專利名稱：包裝缺陷的皰疹病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒疫苗領(lǐng)域，并且尤其涉及產(chǎn)生包裝缺陷的突變皰疹病毒，含有包裝缺陷的突變皰疹病毒的疫苗，以及制備和生產(chǎn)包裝缺陷的皰疹病毒的方法。
背景技術(shù)：
對治療病毒性疾病的各種療法方面有很大的要求。盡管齊多夫定等用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒藥物，以及諸如更昔洛韋，阿昔洛韋，和膦甲酸等藥物已用于治療皰疹病毒的感染，但是明顯的副作用常常限制了它們的效果。耐藥病毒的選擇性存活與傳播也限制了小分子量抗病毒藥物的功效。對于抗RNA病毒的藥物來說，這是一個尤其值得注意的問題，RNA病毒例如HIV，它與大多數(shù)DNA病毒相比具有相對高的突變率。
抗病毒疫苗是感染后抗病毒藥物治療的可行替代物。理想的情況是抗病毒疫苗保護(hù)原發(fā)病和復(fù)發(fā)的感染。針對一種特定疾病的治療功效是開發(fā)一種疫苗策略的關(guān)鍵方面。調(diào)節(jié)功能也必須考慮到，尤其是與在健康個體中預(yù)防應(yīng)用的疫苗的安全性相關(guān)的方面。
盡管皰疹病毒疫苗一直是學(xué)術(shù)和商業(yè)關(guān)注的活躍領(lǐng)域，但是在人體內(nèi)誘導(dǎo)良性的保護(hù)性免疫反應(yīng)一直是具有挑戰(zhàn)性的〔R.L.Burke，HSV疫苗開發(fā)的現(xiàn)狀(Current Status of HSV VaccineDevelopment)，見于《人皰疹病毒》(The Human Herpesviruses)，367-369，(B.Roizman，R.J.Whitley和C.Loopez，eds.1993)〕?；畈《疽呙缇哂性斐蓾摲驮偌せ畹奈ｋU?；畈《疽呙缫簿哂信c天然病毒株重組的潛在可能。
已經(jīng)有人研究減毒重組病毒和亞單位疫苗以避免這些危險。Meignier等人描述了一種重組病毒，該病毒是由于刪除了I型單純皰疹病毒毒性所需的區(qū)域并插入II型單純皰疹病毒(HSV-2)糖蛋白基因而獲得的〔《傳染病雜志》(J.Infect.Dis.)，158602-614(1988)〕。該病毒在許多動物模型中具有降低的致病性并且能夠誘導(dǎo)免疫。
最近，已有人報導(dǎo)了必需的立即早期或早期基因有缺失的重組單純皰疹病毒。在小鼠體內(nèi)這些重組病毒能夠有效地誘導(dǎo)免疫力和降低急性復(fù)制以及減少免疫攻擊的野生型病毒的潛伏。Nguyen等人描述了編碼感染細(xì)胞蛋白8(“ICP8”)或ICP27的必需基因上有突變的HSV-1的復(fù)制缺陷突變體〔《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)667067-7072(1992)〕。在病毒能夠感染的細(xì)胞中，ICP8突變體(d301)表達(dá)α和β基因，而ICP27突變體(n504)表達(dá)α、β和γ1基因。這兩種病毒均能誘導(dǎo)比親本病毒(KOS 1.1)低的抗體反應(yīng)，但是ICP27突變體誘導(dǎo)的水平高于ICP8突變體感染所誘導(dǎo)的水平。Morrison和Knipe后來證實注射這些病毒可以保護(hù)小鼠免于形成腦炎和角膜炎，并且能夠減少毒性免疫攻擊病毒的原發(fā)復(fù)制〔《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)68689-696(1994)〕。WO 95/18852描述了相似的復(fù)制缺陷的皰疹病毒突變體，WO 94/03207描述了基于這些突變體的疫苗。
另一株在糖蛋白H(gH)編碼區(qū)有缺失的重組病毒已被報導(dǎo)〔Forrester等，《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)66341-348(1992)；WO 92/05263〕。該病毒感染了非輔助細(xì)胞之后形成病毒顆粒，但是在隨后的生活周期中不能再感染。與化學(xué)滅活病毒的疫苗接種相比，給小鼠接種gH缺失的病毒導(dǎo)致更快的清除野生型的免疫攻擊病毒〔Farrell等，《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)68924-932(1994)〕。給豚鼠接種gH缺失的重組病毒減少原發(fā)的陰道疾病和復(fù)發(fā)〔McLean等，《傳染病雜志》(J.Infect.Dis.)1701100-1109(1994)〕。
大多數(shù)病毒在感染過程中編碼加工病毒蛋白的蛋白酶〔W.G.Dougherty和B.L.Semler，《微生物綜述》(MicrobiologicaiReviews)，57781-822(1993)〕。生物學(xué)和生化方面的研究表明HSV-1包含一種能加工另外的病毒蛋白，衣殼包裝蛋白(也稱為p40，ICP35和VP22a)，的蛋白酶。相似的蛋白酶編碼于皰疹病毒的其它成員的基因組中。該DNA病毒家族包括HSV-1，HSV-2，人和猿巨細(xì)胞病毒(HCMV，SCMV)，水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，人皰疹病毒-6，-7和-8型(HHV-6，HHV-7和HHV-8)，假性狂犬病病毒(PRV)，牛皰疹病毒(BHV)，馬皰疹病毒(EHV)，以及鼻氣管炎病毒等。
Preston等人的早期工作〔《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)451056-1064(1983)〕表明，在非允許溫度HSV-1的溫度敏感(ts)突變株(ts1201)不能裂解衣殼包裝蛋白成為它的小分子量形式。該突變株也不能包裝病毒DNA。通過標(biāo)記獲救，該缺陷被定位于現(xiàn)在被稱為UL 26開放閱讀框架(ORF)的基因組區(qū)域〔McGeoch等，《普通病毒學(xué)雜志》(J.Gen.Virol.)691531-1574(1988)〕。隨后的分析表明兩個轉(zhuǎn)錄子起始于UL26區(qū)域，大約2.1kb的初級轉(zhuǎn)錄子編碼635個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，另一個表達(dá)更豐的轉(zhuǎn)錄子起始于UL26ORF，距初級轉(zhuǎn)錄子起始位點3′大約1000核苷酸。該較小的轉(zhuǎn)錄子編碼預(yù)計329個氨基酸組成的蛋白質(zhì)并且與較大的轉(zhuǎn)錄子所編碼的較大的80kDa ORF具有共同的3′末端〔 F.Y.Liu和B.Roizman.《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)65206-212(1991)〕。ts1201突變株中的缺陷定位于較長轉(zhuǎn)錄子的5′區(qū)域，該轉(zhuǎn)錄子已經(jīng)被證實是在HSV-1〔F.Y.Liu和B.Roizman，J.Virol.655149-5156(1991)〕或猿巨細(xì)胞病毒中編碼一種蛋白酶活性〔Welch等，《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，8810792-10796(1991)〕。
用蛋白酶區(qū)域和衣殼包裝蛋白區(qū)域進(jìn)行的超感染/瞬時表達(dá)〔F.Y.Liu和B.Roizman《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)655149-5156(1991)〕，瞬時表達(dá)〔Welch等，《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，8810792-10796(1991)〕，和感染〔Preston等，《病毒學(xué)》(Virol.)18687-98(1992)〕研究表明蛋白酶在接近羧基末端裂解衣殼包裝蛋白。進(jìn)一步用大腸桿菌所合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行的研究證實了UL26 ORF的全長蛋白質(zhì)能夠在兩個位點裂解它本身以及裂解衣殼包裝蛋白〔Deckman等，《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)667362-7367(1992)〕。Dilanni等人后來將裂解位點定位于UL26ORF的氨基酸247/248和610/611之間〔《生物與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)2682048-2051(1993)〕。
盡管用ts1201所得的結(jié)果表明病毒的缺陷在于其裂解衣殼包裝蛋白的能力以及隨后的DNA包裝，但是現(xiàn)在仍不知道這種表型在本質(zhì)上是蛋白酶活性缺陷的結(jié)果，還是UL26 ORF的5′區(qū)是否編碼衣殼包裝和成熟所必須的其它功能。80kDa前體(被稱為“VP24”或“No”)的蛋白酶作用區(qū)已在B-衣殼中鑒定出〔Davison等，《普通病毒學(xué)》(J.Gen.Virol.)732709-2713(1992)〕并且保留在A-衣殼和C-衣殼中〔F.J.Rixon，《皰疹病毒的結(jié)構(gòu)和包裝》(Structure andAssembly of Herpesviruses)，見于《病毒學(xué)論壇》(Seminars inVirology)，4卷，135-144，(A.J.Davison，編輯1993)〕，這表明該區(qū)的結(jié)構(gòu)作用。在已感染細(xì)胞的細(xì)胞核中B-衣殼是含有衣殼包裝蛋白，但不含有病毒DNA的不成熟衣殼。這些衣殼被認(rèn)為是不能包裝DNA的A-衣殼和伴隨衣殼包裝蛋白缺失的能夠包裝DNA的C-衣殼的前體〔B.Roizman和A.Sears，《單純皰疹病毒與其復(fù)制》(Herpes Simplex Viruses and Their Replication)，見于《人皰疹病毒》(Human Herpesviruses)，11-68(B.Roizman，R.J.Whitley和C.Lopez，編輯，1993)〕。Gao等人構(gòu)建并鑒定了在HSV-1 UL26基因的蛋白酶區(qū)有缺失的無感染力的突變病毒(“m100”)〔《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)683702-3712(1994)〕。該突變病毒在互補(bǔ)細(xì)胞系中能夠增殖，但在非互補(bǔ)Vero細(xì)胞中卻不能，這表明在細(xì)胞培養(yǎng)中UL26的蛋白酶區(qū)域?qū)τ诓《镜膹?fù)制是必要的。DNA復(fù)制以接近野生型的水平進(jìn)行，但是病毒DNA不能被加工成單位基因組長度或者被包裝。
我們已經(jīng)制備了重組病毒以進(jìn)一步在體內(nèi)研究該區(qū)域的作用。該重組病毒在體內(nèi)是無毒的，并且對野生型HSV-1的免疫攻擊能誘發(fā)免疫力。
附圖簡述

圖1表明了四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。(A)質(zhì)粒pMON15839a在SV40多聚腺苷酸信號的上游含有3.4kb的HSV-1的KpnI片斷(“KOS”)。(B)質(zhì)粒pMON15840在皰疹病毒ICP6啟動子區(qū)的下游含有UL26OFR。UL26的翻譯起始于Met 10。(C)被插入到BspEI/BclI酶切的pMON27005中的多克隆位點的序列。(D)質(zhì)粒pMON15835含有插入到pMON27005的BclI位點的ICP6-β-葡萄糖醛酸酶序列。UL26 ORF以畫點的框表示，ICP6啟動子區(qū)以畫斜線的框表示。質(zhì)粒未按比例尺表示?？s寫“K”，KpnI；“B”，BsgI；“S”，SmaI。
圖2表示重組病毒的Southern雜交分析。病毒DNA用NotI或KpnI酶切，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與圖1A所示的α-32P-dGTP標(biāo)記的3.4kb的KpnI片斷雜交。簡圖表示病毒的限制性酶切圖譜。在UL26缺失的簡圖中畫線的區(qū)域是ICP6-β-葡萄糖醛酸酶在蛋白酶區(qū)的插入。泳道1，HSV-1(“17”)；泳道2，HSV/UL26/β-gluc；泳道3，HSV/UL26/res，縮寫“N”，NotI；“K”，KpnI。
圖3是表明突變病毒多步生長曲線的圖表。以MOI為0.1的水平感染BHK/UL26輔助細(xì)胞或BHK/C2細(xì)胞。在各種時間點收集細(xì)胞并且用BHK/UL26輔助細(xì)胞滴定病毒滴度。圓代表來自BHK/UL26輔助細(xì)胞的病毒，方塊代表來自BHK/C2細(xì)胞的病毒。誤差線代表重復(fù)測定的區(qū)間。
圖4表明加工衣殼包裝蛋白的結(jié)果。在MOI為5的情況下感染BHK/C2和BHK/UL26輔助細(xì)胞18小時。收集細(xì)胞并且在14％的變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離出蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)移到Immobilon膜上，然后用針對HSV衣殼包裝蛋白的一段多肽(HSVAs-414)所產(chǎn)生的抗血清來檢測?？瞻仔翘柋硎局饕奈醇庸さ陌b蛋白，實心星號表示已加工的形式。泳道1，對照感染的細(xì)胞；泳道2，野生型HSV-1；泳道3，HSV/UL26/β-gluc；泳道4，HSV/UL26/res。
圖5表示病毒對小鼠的免疫性攻擊試驗。每種病毒以6×105pfu腹腔接種(i.p.)小鼠并計算出死亡率。存活者和對照小鼠(年齡和性別配對的)于32天時用野生型病毒的另一劑量進(jìn)行免疫性攻擊試驗。
圖6表示分別用培養(yǎng)基或102，104，或106pfu HSV/UL26/β-gluc腹腔或皮下(s.q.)接種小鼠。于第1天時或者i.p.(A)或者s.q.(B)接種小鼠。于31天時用107pfu野生型HSV-1腹腔接種小鼠進(jìn)行免疫攻擊試驗。
發(fā)明概述本發(fā)明描述含有一種包裝缺陷的皰疹病毒的疫苗，優(yōu)選，皰疹病毒含有滅活形式的必需蛋白酶的基因。更優(yōu)選，該蛋白酶是將不成熟的非感染性的衣殼顆粒加工并包裝成成熟的感染性衣殼顆粒所需要的。
選自缺失、插入、替代和缺失、插入或替代任意組合的方法可以滅活蛋白酶基因。優(yōu)選，通過病毒DNA的缺失和非病毒(異源性的)DNA的插入或替代來滅活蛋白酶基因。更優(yōu)選，通過病毒DNA缺失和非病毒(異源性的)DNA的插入來滅活必需的蛋白酶基因。
優(yōu)選，滅活的蛋白酶基因選自HSV-1 UL26，HSV-2UL26，和HCMV UL80。更優(yōu)選，蛋白酶由HSV-1 UL26編碼。
本發(fā)明包括選自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV的皰疹病毒。優(yōu)選，病毒是HSV-1或HSV-2。更優(yōu)選，病毒是HSV-1。優(yōu)選，疫苗包含被稱為HSV/UL26/β-gluc的包裝缺陷的突變病毒。
優(yōu)選，疫苗包含大約10～106噬斑形成單位的所用的包裝缺陷的皰疹病毒的劑量。
另外，本發(fā)明描述了制備包含包裝缺陷皰疹病毒的疫苗的方法，通過在能夠產(chǎn)生正確包裝的病毒的重組細(xì)胞系中制備病毒原種，優(yōu)選，制備疫苗的方法使用選自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV的病毒。更優(yōu)選，制備疫苗的方法使用選自HSV-1和HSV-2的病毒。甚至更優(yōu)選，制備疫苗的方法采用HSV-1衍生的病毒。
本發(fā)明也描述了在制備疫苗的過程中，包裝缺陷的皰疹病毒的應(yīng)用。
另外，本發(fā)明描述了針對皰疹病毒通過使用含有包裝缺陷的皰疹病毒的疫苗免疫易感哺乳動物的方法。優(yōu)選，易感哺乳動物選自人、猴、牛、馬、羊、和豬。更優(yōu)選，該哺乳動物為人。
本發(fā)明也描述了含有滅活形式的必需蛋白酶基因的一種突變皰疹病毒，該蛋白酶基因是將不成熟的非感染性的衣殼顆粒加工并包裝成成熟的感染性衣殼顆粒所需要的，它是由病毒DNA的缺失和非病毒(異源性)DNA的插入來滅活的。
優(yōu)選，必需的蛋白酶基因由必需蛋白酶基因的部分缺失和包含受可誘導(dǎo)啟動子調(diào)控的報告基因的非病毒(異源性)DNA的插入來滅活。更優(yōu)選，必需的蛋白酶基因是HSV-1 UL26基因。更優(yōu)選，可誘導(dǎo)的啟動子是HSV0-1 ICP6(UL39)啟動子。甚至更優(yōu)選，非病毒(異源性的)DNA片斷包含HSV-1 ICP6(UL39)啟動子調(diào)控的編碼大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶的gusA基因。
另外，本發(fā)明描述了在可誘導(dǎo)啟動子的調(diào)控下表達(dá)一種必需蛋白酶基因的重組宿主細(xì)胞系。優(yōu)選，重組宿主細(xì)胞系來自哺乳動物。更優(yōu)選，重組宿主細(xì)胞系來源于嚙齒動物。甚至更優(yōu)選，重組宿主細(xì)胞系是BHK-21。優(yōu)選，可誘導(dǎo)的啟動子是皰疹病毒啟動子。更優(yōu)選，可誘導(dǎo)的啟動子是HSV-1 ICP6(UL39)啟動子。
本發(fā)明也描述了通過將病毒導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞系并回收含有突變病毒基因組的成熟病毒顆粒來制備突變皰疹病毒的方法。
定義術(shù)語“包裝缺陷”是指病毒能夠復(fù)制其DNA，但是不能夠完成裂解該DNA成為基因組長度的序列以及將該DNA包裝入病毒衣殼的步驟。
術(shù)語“成熟病毒顆粒”是指能夠感染易感宿主或細(xì)胞的病毒顆粒。術(shù)語“非病毒(異源性的)DNA”是指非來源于皰疹病毒基因組的DNA。術(shù)語“非必需基因”是指能夠通過缺失、插入、替代，或者缺失、替代，和其它DNA的插入的某種組合被破壞的基因，并且含有該已破壞的基因的重組病毒能夠在不表達(dá)未被破壞的相同基因的培養(yǎng)細(xì)胞中增殖。術(shù)語“必需基因”是指不是非必需基因的基因。術(shù)語“必需病毒蛋白酶基因”是指編碼蛋白酶的必需病毒基因。
實驗幼小倉鼠的腎細(xì)胞(BHK-21)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(Rockville，MD)并且培養(yǎng)于補(bǔ)充了10％胎牛血清(JRH生物科學(xué)，Lenexa，KS)，2mM另外的L-谷氨酰胺(JRH Biosciences)以及100μg-單位/ml的青霉素-鏈霉素(JRH Biosciences)的Dulbecco’s 改良Eagle’s培養(yǎng)基。HSV-2 MS株來自ATCC，HSV 17株來自R.Lausch博士，South Alabama大學(xué)。根據(jù)O’Aquila和Summers的方法〔《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.) 611291-1295(1987)〕分離并純化病毒DNA至儲備量，根據(jù)Deluca等人〔《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)52767-776(1984)〕以及Rader等人〔《普通病毒學(xué)》(J.Gen.Virol.)74858-1869(1993)〕的方法分離純化病毒用于快速Southern雜交分析。
為了獲得補(bǔ)充UL26基因缺陷的細(xì)胞系，按照制造商的說明，用LipofectAmine試劑(GIBCO/BRL/Life Technologies，Inc.，GrandIsland，NY)，將10μg含有互補(bǔ)序列(見下面)的質(zhì)粒DNA與1μgSV2neo〔P.J.Southern和P.Berg.《應(yīng)用分子遺傳學(xué)》(J.Mol.Appl.Genet)1327-341(1982)〕共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。兩天后，用胰酶消化細(xì)胞并稀釋到含400μg/ml G418(新霉素，Gibco/BRL/LifeTechnologies，Inc.)的培養(yǎng)基中。分離出單個的菌落并擴(kuò)增以用于測定其輔助功能。
構(gòu)建兩個質(zhì)粒以基因工程制備能夠補(bǔ)充蛋白酶缺陷的HSV-1的細(xì)胞系。首先，來自HSV-1(KOS)(來自華盛頓大學(xué)的P.Olivo)的含有全長UL26啟動子區(qū)和開放閱讀框架(ORF)的3.4kb長的KpnI片斷被亞克隆進(jìn)pMON3327〔Highkin等，《家禽科學(xué)》(PoultryScience)70970-981(1991)〕的KpnI位點，這樣SV40的多聚腺苷酸信號位于UL26 ORF的3′端。該質(zhì)粒被稱為pMON15831a(圖1)。第二個質(zhì)粒包含HSV-1 ICP6(UL39)啟動子區(qū)調(diào)控的UL26ORF。該質(zhì)粒通過幾個步驟進(jìn)行構(gòu)建。首先，含有起始于核苷酸18的UL26 ORF的5′端的320 bp長的SmaI片斷被亞克隆進(jìn)pUC18的SmaI位點，獲得pMON15838。來自pMON27010的1642bp的BsgI-KpnI片斷被插入到BsgI-KpnI酶切的pMON15838中以獲得pMON15839。pMON27010具有來自pUC18中HSV-1(17株)的3.4kb長的KpnI片斷。從pMON15839中分離出1956bp長的EcoRI-HindIII片斷并且在與已用BamHI酶切并用Klenow聚合酶補(bǔ)平的pMON15834連接之前用Klenow片斷補(bǔ)平末端。所獲得的質(zhì)粒稱為pMON15840(圖1)。質(zhì)粒pMON15834具有HSV-1(17株)的末端補(bǔ)平的633bp的XhoI-SnaBI片斷，該片斷指導(dǎo)pMON3327中SmaI位點的ICP6 ORF的表達(dá)。
按下列步驟將β-葡萄糖醛酸酶編碼框插入到UL26 ORF中通過從pMON27002中分離633bp的XhoI-SnaBI片斷來構(gòu)建HSV-1ICP6啟動子區(qū)調(diào)控的β-葡萄糖醛酸酶編碼框。pMON27002具有來自pNEB193(New England Biolabs，Beverly，MA)中HSV-1的16，191bp長的Sse 8387ID片斷。XhoI位點用Klenow聚合酶補(bǔ)平并連接于含有β-葡萄糖醛酸酶基因的pMON14327〔LuckoW等，《病毒學(xué)雜志(J.Virol.)674566-4579(1993)〕中已補(bǔ)平的NcoI位點。該新的質(zhì)粒被稱為pMON1 5833(圖1)。含有HSV-1(17株)UL26 ORF的NotI H片斷(6542bp)被亞克隆進(jìn)NotI酶切的pBS2SKP(Stratagene，La Jolla，CA)以獲得質(zhì)粒pMON27005。pMON27005用BspEI和BclI酶切。將含有多個克隆位點和互補(bǔ)末端的多連接子插入以獲得質(zhì)粒pMON27026(圖1)。為了構(gòu)建與野生型HSV-1(17株)重組的編碼框，用BamHI從pMON15833中切去2871bp的ICP6-β-葡萄糖醛酸酶序列并將該片斷與BclI酶切的pMON27026連接。該新的載體被稱為pMON15835(圖1)。
在轉(zhuǎn)染前的一天以每個60mm的培養(yǎng)皿4×105個細(xì)胞的密度接種BHK細(xì)胞。1微克基因組病毒DNA和等摩爾的含所需序列改變的線性質(zhì)粒于OptiMem培養(yǎng)基中與25μg的LipofectAmine(Gibco/BRL/LifeTechnologies)混合，然后加入到細(xì)胞中共育4小時。吸去培養(yǎng)基并用生長培養(yǎng)基替換。在收集上清之前已感染的細(xì)胞已完全裂解。澄清的系列稀釋的上清(0.8ml)加到60mm培養(yǎng)皿中的輔助細(xì)胞系上，于37℃孵育60分鐘。移去接種上清，然后細(xì)胞用1％瓊脂糖(JRHBiosciences)/10％FBS/EMEM(BioWhitaker，Walkersville，MD)覆蓋。當(dāng)形成可見的細(xì)胞病理效果(cytopathic effects)后，加入4ml含有300μg/ml X-gluc(BioSynth AG，瑞士)和80μg/ml中性紅(Sigma，St.Louis，MO)的Dulbecco’s磷酸緩沖鹽溶液(JRHBiosciences)，然后用巴斯德吸管挑出噬斑。對含有β-葡萄糖醛酸酶基因的病毒來說，選出藍(lán)斑。對于獲救病毒(見下)來說，選出無色斑(clear plaques)。病毒通過噬斑純化三次或者通過有限稀釋來純化。分離出純化的病毒并且用限制性酶分析和Southern雜交對其DNA進(jìn)行分析〔Maniatis等，《分子克隆》(Molecular Cloning)，實驗室手冊(1982)〕。
通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，在藍(lán)斑病毒貯備物中分析無色斑病毒〔Saiki等，《科學(xué)》(Science)，239487-491(1988)〕。合成兩段位于HSV-1(17株)UL26 ORF中BsgI位點旁側(cè)的寡核苷酸序列(Genosys，The Woodlands，TX)。正向引物等同于HSV基因組中核苷酸50，913至50，932之間的序列〔5′-GGGCGAGTTGGCATTGGATC-3′，McGeoch等，《普通病毒學(xué)雜志》(J.Gen.Virol.)691531-1574(1 988)〕。反向引物互補(bǔ)于HSV-1基因組中51，195至51，175之間的序列(5′-AGACCGAGGGCAGGTAGTT-3′)。用酚氯仿抽提病毒并且乙醇沉淀病毒DNA。采用GeneAmp PCR試劑盒(Perkin-Elmer-Cetus，Norwalk，CT)進(jìn)行PCR。反應(yīng)產(chǎn)物于5％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析。
抗相應(yīng)于氨基酸414到428區(qū)域的多肽抗體制備于家兔。由ChironMimotopes Pty有限公司(Raleigh，NC)合成多肽HSVAs-414(C-PAAGDPGVRGSGKR)并且純化到95％以上的純度。HSVAs-414定位于UL26和UL26.5基因中衣殼包裝區(qū)的中央?yún)^(qū)。該多肽在羧基端有游離酸并且在氨基端能與白喉類毒素結(jié)合。100μl與等體積弗氏完全佐劑混合的1μg/ml的蛋白質(zhì)接種家兔，從第2周開始在間隔4周時用混合于弗氏不完全佐劑中的相同材料進(jìn)行加強(qiáng)免疫，然后飼養(yǎng)10到17天。
細(xì)胞接種于6孔板的孔中，每孔5×105個細(xì)胞。次日，于37℃以5pfu/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染細(xì)胞60分鐘，其間偶爾輕輕搖晃。吸出感染上清并加入生長培養(yǎng)基。感染后18小時，吸出培養(yǎng)基并加入400μl含10％疏基乙醇的1×蛋白質(zhì)裂解緩沖液(Protein DisruptionBuffer)(Novex，San Diego，CA)。14％Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Novex)以125伏的電壓電泳1.5小時分離出蛋白質(zhì)。該凝膠在1×轉(zhuǎn)移緩沖液(Transfer Buffer)(Novex)中孵育10分鐘，然后在30伏電壓下轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜(Novex)上1-2小時。該膜在含吐溫80的1×Tris-緩沖鹽溶液(TTBS)中孵育至少1小時(典型情況是過夜)，該緩沖液補(bǔ)充了5％的奶粉。用TTBS沖洗印跡2次各15分鐘，然后在1/1000的稀釋度下與第一抗體孵育1小時。與第二抗體(堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗兔抗體，Promega，Madison，WI)以1/4000的稀釋度共育1小時之前，用TTBS沖洗印跡2次各15分鐘。印跡于四唑氮藍(lán)(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)(Promega)中孵育5～15分鐘，使堿性磷酸酶可見，然后在H2O中充分沖洗以終止反應(yīng)。
多步生長分析BHK/UL26輔助細(xì)胞以及不具有輔助功能但能抗G418的BHK細(xì)胞(BHK/C2)來檢測病毒的復(fù)制。細(xì)胞(1×105)接種至24孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中并以每個細(xì)胞0.1噬斑形成單位(pfu)的感染復(fù)數(shù)進(jìn)行感染。在感染后各種時間，對感染的細(xì)胞進(jìn)行三次凍融〔Tengelsen等《病毒學(xué)雜志)》(J，Virol.)673470-3480(1993)〕，然后用BHK/UL26輔助細(xì)胞滴定裂解物。
為了制備能夠支持在UL26開放閱讀框架區(qū)有缺失和插入的重組病毒復(fù)制的細(xì)胞系， BHK細(xì)胞用pMON15831a和SV2neo共轉(zhuǎn)染，pMON15831a具有HSV-1(KOS)5′到SV40多聚腺苷酸信號之間3.4kb的KpnI片斷(圖1)。分離出G418抗性細(xì)胞并通過Southern雜交分析顯示是否含有HSV-1 KpnI片斷。為了測定哪一細(xì)胞系能表達(dá)UL26基因產(chǎn)物，用HSV-2(MS)感染細(xì)胞以刺激細(xì)胞內(nèi)的UL26啟動子。HSV-1特異的抗多肽血清，用與白喉毒素偶聯(lián)的HSVAs-414接種家兔而制備的，用于鑒定UL26基因產(chǎn)物的表達(dá)(數(shù)據(jù)未列出)。被稱為BHK/UL26/8的這個細(xì)胞系用于制備重組病毒。用pMON3327和SV2neo共轉(zhuǎn)染的G418抗性細(xì)胞系被用作對照并且稱為BHK/C2。當(dāng)發(fā)現(xiàn)因為與BHK/UL26/8中的KpnI片斷重組而制備出大量的獲救病毒之后，分離出另一輔助細(xì)胞系(BHK/UL26輔助細(xì)胞)。用質(zhì)粒pMON15840轉(zhuǎn)染第二細(xì)胞系，該質(zhì)粒在ICP6啟動子之后具有UL26ORF并且缺乏pMON15831a所含的UL26 ORF 5′端的大量HSVDNA。該整合質(zhì)粒的翻譯起始于天然氨基酸10的蛋氨酸。篩選候選細(xì)胞系以測定它們輔助藍(lán)斑表型重組病毒(見后)生長的能力。從這較后篩選中所分離出的能輔助UL26突變病毒生長的細(xì)胞系被稱為BHK/UL26輔助細(xì)胞系。
用HSV-1(17株)基因組DNA和質(zhì)粒pMON15835轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BHK/UL26/8，該質(zhì)粒含有HSV-1(17株)的NotI片斷，在UL26ORF中的蛋白酶區(qū)有缺失并且插入HSV-1(17株)ICP6啟動子調(diào)控的細(xì)菌β-葡萄糖醛酸酶基因(圖1)。細(xì)胞裂解后，上清系列稀釋于BHK/UL26/8并于感染4～5天后鑒定出藍(lán)斑。挑出藍(lán)斑并且噬斑純化3次。重組病毒被稱為HSV/UL26/β-gluc。噬斑純化表明藍(lán)表型重組病毒與似乎具有生長優(yōu)勢的無色斑表型病毒的差異小，即使在輔助細(xì)胞系上也一樣。
為了測定無色斑病毒的基因型和起源，對來自藍(lán)斑和無色斑表型病毒混合培養(yǎng)的不含細(xì)胞的病毒DNA進(jìn)行DNA擴(kuò)增。283bp片斷的擴(kuò)增表明在貯備病毒中存在野生型病毒。用BsgI酶切PCR產(chǎn)物，該酶酶切野生型(17株)DNA的片斷，但是不能酶切野生型(KOS株)DNA的片斷，野生型(KOS株)DNA為輔助細(xì)胞DNA的來源(數(shù)據(jù)未列)。BsgI不能酶切PCR產(chǎn)物表明野生型病毒實際上是藍(lán)斑表型病毒與輔助細(xì)胞系中UL26序列重組所產(chǎn)生的返祖病毒。該獲救病毒稱為BHK/UL26/res。
為了制備更純的HSV/UL26/β-gluc貯備物，分離出一種新輔助細(xì)胞系(BHK/UL26輔助細(xì)胞)，該細(xì)胞中刪去了UL26 ORF 5′端的HSVDNA序列并且用ICP6啟動子區(qū)片斷替代(pMON15840，圖1)。HSV/UL26/β-gluc在該細(xì)胞系中的增殖只產(chǎn)生藍(lán)斑表型。
用NotI或KpnI酶切野生型(17株)、HSV/UL26/β-gluc和獲救病毒的病毒DNA。用含全長UL26閱讀開放框架和5′旁側(cè)序列的限制性酶切片斷探測之后，通過Southern雜交分析分析被酶切的DNA。該結(jié)果表明了預(yù)期的酶切模式(圖2)。當(dāng)用NotI(6.3kb)和KpNI(3.4kb)酶切(泳道1和3)時野生型和獲救病毒表現(xiàn)出了預(yù)期的相同的模式。UL26 ORF的小區(qū)域缺失和β-葡萄糖醛酸酶基因的插入導(dǎo)致在HSV/UL26/β-gluc中一個新NotI位點(導(dǎo)致預(yù)期的4.8和4.4kb的片斷)和一個新KpnI位點(導(dǎo)致4.0和2.1kb的片斷)(泳道2)的增加。
在不同的細(xì)胞系中測定病毒的生長曲線。感染后各種時間，收集細(xì)胞并在加入到BHK/UL26輔助細(xì)胞上之前凍融3次。結(jié)果表明HSV/UL26/β-gluc不能在BHK/C2細(xì)胞中復(fù)制，但在BHK/UL26輔助細(xì)胞中按野生型動力學(xué)生長。野生型(17株)HSV-1和獲救病毒在BHK/C2和BHK/UL26輔助細(xì)胞中均復(fù)制到相同滴度并以相同的速率復(fù)制(圖3)。
因為哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌和ts1201中的瞬時轉(zhuǎn)染實驗已經(jīng)表明，細(xì)胞和在UL26 5′區(qū)的某些突變不能裂解衣殼包裝蛋白〔綜述于Gao等，J.Virol.683702-3712(1994)〕，所以用HSV/UL26/β-gluc在MOI為5的條件下感染BHK/C2、BHK和BHK/UL26輔助細(xì)胞。感染后18小時，細(xì)胞在SDS-PAGE標(biāo)本緩沖液中裂解并在14％SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)。當(dāng)轉(zhuǎn)移到Immobilon P膜上之后，印跡孵育于抗HSV-1衣殼包裝蛋白的抗血清。結(jié)果示于圖4。HSV/UL26/β-gluc感染BHK/C2細(xì)胞導(dǎo)致不能加工衣殼包裝蛋白至較低分子量的形式。HSV/UL26/β-gluc感染BHK/輔助細(xì)胞表明衣殼包裝蛋白被適當(dāng)加工處理。獲救重組病毒(HSV/UL26/res)如同野生型HSV-1在兩種細(xì)胞系中均能加工處理衣殼包裝蛋白(泳道2和4)。在感染時輔助細(xì)胞和非輔助細(xì)胞均以相同水平制備衣殼包裝蛋白，但其在非輔助細(xì)胞中不能被裂解。HSV/UL26/β-gluc重組體不能加工衣殼包裝蛋白并有限制性的生長。
100μl體積病毒腹腔或皮下接種雌性Swiss-Webster小鼠(12-14克，Charles Rivers實驗室，Wilmington，MA)。小鼠被短暫CO2/O2處理后，皮下注射物轉(zhuǎn)送到靠近尾基底部的背側(cè)。如果沒有指明，病毒均懸浮于含5％FBS的DMEM中。食物和水任意給予小鼠。在小鼠由于癱瘓而奄奄一息時對它們進(jìn)行安樂死。
給小鼠腹腔注射于100μl體積6×105pfu(按輔助細(xì)胞系所測定的)或者野生型(17株)HSV，HSV/UL26/β-gluc，或者獲救病毒。如圖5所示。野生型(17株)或獲救病毒所感染的小鼠死于感染后7天。用HSV/UL26/β-gluc感染的小鼠均存活。以最初給予的相同劑量，用野生型HSV-1(17株)腹腔注射來免疫攻擊最初用HSV/UL26/β-gluc感染的動物。年齡和性別配對的未接種病毒的小鼠也進(jìn)行接種。用野生型病毒感染后大約16小時發(fā)現(xiàn)1只HSV/UL26/β-gluc感染的小鼠死亡。因為感染后如此快地發(fā)生死亡，所以死亡可能不是與病毒有關(guān)。其它的9只小鼠在野生型病毒的免疫攻擊后存活。盡管病毒需要更長的時間導(dǎo)致未接種小鼠的病態(tài)和死亡(圖5)，但未接種小鼠易感于野生型病毒的感染。
再一次實驗中，起始于最初實驗中所用的相同接種病毒，10倍倍比稀釋的HSV/UL26/β-gluc腹腔接種小鼠。在39天時，6×106pfuHSV-1(17株)腹腔接種免疫攻擊小鼠。這次野生型病毒的量比最初實驗中所用量高10倍而導(dǎo)致最初用DMEM/5％FBS接種的小鼠90％死亡(表1，對照感染組)。再者，于16小時之內(nèi)，發(fā)現(xiàn)6只小鼠死亡。其中2只是在10pfu HSV/UL26/β-gluc接種的動物組，而4只是在1×105pfu HSV/UL26/β-gluc接種的動物組。在6條生存曲線之間有顯著差異(p＜0.02，log rank test)。數(shù)據(jù)表明HSV/UL26/β-gluc接種的小鼠以劑量依賴的方式幸存(表1)。最高劑量HSV/UL26/β-gluc接種小鼠的存活曲線與對照組在統(tǒng)計學(xué)上有差異(p＝0.023，log rank test)。
表1HSV/UL26/β-gluc ％存活*對照 106×101pfu 12.56×102pfu 306×103pfu 606×104pfu 506×105pfu 83.3*6×106pfu野生型HSV-1(17株)腹腔接種進(jìn)行免疫攻擊后20天測定小鼠的存活率。除了6×101(N＝8)和6×105(N＝6)組因為早期死亡之外各組均為N＝10。
第三次實驗中，如前所述制備病毒貯備液但是懸浮于不含F(xiàn)BS的DMEM中。每組10只小鼠的實驗動物單獨用DMEM或用逐漸增加劑量的HSV/UL26/β-gluc通過腹腔或皮下注射途徑進(jìn)行接種。1個月后，通過腹腔接種對所有的小鼠用107pfu野生型病毒進(jìn)行免疫攻擊。一些快速死亡的對照包括腹腔接種培養(yǎng)基然后腹腔接種培養(yǎng)基免疫攻擊的動物，或者HSV/UL26/β-gluc接種然后培養(yǎng)基免疫攻擊的動物，或者HSV/UL26/β-gluc接種然后HSV/UL26/β-gluc免疫攻擊的動物。在實驗過程中這些實驗動物沒有死亡。其中，90只動物受到病毒的兩次接種，可以預(yù)期10-12％的動物快速死亡。同實驗組的結(jié)果一起示于圖6A和6B。對于腹腔注射(p＜0.01)和皮下注射(p＜0.01)來說，存活曲線之間均有顯著差異(log rank test)?；貧w分析表明，對兩組來說，HSV/UL26/β-gluc對存活均有劑量依賴效應(yīng)(p＜0.05Cochran-Armitage test)。
預(yù)期該病毒具有減低的效能并且易再激活。突變影響晚期基因功能的事實表明重組病毒在誘導(dǎo)免疫力方面比在立即早期或早期基因中有缺失的病毒更加有效。包裝缺陷的HSV/UL26/β-gluc病毒是新一類在晚期基因活性方面有缺陷的疫苗候選者中的成員。
預(yù)期在包裝缺陷病毒中所述的必需基因中的缺陷能整合至在必需或非必需基因中有其它突變的病毒中。諸如HSV-1的ICP47等基因可以調(diào)整宿主增強(qiáng)對病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力〔Hill等，《自然》(Nature)375411-415(1995)；Fruh等，《自然》(Nature)375415-417(1995)〕。
本發(fā)明的疫苗可為凍干的形式或者懸浮于制藥學(xué)上可接受的載體中。適合的懸浮液包括磷酸緩沖液，鹽溶液，葡萄糖液，滅活的血清，賦形劑，和佐劑。可以根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備和使用該疫苗〔綜述于R.L.Burke，Seminar in Virology，4187-197(1993)〕。有效劑量也可通過本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行確定?？傊?，疫苗制備于適當(dāng)?shù)臒o菌緩沖液中并以103～109pfu/kg的劑量通過皮內(nèi)、肌肉內(nèi)，或皮下注射進(jìn)行使用。該疫苗也可制備于本領(lǐng)域中已知的載體中以口服或眼部用藥。
前面給予詳細(xì)描述僅為有利于清晰的理解，因此不應(yīng)有不必要限制的理解。因為本發(fā)明范圍內(nèi)的修改對于本領(lǐng)域中的那些技術(shù)人員來說將是明白易懂的。
權(quán)利要求
1.含有一種包裝缺陷的皰疹病毒的疫苗。
2.權(quán)利要求1的疫苗，其中所說的皰疹病毒含有必需蛋白酶基因的滅活形式。
3.權(quán)利要求2的疫苗，其中所說的必需蛋白酶基因是將不成熟、非感染性的衣殼顆粒加工并包裝成成熟、感染性衣殼顆粒所需要的。
4.權(quán)利要求1中的疫苗，其中皰疹病毒選自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV。
5.權(quán)利要求4的疫苗，其中所述的皰疹病毒是HSV-1或HSV-2。
6.權(quán)利要求4的疫苗，其中所述的皰疹病毒是HSV-1。
7.權(quán)利要求3的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因選自HSV-1UL26、HSV-2 UL26、和HCMV UL80。
8.權(quán)利要求7的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因是HSV-1UL26。
9.權(quán)利要求2的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因通過選自缺失、插入、DNA的替代、和缺失、插入、或DNA替代的任一組合的方法來進(jìn)行滅活。
10.權(quán)利要求9的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因通過病毒DNA的缺失和非病毒(異源性的)DNA插入來進(jìn)行滅活。
11.包含大約10～106噬斑形成單位的所述皰疹病毒的權(quán)利要求1的疫苗。
12.權(quán)利要求1的疫苗，其中所述的包裝缺陷的皰疹病毒包括稱為HSV/UL26/β-gluc的病毒株。
13.制備含有包裝缺陷皰疹病毒的權(quán)利要求1的疫苗的方法，通過在能夠產(chǎn)生正確包裝的病毒的重組細(xì)胞系中制備所述皰疹病毒的貯備物，然后將該病毒懸浮于制藥上可接受的載體中。
14.權(quán)利要求13的制備疫苗的方法，其中所述的必需蛋白酶基因是HSV-1 UL26基因。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述的疫苗包含HSV/UL26/β-gluc病毒株。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述的細(xì)胞系是哺乳動物的細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述的細(xì)胞系支持所述皰疹病毒的復(fù)制。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的細(xì)胞系是稱為BHK/UL26/8的細(xì)胞系。
19.權(quán)利要求17的方法，其中該細(xì)胞系包括稱為BHK/UL26輔助細(xì)胞的細(xì)胞系。
20.包裝缺陷的皰疹病毒在疫苗制備中的應(yīng)用。
21.通過給予權(quán)利要求1的懸浮于制藥上可接受載體中的疫苗來針對皰疹病毒免疫動物的方法。
22.權(quán)利要求21的方法，其中哺乳動物選自人、猴、牛、馬、羊和豬。
23.權(quán)利要求22的方法，其中哺乳動物是人。
24.含有必需蛋白酶基因滅活形式的突變皰疹病毒，該基因是將不成熟的非感染性的衣殼顆粒加工并包裝成成熟的感染性衣殼顆粒所必需的，該必需蛋白酶基因通過病毒DNA的缺失和非病毒(異源性)DNA的插入來滅活。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的突變病毒，其中該病毒選自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV。
26.權(quán)利要求25的突變病毒，其中所述必需蛋白酶基因是HSV-1UL26。
27.權(quán)利要求24的突變病毒，其中缺失了該必需蛋白酶的部分基因并用含可誘導(dǎo)性皰疹病毒HSV-1啟動子調(diào)控的報告基因的非病毒(異源性)DNA片斷來替代。
28.權(quán)利要求27的突變病毒，其中該報告基因選自編碼β-葡萄糖醛酸酶的gusA、編碼β-半乳糖苷酶的LacZ、編碼堿性磷酸酶的phoA、編碼綠色熒光蛋白的gfP，和編碼水母發(fā)光蛋白的aeq。
29.權(quán)利要求28的突變病毒，其中所述的報告基因是編碼大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶的gusA基因。
30.權(quán)利要求27的突變病毒，其中該可誘導(dǎo)的皰疹病毒啟動子是HSV-1 ICP6(UL39)啟動子。
31.在可誘導(dǎo)的非蛋白酶啟動子的調(diào)控下表達(dá)必需皰疹病毒蛋白酶基因的重組宿主細(xì)胞系。
32.權(quán)利要求31的重組宿主細(xì)胞系，其中宿主細(xì)胞系來自嚙齒動物。
33.權(quán)利要求32的重組宿主細(xì)胞系，其中該宿主細(xì)胞系是BHK-21。
34.權(quán)利要求31的重組宿主細(xì)胞系，其中該可誘導(dǎo)的非蛋白酶啟動子是HSV-1 ICP6(UL39)啟動子。
35.通過將所述病毒導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞系并收集含有突變病毒基因組的成熟病毒顆粒來制備權(quán)利要求24中突變皰疹病毒的方法。
全文摘要
本發(fā)明描述一種含有包裝缺陷的皰疹病毒的疫苗。突變的皰疹病毒能夠進(jìn)行感染并且能夠在易感哺乳動物的細(xì)胞中進(jìn)行DNA復(fù)制,但是在衣殼包裝和形成成熟病毒顆粒方面卻是有缺陷的。該包裝缺陷的皰疹病毒是無毒性的并且能夠在疫苗接種的哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。
文檔編號C12R1/92GK1230893SQ97198119
公開日1999年10月6日 申請日期1997年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月26日
發(fā)明者P·J·希普彭梅耶爾, A·M·蘭金, V·A·盧科夫 申請人:G·D·瑟爾公司