專利名稱：模板化的納米綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及包含模板化的納米綴合物的組合物及其使用方法。
背景技術(shù)：
調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核酸被廣泛認(rèn)為是潛在的療法以及用于基因功能分析的重要エ具。核酸方法的潛能在于它們通過識別和結(jié)合存在于細(xì)胞中的互補靶來調(diào)節(jié)基因途徑的能力。然而，將核酸遞送至哺乳動物細(xì)胞內(nèi)依然是主要的挑戰(zhàn)，因為細(xì)胞天然抵抗核酸攝取。此外，它們具有降解和破壞細(xì)胞內(nèi)外外源性核酸的多種機制。因此，產(chǎn)生可在沒有外部轉(zhuǎn)染劑的輔助下無毒地滲透細(xì)胞膜以及遞送程序化核酸對于這些技術(shù)延伸至治療應(yīng)用是必要的。多價無機納米材料是現(xiàn)公認(rèn)的潛在體內(nèi)治療劑，并且在一些情況中已經(jīng)獲得 FDA 批準(zhǔn)用作診斷工具[Rosi 等，Chem. Rev. 105(4) : 1547-1562(2005) ；Taton 等，Science 289 (5485) : 1757-1760 (2000)]。因為這些粒子的表面可通過多種連接策略與生物分子締合，所以它們可通過其表面配體的選擇而被工程化以與眾所周知的生物體系和途徑相互作用。例如，通過用雙螺旋SiRNA的稠密外殼(dense shell)來修飾金納米粒子，有可能致使哺乳動物細(xì)胞中的RNAi基因沉默[Giljohann等，J. Am. Chem.Soc. 131 (6) :2072-2073 (2009) J0這些粒子可特別有效地作為RNAi基因調(diào)節(jié)劑，因為它們表現(xiàn)出在沒有轉(zhuǎn)染劑時的高細(xì)胞攝取[Rosi等，Science 312 (5776) : 1027-1030 (2006)]；無急性毒性；對核酸酶降解的抗性[Seferos等，Nano Lett. 9 (I) : 308-11 (2009)]以及在生物媒介中的高穩(wěn)定性。重要的是需注意，起作用生長體(growing body ofwork)表明金納米粒子-多核苷酸綴合物在粒子的表面上執(zhí)行它們僅源于多核苷酸的緊密排列的各種功能的能力[Gil johann等，Nano Lett. 7 (12) : 3818-21 (2007)。在另一例子中，通過用磷脂和AP01A(其是生物相關(guān)蛋白)的稠密外殼修飾金納米粒子可構(gòu)造仿生合成的高密度脂蛋白(HDL)納米綴合物[Thaxton 等，J. Am. Chem. Soc. 131 (4) : 1384-5 (2009) ]。HDL 是防止動脈粥樣硬化和諸如心臟病和中風(fēng)的所得疾病的發(fā)展的動態(tài)血清分子。類似于生源性HDL，該合成構(gòu)建體能夠在其疏水性磷脂外殼中結(jié)合膽固醇。重要的是，在這兩種情況以及在許多其它情況中，在無機納米粒子的表面上生物配體的稠密多價排列賦予它們與生物體系相互作用的獨特能力，而不管其核心材料。盡管生物-無機納米材料雜交體具有期望的屬性，例如用于診斷和治療的那些，但產(chǎn)生對體內(nèi)核心材料的清除/持續(xù)和毒性的擔(dān)憂。因為這些擔(dān)憂被廣泛認(rèn)為是對納米材料體內(nèi)使用的限制，所以需要通用的方法以產(chǎn)生具有可裁剪的表面功能性的軟納米材料，所述表面功能性將維持它們無機納米粒子生物綴合物對應(yīng)物的性質(zhì)。已嘗試通過包括膠束結(jié)構(gòu)等的許多合成策略來解決這些問題[Li等，Nano Lett. 4 (6) : 1055-1058 (2004) ；Liu等，Chem-Eur J16 (12) : 3791-3797 (2010)]。由于它們獨特的化學(xué)、物理和生物性質(zhì)，中空納米綴合物近年引起重要關(guān)注，這表明在以下的廣泛應(yīng)用藥物/基因遞送[Shu等，Biomaterials31:6039 (2010) ；Kim 等，Angew. Chem. Int. Ed. 49:4405(2010) ；Kasuya 等，引自 Meth.Enzymol. ; Nejat, D. , Ed. ; Academic Press: 2009; Vol.第 464 卷，第 147 頁];成像[Sharma等，Contrast Media Mol. Imaging 5:59 (2010) ；Tan 等，J. Chem. Commun. 6240(2009)]； 以及分析[Choi等，Chem. Phys. 120:18(2010)]。因此，基于乳劑聚合[Anton等，J. Control led Release 128:185 (2008) ； Landfester 等，J. Polym. Sci. PartA:Polym.Chem. 48:493(2010) ；Li 等，J. Am. Chem. Soc. 132:7823 (2010)]、逐層方法[Kondo 等，J. Am.Chem. Soc. 132:8236 (2010)]、膠束的交聯(lián)[Turner 等,Nano Lett. 4:683 (2004) ；Sugihara等，Angew. Chem. Int.第 49 版3500 (2010) ;Moughton 等，Soft Matter 5:2361 (2009)]、分子或納米粒子自組裝[Kim 等，Angew. Chem. Int.第 46 版:3471 (2007) ;Kim 等，J. Am. Chem.Soc. 132 (28) :9908-19 (2010)]以及犧牲模板技術(shù)(sacrificial template technique)[R6thor6等，Small 6:488 (2010)]已經(jīng)開發(fā)多種方法以合成這些結(jié)構(gòu)。在這些中，模板化方法特別有效，因為它將控制模板的尺寸和形狀的能力轉(zhuǎn)移至產(chǎn)物，所述產(chǎn)物的期望的均勻性和形態(tài)難以以其他方式達(dá)到。在典型的模板化合成中，選擇犧牲核心(sacrificialcore)，將在其上涂覆含有潛在的交聯(lián)部分的優(yōu)選材料。在通過化學(xué)交聯(lián)穩(wěn)定涂層后，去除模板，留下期望的中空納米粒子。對于組成上簡單的分子，例如聚(丙烯酸)或殼聚糖，該另外的交聯(lián)步驟很容易達(dá)到[Cheng等,J. Am. Chem. Soc. 128:6808 (2006) ；Hu等，Biomacromolecules 8:1069(2007)]。然而,對于含有敏感性和/或生物功能結(jié)構(gòu)的體系，常規(guī)交聯(lián)化學(xué)過程可能不充分正交以防止它們活性的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本公開提供包含模板化的納米綴合物的組合物及其使用方法。本文公開了用于使用或不使用表面產(chǎn)生納米綴合物的方法。在一方面，使包含可交聯(lián)的ー個或多個部分的生物分子活化，這啟動生物分子之間的交聯(lián)反應(yīng)。在ー些方面，活化是自發(fā)的。在反應(yīng)完成后，表面被任選地溶解，并且所得的中空結(jié)構(gòu)保留表面的形狀。沒有表面的中空結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出納米綴合物的性質(zhì)，其中表面仍然完整。因此，本公開提供多種納米綴合物，每種納米綴合物具有限定的結(jié)構(gòu)并且包含在單層中的多種交聯(lián)生物分子、提供在其上裝配所述結(jié)構(gòu)的模板的表面，其中在限定所述結(jié)構(gòu)后，所述表面任選至少部分地被去除。在各方面，所述納米粒子選自金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、鋁納米粒子、鈀納米粒子、銅納米粒子、鈷納米粒子、銦納米粒子以及鎳納米粒子。
在一個實施方案中，本公開提供納米綴合物，其中在所述多種生物分子中每種生物分子均相同。在另ー實施方案中，本公開提供納米綴合物，其中在所述多種生物分子中至少兩種生物分子不同。在各個實施方案中，所述生物分子選自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治療劑、對比劑及其組合。在進(jìn)ー步的實施方案中，所述多種納米綴合物是單分散的。在各方面，所述單分散性使得所述多種納米綴合物的直徑有約25%的變化；或其中所述單分散性使得所述多種納米綴合物的直徑有約10%的變化；或其中所述單分散性使得所述多種納米綴合物的直徑有約1%的變化。在一些實施方案中，所述表面上的所述交聯(lián)生物分子的密度對于所述生物分子之 間的協(xié)同作用是足夠的。在各方面，提供多種納米綴合物，其中所述表面上的所述交聯(lián)生物分子的密度是約2pmol/cm2 ;或所述表面上的所述交聯(lián)生物分子的密度是約100pmol/cm2。在本公開的另一方面，提供多種納米綴合物，其中所述多種納米綴合物還包含另外的試劑。在各方面，所述另外的試劑選自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、金屬絡(luò)合物、小分子、治療劑、對比劑及其組合。在一個實施方案中，所述另外的試劑與所述多種生物分子的至少ー種生物分子締合。在各方面，所述另外的試劑通過雜交與所述多種生物分子的至少ー種生物分子締合，同時在另外的方面，所述另外的試劑與所述多種生物分子的至少ー種生物分子共價或非共價締合。在另一方面，另外的分子被包埋在所述多種納米綴合物的至少ー種的所述交聯(lián)生物分子中。在各實施方案中，本公開還提供多種納米綴合物，其中在缺少所述表面時，所述多種納米綴合物中至少ー種納米綴合物是中空的；或其中在缺少所述表面時，所述多種納米綴合物中大部分納米綴合物是中空的；或其中在缺少所述表面時，所述多種納米綴合物中基本上所有所述納米綴合物是中空的。在一個實施方案中，提供多種納米綴合物，其中在所述多種納米綴合物的至少ー種中，所述另外的試劑被封裝在所述納米綴合物中，或所述納米綴合物是中空的。在一個實施方案中，通過公開還提供交聯(lián)有結(jié)構(gòu)的納米綴合物的方法，所述方法包括通過使第一生物分子接觸表面來活化所述第一生物分子的步驟，所述活化使得所述第一生物分子交聯(lián)第二生物分子。在一方面，所述表面提供所述結(jié)構(gòu)在其上裝配的模板，同時在另一方面，所述表面是納米粒子。在各方面，所述納米粒子選自球形、棒形和三棱形。在各方面，通過本公開提供的方法還提供，納米粒子是金屬的，以及在另外的方面，所述納米粒子是膠態(tài)金屬。因此，在又另外的方面，所述納米粒子選自金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、招納米粒子、IE納米粒子、銅納米粒子、鈷納米粒子、銦納米粒子和鎳納米粒子。本公開還提供，在本文所述的任何方法的各實施方案中，交聯(lián)后所述表面被至少部分地去除。在ー些方面，還提供方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子選自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治療劑、對比劑及其組合。在其他方面，所述第一生物分子和所述第二生物分子包含至少ー個炔烴部分；或所述第一生物分子和所述第二生物分子各包含約10個炔烴部分。
〔0025〕 關(guān)于炔烴部分，在各方面，本公開提供，所述炔烴部分在與所述表面接觸后被活 化。在一方面，所述活化使得所述炔烴易受親核試劑影響，并且在各實施方案中，所述親核 試劑選自水、醇、胺、硫醇、酯、硫酯、尿素、酰胺、醛、碳酸酯、氨基甲酸酯、分子內(nèi)羥基、甲醚 基、芐醚基、羧酸、酮、亞胺、酚、吡咯烷酮、吲哚、乙酸、13 ~酮酯及其組合。
〔0026〕 在本公開的各實施方案中，活化導(dǎo)致所述第一生物分子與所述第二生物分子交 聯(lián)。
〔0027〕 在一些方面，所述第一生物分子是多核苷酸，并且在其他方面，所述第二生物分子 是多核苷酸。在其他方面，所述多核苷酸是0嫩多核苷酸或觀八多核苷酸。
〔0028〕 本公開還提供，在各實施方案中，所述多核苷酸長度為約5至約100個核苷酸、長 度為約5至約90個核苷酸、長度為約5至約80個核苷酸、長度為約5至約70個核苷酸、長 度為約5至約60個核苷酸、長度為約5至約50個核苷酸、長度為約5至約45個核苷酸、長 度為約5至約40個核苷酸、長度為約5至約35個核苷酸、長度為約5至約30個核苷酸、長 度為約5至約25個核苷酸、長度為約5至約20個核苷酸、長度為約5至約15個核苷酸或 者長度為約5至約10個核苷酸。
〔0029〕 在另一個實施方案中，在交聯(lián)步驟過程中，將另外的試劑加入到所述第一生物分 子和所述第二生物分子；同時在另一實施方案中，在形成所述納米綴合物之后但在去除所 述表面之前，將另外的試劑加入到所述納米綴合物。在進(jìn)一步的實施方案中，在形成所述納 米綴合物之后并且在去除所述表面之后，將另外的試劑加入到所述納米綴合物。
〔0030〕 在另一方面，提供包含包括表面的多價納米綴合物的組合物，所述納米綴合物還 包含多個多核苷酸，其中所述多個多核苷酸中的每個的間隔端(鄧狀虹的山被修飾使得所 述多個多核苷酸與化學(xué)品的接觸使所述多個多核苷酸交聯(lián)，其中在交聯(lián)后所述表面任選地 至少部分被去除。在組合物的各方面，所述納米綴合物包含納米粒子，并且在其他方面，所 述納米粒子選自球形、棒形和三棱形。
〔0031〕 因此，在組合物的又進(jìn)一步方面，所述納米粒子是金屬的。在一方面，所述納米粒 子是膠態(tài)金屬。在組合物的各實施方案中，所述納米粒子選自金納米粒子、銀納米粒子、鉬 納米粒子、招納米粒子、鈕納米粒子、銅納米粒子、鈷納米粒子、銦納米粒子和鎳納米粒子。 〔0032〕 在各實施方案中，所述修飾選自胺、酰胺、醇、酯、醛、酮、硫醇、二硫化物、羧酸、酚、 咪唑、肼、腙、疊氮化物和炔烴。在一方面，所述修飾是胺-修飾的核苷酸，并且在另一方面， 所述胺-修飾的亞磷酰胺核苷酸是胺-修飾的胸苷亞磷酰胺01吣。
〔0033〕 在其他實施方案中，所述化學(xué)品選自雙琥拍酰亞胺戍二酸酯①丨訓(xùn)⑶化加丨辦丄 、雙琥拍酰亞胺辛二酸酯①丨訓(xùn)“丨仏舊辦丨、雙[硫代琥拍酰亞 胺基]辛二酸酯、三-琥拍酰亞胺基氨基三乙酸 酯(作匕-訓(xùn)⑶化加丨辦丨、琥拍酰亞胺基肼基煙酸鹽丙酮腙(^口⑶ 1111111101714-117(11'&21110111001 8061:0116 6^ 0,7,0^&)、玻拍酸亞胺基 酸餅基對苯 二 甲酸酯鹽酸鹽—4-117^1'&21(101:61-01)1111181816、玻拍酸
亞胺基4-甲酰苯甲酸酯、二硫代雙[琥拍酰亞胺基 丙酸酯]①丨訪丨。!]；!^〔811(^11111111(171 1)1-01)101181:61 ^ ^3^ 3 1 -二硫代雙[硫代琥拍酰亞 胺基丙酸酯〕⑶ 3 ； ~01111101318〔8111:^0811(^11111111(1711)1*01)1011511:6〕〉、二琥拍酰亞胺基酒石酸酯(Disuccinimidyl tartarate)、雙[2_(琥拍酰亞胺氧基羰基氧基)乙基]砜( Bis [2-(succinimidooxycarbonyloxy) ethyl] sulfone)、乙 二醇雙[玻 I自酸亞胺基玻 I白 酸酯](Ethylene glycol bis[succinimidylsuccinate])、乙二醇雙[硫代琥拍酰亞胺 基玻拍酸酯](Ethylene glycol bis[sulfosuccinimidylsuccinate])、二 亞胺代己二 酸二甲酯 2HC1 (Dimethyl adipimidate 2HC1)、庚二亞氨酸二甲酯 2HC1 (Dimethyl pimelimidate 2HC1)、辛二亞氨酸二甲酯 2HC1 (Dimethyl Suberimidate 2HC1)、1，5_ 二 氟-2，4-二硝基苯(1，5-Difluoro_2，4-dinitrobenzene)、[三(輕甲基)月粦基]丙 酸(3 -[Tris (hydroxymethyl) phosphino] propionic acid)、雙-馬來酸亞胺基乙焼 (Bis-Maleimidoethane)、1，4_雙馬來酸亞胺基丁焼(1，4-bismaleimidobutane)、雙馬來酉先 亞胺基己焼(Bismaleimidohexane)、三[2_馬來酸亞胺乙基]胺(Tris [2-maleimidoethyl] amine)、1，8_ 雙-馬來酸亞胺-二乙 二酉享(1，8-Bis-maleimido-diethyleneglycol)、 1，11-雙-馬來酸亞胺-三乙二醇(1，11-Bis-maleimido-tri ethyl eneglycol)、1，4 雙馬 來酰亞胺基-2, 3- 二輕基丁焼(1，4bismaleimidyl-2, 3-dihydroxybutane)、二硫代-雙 馬來酸亞胺基乙焼(Dithio-bismaleimidoethane)、1，4_ 二-[3 ' -(2 !-卩比卩定基二硫 代丙酸氨基]丁焼(1, 4-Di-[3 1 -(2 1 -pyridyldithio)-propionamido]butane)、 1，6-己焼-雙-乙烯基砜(1，6-Hexane-bis-vinylsulfone)、雙-[b_(4_疊氮基水楊酰氨 基)乙基]二硫化物(Bis-[b-(4_Azidosalicylamido) ethyl] disulde)、N_(a_ 馬來酉先亞 胺乙酸氧基)玻拍酸亞胺酯(N-(a-Maleimidoacetoxy) succinimide ester)、N_[ 3 -馬 來酰亞胺丙基氧基]琥拍酰亞胺酯(N-[ ^ -Maleimidopropyloxy] succinimide ester)、 N-[g-馬來酰亞胺丁酰氧基]琥拍酰亞胺酯(N-[g-Maleimidobutyryloxy] succinimide ester)、N_[g_馬來酰亞胺丁酰氧基]硫代琥拍酰亞胺酯(N-[g_Maleimidobutyryloxy] sulfosuccinimide ester)、間馬來酰亞胺苯甲?；鵢N_輕基琥拍酰亞胺酯 idobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、間馬來酸亞胺苯甲酸基_N_輕基硫代玻 I白酉先亞胺酯(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)、玻拍酸亞胺 基 4_[N_ 馬來酸亞胺甲基]環(huán)己焼-1-羧酸酯(Succinimidyl4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate)、硫代琥拍酰亞胺基4_[N_馬來酰亞胺甲基]環(huán)己焼-1-羧 酸 酉旨(Sulfosuccinimidyl4-[N-maleimidomethy1]eyelohexane-1-carboxylate)、 N-e-馬來酰亞胺己酰氧基]琥拍酰亞胺酯(N-e-Maleimidocaproyloxy] succinimide ester)、N_e_馬來酰亞胺己酰氧基]硫代琥拍酰亞胺酯(N-e-Maleimidocaproyloxy] sulfosuccinimide ester)、琥拍酰亞胺基4_[對馬來酰亞胺苯基]丁酸酯(Succinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate)、硫代琥拍酰亞胺基4_[對馬來酰亞胺苯基]丁酸酯 (Sulfosuccinimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate)、玻拍酸亞胺基-6_[ 0 -馬來酉先 亞胺丙酸氨基]己酸酯(Succinimidyl-6-[ 3 -maleimidopropionamido]hexanoate)、玻 珀酰亞胺基-4_[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧基-[6-酰氨己酸酯](Succinimidyl -4-[N-Maleimidomethyl] cyclohexane-l-carboxy-[6-amidocaproate])、N_[k_ 馬來酉先亞 胺十一酸氧基]硫代玻 J自酸亞胺酯(N-[k-Maleimidoundecanoyloxy] sulfosuccinimide ester)、N_琥拍酰亞胺基3_(2_卩比卩定基二硫代)_丙酸酯(N-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) -propionate)、琥J自酰亞胺基6-(3_[2_卩比卩定基二硫代]_丙酰氨基) 己酸酯(Succinimidyl6_ (3_[2-pyridyldithio] -propionamido) hexanoate)、4_ 玻拍酉先亞Sic 36 $1,361$: 36 - ￥36 ~a-[2-Bit 36_-it ft ] ￥￥ (4-Succinimidyloxycarbonyl-methyl
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圖I描述用炔烴-NHS酯修飾胺-修飾的DNA。圖2示出A)多種檸檬酸穩(wěn)定的、DNA官能化以及炔烴-DNA官能化AuNP的溶解。 B)在溶解過程中各階段下的炔烴-DNA官能化AuNP。C)B中相應(yīng)時間點的UV-Vis光譜。圖3示出在溶解過程中金納米粒子的指定溶液的TEM圖像。圖4示出A)游離鏈DNA與交聯(lián)的結(jié)構(gòu)和DNA官能化AuNP的凝膠電泳比較。B)由 具有一系列密度的炔烴-DNA-AuNP獲得的交聯(lián)結(jié)構(gòu)的凝膠電泳分析。圖5描述A)由一系列不同尺寸的模板形成的中空DNA納米綴合物的凝膠電泳。B) 由用炔烴-DNA官能化的AuNP獲得的交聯(lián)結(jié)構(gòu)的凝膠電泳，所述炔烴-DNA用不同數(shù)量的炔 烴單元修飾。圖6示出Fl和Cy3修飾的中空DNA納米綴合物的雙鏈體系。在60°C下，對這些粒 子進(jìn)行去雜交并且觀察到熒光素的綠色熒光。在室溫下，將粒子雜交并且從熒光素至Cy3 的FRET產(chǎn)生Cy3的橙色熒光。在此時間后，這些粒子形成在溶液中沉淀的肉眼可見的聚集 物。圖7描述在260nm處游離鏈DNA的作為溫度的函數(shù)的消光(extinction)。 DNA-AuNP聚集物在520nm處形成這些鏈并且中空DNA納米綴合物聚集物在260nm處形成相 同鏈。
圖8 描述 A)歸一化至 GAPDH 的用 dharmafect (游離)、siRNA_AuNP 以及 siRNA-中 空納米粒子處理的細(xì)胞的EGFR mRNA的RT-qPCR定量。B)在用siRNA-中空納米粒子處理 的細(xì)胞中EGFR和GAPDH的蛋白質(zhì)印跡。圖9示出A)聚合物涂覆的13nm AuNP的溶解過程。B)在溶解過程中各時間點的 AuNP的歸一化UV-Vis光譜。C)a)聚合物涂覆的AuNP、b-c)部分形成的納米綴合物和d) 完全形成的納米綴合物的TEM圖像(用0. 5%乙酸雙氧鈾進(jìn)行負(fù)染色)。圖10示出A)通過動力光散射測量的AuNP (13、20、30和40nm)、聚合物涂覆的AuNP 和聚合物納米綴合物(PNS)的數(shù)均流體動力直徑。B)a)20nm PNS和b)40nm PNS的TEM圖 像(用0.5%乙酸雙氧鈾進(jìn)行負(fù)染色)。在c)中，說明為什么納米膠囊在TEM中呈現(xiàn)圓環(huán) 形。黑色乙酸雙氧鈾斑點。藍(lán)色在表面上塌陷的PNS。圖 11 示出 A) 1 的 1H-13C NMR 光譜。B)4 的 1H-13C NMR 光譜。C)4 的 1H-1HC0SY。 D)l(虛線)和4(實線)的IR光譜。圖12示出A) 5的HSQC。B)在反應(yīng)后5的HSQC。C)在反應(yīng)前后5的MALDI-T0FMS。
圖13示出A)與AuNP孵育后DNA-炔丙醚綴合物6的MALDI-TOF。B)與6的AuNP 孵育后6的瓊脂糖凝膠(3%)電泳，證實用單一乙炔基(圖12)使3-臂交聯(lián)成為可能的所 提出的交聯(lián)機制的預(yù)測。圖14描述A)含有鏈霉未和素和HRP的蛋白納米綴合物的結(jié)構(gòu)。B)蛋白納米綴合 物的HRP活性的基于表面的顯色分析。圖15示出蛋白納米綴合物的HRP-催化的顯色分析，顯示鏈霉親和素和HRP成功 并入納米綴合物外殼內(nèi)以及蛋白功能的保留。圖16描述通過使用炔烴部分和含有磷脂的聚合物以及AP01A蛋白來形成中空HDL 納米粒子的可能途徑。圖17描述多炔烴交聯(lián)的可能途徑。
具體實施例方式本文提供包含多種納米綴合物的組合物，每種納米綴合物具有限定的結(jié)構(gòu)并且包 含在單層中的多種交聯(lián)生物分子、所述通過表面限定結(jié)構(gòu)以及為單分散的多種納米綴合 物，其中在所述結(jié)構(gòu)被限定后所述表面的存在為任選的。所公開的納米綴合物是如在例如Rosi等，Chem. Rev. 105(4) : 1547-1562(2005)； Taton 等，Science 289(5485) : 1757-1760 (2000), PCT/US2006/022325 和美國專利號 6，361，944中所述的官能化納米粒子的有效替代選擇，因為它們表現(xiàn)出在沒有轉(zhuǎn)染劑下的 高細(xì)胞攝取、沒有急性毒性、表現(xiàn)出對核酸酶降解的抗性以及具有在生物媒介中的高穩(wěn)定 性。這些性質(zhì)的組合是重要的，因為盡管生物分子_功能化納米粒子的極高攝取，但它們在 迄今測定的細(xì)胞類型中沒有表現(xiàn)出毒性(參見表1，如下)，并且該性質(zhì)對于降低脫靶效應(yīng) 的治療劑遞送應(yīng)用是重要的。表權(quán)利要求
1.多種納米綴合物，每種納米綴合物具有限定的結(jié)構(gòu)并且包含在單層中的多種交聯(lián)生物分子、提供在其上裝配所述結(jié)構(gòu)的模板的表面，其中在限定所述結(jié)構(gòu)后，所述表面任選地至少部分被去除。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述表面是納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述納米粒子選自球形、棒形和三棱形。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述納米粒子是金屬的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述納米粒子是膠態(tài)金屬。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述納米粒子選自金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、招納米粒子、鈕納米粒子、銅納米粒子、鈷納米粒子、銦納米粒子和鎳納米粒子。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中在所述多種生物分子中每種生物分子均相同。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的組合物，其中在所述多種生物分子中至少兩種所述生物分子不同。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述生物分子選自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治療劑、對比劑及其組合。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述多種生物分子是單分散的。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述單分散性使得所述多種納米綴合物的直徑有約25%的變化。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的組合物，其中所述單分散性使得所述多種納米綴合物的直徑有約10%的變化。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的組合物，其中所述單分散性使得所述多種納米綴合物的直徑有約1%的變化。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述表面上的交聯(lián)生物分子的密度對于所述生物分子之間的協(xié)同作用是足夠的。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述表面上的交聯(lián)生物分子的密度是約 2pmol/cm2。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至14中任一項所述的組合物，其中所述表面上的交聯(lián)生物分子的密度是約100pmol/cm2。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述多種納米綴合物還包含另外的試劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述另外的試劑選自多核苷酸、肽、多肽、磷月旨、寡糖、金屬絡(luò)合物、小分子、治療劑、對比劑及其組合。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述另外的試劑與所述多種生物分子的至少ー種生物分子締合。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述另外的試劑通過雜交與所述多種生物分子的至少ー種生物分子締合。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述另外的試劑與所述多種生物分子的至少ー種生物分子共價締合。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述另外的試劑與所述多種生物分子的至少ー種生物分子非共價締合。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述另外的試劑被包埋在所述多種納米綴合物的至少ー種的所述交聯(lián)生物分子中。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求任中一項所述的組合物，其中在缺少所述表面時，所述多種納米綴合物中至少ー種納米綴合物是中空的。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中在缺少所述表面時，所述多種納米綴合物中大部分所述納米綴合物是中空的。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其中在缺少所述表面時，所述多種納米綴合物中基本上所有所述納米綴合物是中空的。
27.根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項所述的組合物，其中所述另外的試劑被封裝在所述納米綴合物中，或所述納米綴合物是中空的。
28.一種交聯(lián)有結(jié)構(gòu)的納米綴合物的方法，所述方法包括通過使第一生物分子接觸表面來活化所述第一生物分子的步驟，所述活化使得所述第一生物分子交聯(lián)第二生物分子。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述表面提供所述結(jié)構(gòu)在其上裝配的模板。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或權(quán)利要求29所述的方法，其中所述表面是納米粒子。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述納米粒子選自球形、棒形和三棱形。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或權(quán)利要求31所述的方法，所述納米粒子是金屬的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述納米粒子是膠態(tài)金屬。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述納米粒子選自金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、招納米粒子、鈕納米粒子、銅納米粒子、鈷納米粒子、銦納米粒子和鎳納米粒子。
35.根據(jù)權(quán)利要求28至34中任一項所述的方法，其中在所述交聯(lián)后所述表面被至少部分地去除。
36.根據(jù)權(quán)利要求28至35中任一項所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子選自多核苷酸、肽、多肽、磷脂、寡糖、小分子、治療劑、對比劑及其組合。
37.根據(jù)權(quán)利要求28至36中任一項所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物分子包含至少I個炔烴部分。
38.根據(jù)權(quán)利要求28至37中任一項所述的方法，其中所述第一生物分子和所述第二生物 分子各包含約10個炔烴部分。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的方法，其中所述炔烴部分在與所述表面接觸后被活化。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述活化使得所述炔烴易受親核試劑影響。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述親核試劑選自水、醇、胺、硫醇、酷、硫酯、尿素、酰胺、醛、碳酸酷、氨基甲酸酷、分子內(nèi)羥基、甲醚基、芐醚基、羧酸、酮、亞胺、酚、2-吡咯烷酮、吲哚、こ酸、β-酮酯及其組合。
42.根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項所述的方法，其中活化導(dǎo)致所述第一生物分子與所述第二生物分子交聯(lián)。
43.根據(jù)權(quán)利要求28至42中任一項所述的方法，其中所述第一生物分子是多核苷酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求28至42中任一項所述的方法，其中所述第二生物分子是多核苷酸。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述多核苷酸長度為約5至約100個核苷酸、長度為約5至約90個核苷酸、長度為約5至約80個核苷酸、長度為約5至約70個核苷酸、長度為約5至約60個核苷酸、長度為約5至約50個核苷酸、長度為約5至約45個核苷酸、長度為約5至約40個核苷酸、長度為約5至約35個核苷酸、長度為約5至約30個核苷酸、長度為約5至約25個核苷酸、長度為約5至約20個核苷酸、長度為約5至約15個核苷酸或者長度為約5至約10個核苷酸。
47.根據(jù)權(quán)利要求17至46中任一項所述的方法，其中在所述活化步驟過程中，將所述另外的試劑加入到所述第一生物分子和所述第二生物分子。
48.根據(jù)權(quán)利要求17至46中任一項所述的方法，其中在形成所述納米綴合物之后但在至少部分去除所述表面之前，將所述另外的試劑加入到所述納米綴合物。
49.根據(jù)權(quán)利要求17至46中任一項所述的方法，其中在形成所述納米綴合物之后并且在至少部分去除所述表面之后，將所述另外的試劑加入到所述納米綴合物。
50.ー種包含包括表面的多價納米綴合物的組合物，所述納米綴合物還包含多個多核苷酸，其中所述多個多核苷酸中的每個的間隔端被修飾使得所述多個多核苷酸與化學(xué)品的接觸使所述多個多核苷酸交聯(lián)，其中在所述交聯(lián)后所述表面任選地至少部分被去除。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述修飾選自胺、酰胺、醇、酷、醛、酮、硫醇、ニ硫化物、羧酸、酚、咪唑、肼、腙、疊氮化物和炔烴。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，其中所述修飾是胺-修飾的核苷酸。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述胺-修飾的亞磷酰胺核苷酸是胺-修飾的胸苷亞磷酰胺(TN)。
54.根據(jù)權(quán)利要求50至53中任一項所述的組合物，其中所述化學(xué)品選自雙琥珀酰亞胺戊ニ酸酷、雙琥珀酰亞胺辛ニ酸酷、雙[硫代琥珀酰亞胺基]辛ニ酸酷、三-琥珀酰亞胺基氨基三こ酸酷、琥珀酰亞胺基4-肼基煙酸鹽丙酮腙、琥珀酰亞胺基4-酰肼基對苯ニ甲酸酯鹽酸鹽、琥珀酰亞胺基4-甲酰苯甲酸酷、ニ硫代雙[琥珀酰亞胺基丙酸酯]、3，3' - ニ硫代雙[硫代琥珀酰亞胺基丙酸酷]、ニ琥珀酰亞胺基酒石酸酷、雙[2-(琥珀酰亞胺氧基羰基氧基)こ基]砜、こニ醇雙[琥珀酰亞胺基琥珀酸酷]、こニ醇雙[硫代琥珀酰亞胺基琥珀酸酷]、ニ亞胺代己ニ酸ニ甲酯· 2HC1、庚ニ亞氨酸ニ甲酯· 2HC1、辛ニ亞氨酸ニ甲酯· 2HC1、I, 5- ニ氟-2，4- ニ硝基苯、β - [ニ(輕甲基)膦基]丙酸、雙_馬來酰亞胺基こ燒、I, 4-雙馬來酰亞胺基丁烷、雙馬來酰亞胺基己烷、三[2-馬來酰亞胺こ基]胺、1，8-雙-馬來酰亞胺-ニこニ醇、1，11-雙-馬來酰亞胺-三こニ醇、1，4雙馬來酰亞胺基_2，3- ニ羥基丁烷、ニ硫代-雙馬來酰亞胺基こ燒、1，4-ニ-[3' -{2'-卩比唳基ニ硫代)-丙酰氨基]丁燒、I, 6-己燒_雙_こ烯基諷、雙-[b_(4_疊氮基水楊酸氨基)こ基]ニ硫化物、N-(a_馬來酸亞胺こ酰氧基)琥珀酰亞胺酷、Ν-[β-馬來酰亞胺丙基氧基]琥珀酰亞胺酷、N-[g-馬來酰亞胺丁酰氧基]琥珀酰亞胺酷、N-[g-馬來酰亞胺丁酰氧基]硫代琥珀酰亞胺酷、間馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酷、間馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基硫代琥珀酰亞胺酷、琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-I-羧酸酯、硫代琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-I-羧酸酷、N-e-馬來酰亞胺己酰氧基]琥珀酰亞胺酷、N-e-馬來酰亞胺己酰氧基]硫代琥珀酰亞胺酷、琥珀酰亞胺基4-[對馬來酰亞胺苯基]丁酸酷、硫代琥珀酰亞胺基4-[對馬來酰亞胺苯基]丁酸酷、琥珀酰亞胺基-6-[ β -馬來酰亞胺丙酰氨 基]己酸酷、琥珀酰亞胺基-4-[Ν-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-I-羧基-[6-酰氨己酸酷]、N-[k-馬來酰亞胺十一酰氧基]硫代琥珀酰亞胺酷、N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基ニ硫代)-丙酸酷、琥珀酰亞胺基6-(3-[2_吡啶基ニ硫代]-丙酰氨基)己酸酷、4-琥珀酰亞胺基氧基擬基_甲基_a_[2_卩比唳基ニ硫代]甲苯、4_硫代玻拍酸亞胺基-6-甲基_a_ (2_批啶基ニ硫代)甲苯酰氨]己酸酷、N-琥珀酰亞胺基碘こ酸酷、琥珀酰亞胺基3-[溴こ酸酷]丙酸酷、N-琥珀酰亞胺基[4-碘こ?；鵠氨基苯甲酸酷、N-硫代琥珀酰亞胺基[4-碘こ?；鵠氨基苯甲酸酷、N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基水楊酸、N-5-疊氮基-2-硝基苯甲?；趸牾啺贰-羥基硫代琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酷、硫代琥珀酰亞胺基[4-疊氮基水楊酰氨基]-己酸酷、N-琥珀酰亞胺基-6-(4’ -疊氮基-2’ -硝基苯基氨基)己酸酷、N-硫代琥珀酰亞胺基-6-(4’ -疊氮基-2’ -硝基苯基氨基)己酸酷、硫代琥珀酰亞胺基-(全氟代疊氮苯甲酰氨基)-こ基-1，3’ -ニ硫代丙酸酷、硫代琥珀酰亞胺基-2-(m-疊氮基-ο-硝基苯甲酰氨基)-こ基-1，3’ -丙酸酷、硫代琥珀酰亞胺基2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-こ酰氨基]こ基-1，3' ニ硫代丙酸酷、琥珀酰亞胺基4，4’-疊氮戊酸酷、琥珀酰亞胺基6-(4，4’-疊氮戊酰氨)己酸酷、琥珀酰亞胺基2-([4，4’-疊氮戊酰氨]こ基)-1，3’_ニ硫代丙酸酷、硫代琥珀酰亞胺基4，4’ -疊氮戊酸酷、硫代琥珀酰亞胺基6-(4，4’ -疊氮戊酰氨)己酸酷、硫代琥珀酰亞胺基2-([4，4’-疊氮戊酰氨]こ基)-1，3’-ニ硫代丙酸酷、ニ環(huán)己基碳化ニ亞胺、1_こ基-3-[3- ニ甲基氨基丙基]碳化ニ亞胺鹽酸鹽、N-[4- (p-疊氮基水楊酰氨基)丁基]-3' _(2'-吡啶基ニ硫代)丙酰胺、Ν-[β-馬來酰亞胺丙酸]酰肼、三氟こ酸鹽、[N-e-馬來酰亞胺己酸]酰肼、三氟こ酸鹽、4-(4-Ν-馬來酰亞胺苯基)丁酸酰肼鹽酸鹽、N-[k-馬來酰亞胺十一烷酸]酰肼、3-(2-吡啶基ニ硫代)丙酰肼、P-疊氮基苯甲酰肼、N- [P-馬來酰亞胺苯基]異氰酸酯以及琥珀酰亞胺基-[4-(補骨脂素-8-基氧基)]-丁酸酷。
55.根據(jù)權(quán)利要求50至54中任一項所述的組合物，其中所述表面包括納米粒子。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的組合物，其中所述納米粒子選自球形、棒形和三棱形。
57.根據(jù)權(quán)利要求55或權(quán)利要求56所述的組合物，其中所述納米粒子是金屬的。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的組合物，其中所述納米粒子是膠態(tài)金屬。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的組合物，其中所述納米粒子選自金納米粒子、銀納米粒子、鉬納米粒子、招納米粒子、IE納米粒子、銅納米粒子、鈷納米粒子、銦納米粒子和鎳納米粒子。
60.根據(jù)權(quán)利要求50至59中任一項所述的組合物，其中所述多種多核苷酸包括DNA多核苷酸、RNA多核苷酸或其組合。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的組合物，其中所述多核苷酸長度為約5至約100個核苷酸、長度為約5至約90個核苷酸、長度為約5至約80個核苷酸、長度為約5至約70個核苷酸、長度為約5至約60個核苷酸、長度為約5至約50個核苷酸、長度為約5至約45個核苷酸、長度為約5至約40個核苷酸、長度為約5至約35個核苷酸、長度為約5至約30個核苷酸、長度為約5至約25個核苷酸、長度為約5至約20個核苷酸、長度為約5至約15個核苷酸或長度為約5至約10個核苷酸。
62.ー種使用根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法來制備根據(jù)權(quán)利要求I所述的納米綴合物的方法。
63.ー種檢測靶分子的方法，所述方法包括使所述靶分子接觸根據(jù)權(quán)利要求I至28或權(quán)利要求50至61中任一項所述的組合物，其中所述靶分子與所述組合物之間的接觸導(dǎo)致可檢測的變化。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述檢測是在體外。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述檢測是在體內(nèi)。
66.ー種抑制由靶多核苷酸編碼的基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法，所述方法包括在足以抑制所述基因產(chǎn)物表達(dá)的條件下使所述靶多核苷酸接觸根據(jù)權(quán)利要求I至28或權(quán)利要求50至61中任一項所述的組合物。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物的表達(dá)在體內(nèi)被抑制。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物的表達(dá)在體外被抑制。
69.根據(jù)權(quán)利要求66至68中任一項所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物的表達(dá)被抑制至少約5% ο
全文摘要
本公開涉及包含模板化的納米綴合物的組合物及其使用方法。
文檔編號C12Q1/68GK102666879SQ201080058178
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者大衛(wèi)·A·吉拉約翰, 張可, 查德·A·米爾金, 約書亞·I·庫特勒, 鄭丹, 韋斯頓·L·丹尼爾 申請人:西北大學(xué)