP4R11細(xì)胞中測定的。當(dāng)利用N2-lacZ進(jìn)行相似的共感染實(shí)驗(yàn)吋，幾乎未檢測到野生型病毒產(chǎn)量的減少。為了進(jìn)一步檢查CJ2_gD2在抑制野生型HSV-2的復(fù)制中的潛能，我們分別以1:1和3:1的MOI比率利用野生型HSV-2和CJ2-gD2進(jìn)行了共感染實(shí)驗(yàn)。圖4B中的結(jié)果顯示，CJ2-gD2在兩種條件下在預(yù)防野生型HSV-2感染中是有效的，導(dǎo)致與分別用5PFU/細(xì)胞和15PFU/細(xì)胞的MOI的野生型HSV-2單獨(dú)感染的細(xì)胞相比較，在指定的共感染比率下野生型病毒合成降至約1/151和1/94。CJ2-gD2在小鼠的腦內(nèi)注射后是無毒力的神經(jīng)毒カ是HSV感染的標(biāo)志之一。為了測定CJ2_gD2和N2-C535C在CNS中復(fù)制的能力，將5至6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分配至5個(gè)組，每組8只小鼠。使用28規(guī)胰島素針將CJ2-gD2和N2-C535C于20 體積中以2. 5x IO6PFU/小鼠在左額葉的4mm的深度處直接接種入每一只小鼠腦內(nèi)(74)。監(jiān)測發(fā)病率和死亡率，進(jìn)行35天。由于野生型HSV-2株系186的LD5tl在玻璃體內(nèi)注射后在雌性BALB/c小鼠中為約10PFU (38)，因此也用25PFU/小鼠的野生型HSV-2接種ー組小鼠。作為另外的對照，用Ix IO6PFU/小鼠的N2-lacZ接種第5組中的小鼠。圖5顯示，與用DMEM接種的小鼠一祥，用CJ2-gD2和N2-C535C以2. 5xIO6PFU的劑量腦內(nèi)接種的小鼠在35天的隨訪過程中未顯示神經(jīng)毒カ的體征，然而用野生型HSV-2以25PFU/小鼠的劑量(為給予用CJ2-gD2接種的小鼠的1/100，000)接種的所有小鼠在接種后10天全部死亡，并且所有接種的小鼠都顯示通常與HSV-2感染相關(guān)的CNS疾 病的體征，包括粗糙不平的毛皮(roughened fur)、騎背姿勢(hunched posture)、共濟(jì)失調(diào)(ataxia)和厭食癥。雖然100%的用N2_lacZ接種的小鼠存活，但所有小鼠都顯示腦炎的體征。在用CJ2_gD2免疫的小鼠中誘導(dǎo)HSV-2特異性中和抗體和gD2特異性抗體應(yīng)答在用CJ 2-gD2以2x IO6PFU的劑量免疫的小鼠中測定CJ2_gD2引發(fā)抗HSV-2特異性中和抗體的能力。作為對照，也用相同劑量的N2-C535C或CJ9-gD免疫小鼠的組。如所顯示的(圖6A)，用CJ2-gD2免疫的小鼠中HSV-2特異性中和抗體滴度的平均值平均為500，其為用N2-C535C免疫的小鼠的3倍(p=0. 015)，并且與在CJ9_gD免疫的小鼠中誘導(dǎo)的中和抗體滴度相當(dāng)(P=O. 28)。在1:10稀釋度上于模擬接種的小鼠中未檢測到抗HSV-2特異性抗體滴度。圖6B顯示，雖然當(dāng)用抗gDl抗體R45探測各自免疫沉淀的gD2復(fù)合物時(shí)，在用CJ2-gD2與CJ9-gD免疫的小鼠之間檢測到相似水平的gD特異性抗體應(yīng)答，但用CJ2_gD2免疫的小鼠中抗gD特異性抗體的水平顯著高于用N2-C535C免疫的小鼠和模擬接種的對照中的水平。綜合起來，圖6中所示的結(jié)果表明，由CJ2-gD2產(chǎn)生的gD2的高水平表達(dá)導(dǎo)致與N2-C535C相比較，在引發(fā)抗gD2抗體以及抗HSV-2特異性中和抗體應(yīng)答方面增加的功效。用CJ2_gD2免疫的小鼠中HSV-2特異性T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)為了評估CJ2_gD2免疫在引發(fā)HSV-2特異性T細(xì)胞應(yīng)答中的功效，我們進(jìn)行回憶實(shí)驗(yàn)，以檢查在用野生型HSV-2攻擊后免疫小鼠中的記憶T細(xì)胞應(yīng)答。首先，在加強(qiáng)免疫后9-10周，模擬攻擊或用野生型HSV-2攻擊假接種的和CJ2-gD2接種的小鼠，然后在攻擊后第5天利用從單組的小鼠(n=3)的脾分離的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞進(jìn)行IFN- y EU SPOT測定(圖7A)。用野生型HSV-2攻擊的CJ2-gD2接種的小鼠與模擬感染的CJ2_gD2免疫小鼠相比較，IFN- y -陽性⑶4+T細(xì)胞增加至4. 8倍(p〈0. 0001)。更顯著地，在先前用CJ2_gD2接種的HSV-2感染的小鼠中檢測到的IFN- y分泌性⑶4+T細(xì)胞的數(shù)目為HSV-2感染的假接種的小鼠的18倍(p〈0. 0001)。在相同的條件下在假接種的模擬感染的對照小鼠中未檢測到IFN- y -陽性⑶4+T細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)顯示，利用CJ2-gD2的免疫引發(fā)強(qiáng)記憶⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答。雖然與假接種的對照相比較，在CJ2-gD2接種的小鼠中存在2倍的IFN- y -分泌性CD8+T細(xì)胞，但在HSV-2感染的假接種的小鼠和HSV-2感染的CJ2_gD2接種的小鼠中檢測到相似數(shù)目的IFN- y -分泌性⑶8+T細(xì)胞(圖7B)。因此，我們進(jìn)行了第二組回憶實(shí)驗(yàn)(recalIexperiment)，其中在第二次接種后5_6周模擬攻擊或用野生型HSV-2 (n=3)攻擊假接種的和CJ2-gD2接種的小鼠。在感染后第4天進(jìn)行⑶4+和⑶8+ELISP0T測定(圖7C和7D)。與模擬感染的CJ2-gD2免疫小鼠相比較，在HSV-2感染后在CJ2_gD2免疫小鼠中分別檢測到IFN- y -分泌性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞增加至8. 6倍和5. 7倍(⑶4+T細(xì)胞p=0. 035 ；⑶8+T細(xì)胞p=0. 01)。此外，在用HSV-2攻擊后，與假接種的小鼠相比較，在CJ2-gD2接種的小鼠中IFN- y -分泌性⑶4+和⑶8+T細(xì)胞分別增加至8倍和9. 5倍(⑶4+T細(xì)胞p=0. 036 ；⑶8+T細(xì)胞p=0. 01)。總地來說，這些研究顯示，利用CJ2-gD2的免疫可引起強(qiáng)勁的HSV-2特異性記⑶4+和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答，所述應(yīng)答可在HS V-2感染過程中被有效地回憶。免疫的小鼠中抗HSV-2生殖器感染和疾病的保護(hù)作用在初始免疫后5至6周，用50LD5Q(5x IO5PFU/小鼠)的HSV-2株系G陰道內(nèi)攻擊小鼠。在攻擊后第1、2、3、5和7天獲取陰道拭樣。在21天的隨訪期中觀察小鼠的生殖器和散發(fā)性HSV-2疾病的發(fā)病率。如圖8A中顯示的，與模擬免疫的對照(n=10)相比較，在用CJ2-gD2免疫的小鼠(n=9)中，攻擊性病毒的產(chǎn)量在第I天降至低于1/200 (p〈0. 001)，并且在第2天降至低于1/130 (p〈0. 0001)。雖然在攻擊后第1、2和3天，在用CJ2-gD2和N2-C535C免疫的小鼠的組(n=10)之間，在攻擊性病毒脫落的減少上不存在顯著差異，但利用CJ2-gD2的免疫在第I天(p=0. 03)、第2天(p=0. 025)和第3天(p〈0. 007)在減少攻擊性病毒脫落中比CJ9-gD更有效。在攻擊后第5天，在用CJ2-gD2、N2-C535C或CJ9_gD免疫的小鼠中未檢測到或幾乎未檢測到攻擊性病毒，然而，所有模擬接種的小鼠繼續(xù)以超過5x103PFU/ml的平均產(chǎn)量脫落病毒。在3個(gè)免疫小鼠組中，在攻擊后第7天收集的陰道拭樣材料中不存在攻擊性病毒。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到，雖然在攻擊后第5天在CJ2-gD2免疫的小鼠中沒有病毒脫落，但在7只N2-C535C免疫的小鼠的5只中和7只CJ9_gD免疫的小鼠的4只中檢測到野生型HSV-2的存在。圖9中的結(jié)果顯示，用CJ2_gD2免疫的小鼠在用野生型HSV-2攻擊后，完全免受局部生殖器損傷的發(fā)生并且未顯示全身性疾病的體征(圖9A)。所有模擬免疫的小鼠在攻擊后第11天之前產(chǎn)生嚴(yán)重的生殖器損傷并且遭受野生型HSV-2感染的痛苦(圖9B)。雖然利用N2-C535C和CJ9-gD的免疫保護(hù)小鼠免受野生型HSV-2的致命攻擊，但在N2-C535C和CJ9-gD免疫的小鼠中，分別有20%和30%的小鼠經(jīng)歷短暫的低度局部生殖器疾病(評分I)(表I)。在相似的實(shí)驗(yàn)(表I)中，觀察到，在用CJ9-gD免疫的小鼠(n=7)中，2只小鼠經(jīng)歷低度的局部生殖器疾病，I只小鼠顯示全身性疾病的體征并且在攻擊后第14天死亡，7只N2-C535C免疫的小鼠中的3只(43%)顯示低度局部生殖器疾病(評分=I)。再次地，在CJ2-gD2免疫的小鼠(n=7)中未看到局部和全身性皰疹性疾病的體征?？偟貋碚f，這些研究顯示，CJ2-gD2在用野生型HSV-2陰道內(nèi)攻擊后保護(hù)小鼠免受生殖器疾病中是比N2-C535C和CJ9-gD更有效的疫苗。表I:在用野生型HSV-2陰道內(nèi)攻擊后在模擬免疫的和免疫的小鼠中抗皰疹疾病的保護(hù)作用的百分比
權(quán)利要求
1.ー種復(fù)制缺陷型、顯性-明性單純皰疹病毒2型(HSV-2)重組病毒，其在其基因組內(nèi)包含 a)編碼第一HSV-2糖蛋白D(gD2)的第一序列，其中所述序列可操作地連接至第一啟動子，并且所述第一啟動子可操作地連接至第一四環(huán)素操縱子(Tet-O)序列； b)任選地，編碼第二HSV-2 gD2的第二序列，其中所述第二序列可操作地連接至第二啟動子，并且所述第二啟動子可操作地連接至第二 tet-Ο序列； c)編碼HSV-I或HSV-2UL9蛋白的第一顯性陰性突變體形式的第三序列，其中所述第三序列可操作地連接至第三啟動子，并且所述第三啟動子可操作地連接至第三四環(huán)素操縱子(tet-Ο)序列； d)任選地，編碼HSV-I或HSV-2UL9蛋白的第二顯性陰性突變體形式的第四序列，其中所述第四序列可操作地連接至第四啟動子，并且所述第四啟動子可操作地連接至第四四環(huán)素操縱子(tet-Ο)序列； 并且其中所述基因組不包含編碼功能性ICPO蛋白的序列。
2.權(quán)利要求I的重組病毒，其中所述重組病毒在其基因組內(nèi)包含編碼第二HSV-2 gD2的所述第二序列，其中所述第二序列可操作地連接至第二啟動子，并且所述第二啟動子可操作地連接至第二 tet-Ο序列。
3.權(quán)利要求2的重組病毒，其中所述重組病毒在其基因組內(nèi)包含編碼HSV-I或HSV-2UL9蛋白的第二顯性陰性突變體形式的所述第四序列，其中所述第四序列可操作地連接至第四啟動子，并且所述第四啟動子可操作地連接至第四四環(huán)素操縱子(tet-Ο)序列。
4.權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述第一、第二、第三和第四啟動子的ー個(gè)或多個(gè)為hCMV立即早期啟動子。
5.權(quán)利要求1-3中任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述第一、第二、第三和第四啟動子的ー個(gè)或多個(gè)為HSV-I或HSV-2立即早期啟動子。
6.權(quán)利要求5的重組病毒，其中所述HSV-I或HSV-2立即早期啟動子為ICP4。
7.權(quán)利要求5的重組病毒，其中所述第一、第二、第三和第四啟動子全部為HSV-I或HSV-2立即早期啟動子。
8.權(quán)利要求5的重組病毒，其中所述第一、第二、第三和第四啟動子為ICP4啟動子。
9.利要求1-3中任ー項(xiàng)的重組病毒，其中 a)所述第一、第二、第三和第四啟動子各自具有TATA元件； b)所述第一、第二、第三和第四Tet-O序列的每ー個(gè)包含兩個(gè)通過2-20個(gè)連接核苷酸連接的op2阻遏物結(jié)合位點(diǎn)，其中所述tet操縱子中的第一核苷酸位于所述TATA元件的最后一個(gè)核苷酸的3’端的6至24個(gè)核苷酸之間； c)編碼HSV-2gD2的所述序列和編碼HSV-2gD2的所述第二序列位于所述第一和第二Tet-O序列的3’端，并且可操作地連接至所述第一和第二啟動子； d)編碼HSV-I或HSV-2UL9蛋白的所述第一顯性陰性突變體形式的所述序列位于所述第三Tet-O序列的3’端，并且可操作地連接至所述第三啟動子； e)編碼HSV-I或HSV-2UL9蛋白的所述第二顯性陰性突變體形式的所述序列位于所述第四Tet-O序列的3’端，并且可操作地連接至所述第四啟動子。
10.權(quán)利要求1-9中任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述UL9蛋白的突變體形式為UL9-C535C。
11.權(quán)利要求1-10中任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述重組病毒還表達(dá)一個(gè)或多個(gè)重組免疫調(diào)節(jié)基因。
12.權(quán)利要求11的任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述重組病毒表達(dá)IL12。
13.權(quán)利要求11的任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述重組病毒表達(dá)IL15。
14.權(quán)利要求1-13中任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述重組病毒還表達(dá)處于具有tetO的HSV或hCMV立即早期啟動子的控制之下的HSV-2gB。
15.權(quán)利要求1-14中任ー項(xiàng)的重組病毒，其中所述重組病毒還表達(dá)處于具有tetO的HSV或hCMV立即早期啟動子的控制之下的HSV-2gC。
16.一種以單位劑量形式包含權(quán)利要求1-15中任ー項(xiàng)的重組病毒的疫苗。
17.權(quán)利要求16的疫苗，其中所述重組病毒以最低IxIO7Pfu/單位劑量存在。
18.權(quán)利要求16的疫苗，其中所述重組病毒以IxIO7-Ix IO9Pfu/單位劑量存在。
19.免疫患者以抵抗HSV-I或HSV-2感染的方法，其包括給所述患者施用權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的疫苗。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述患者對于HSV-I呈血清陽性。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述患者對于HSV-2呈血清陽性。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述患者對于HSV-I和HSV-2二者都呈血清陽性。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述個(gè)體對于HSV-I和HSV-2感染都呈血清陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于免疫患者以抵抗生殖器皰疹的疫苗中的單純皰疹病毒2型。
文檔編號C12N7/04GK102666843SQ201080058385
公開日2012年9月12日 申請日期2010年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者F·姚 申請人:布里格海姆婦女醫(yī)院公司