專利名稱：皰疹病毒骨架用于病毒疫苗和以其為基礎(chǔ)的疫苗的制作方法
皰疹病毒骨架用于病毒疫苗和以其為基礎(chǔ)的疫苗本申請主張2009年7月觀日提交的美國臨時申請?zhí)?1/271，938的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容被并入本文以作參考。本申請全文引用了某些出版物。在權(quán)利要求書之前可以發(fā)現(xiàn)這些出版物的完整出處。這些出版物全部內(nèi)容以引用方式被并入，以便更全面的說明與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)水平。在此揭露的本工作是在美國國家衛(wèi)生研究院(the National Institutes of Health)的發(fā)出的支助號AI-024021的支助下完成，美國政府享有本發(fā)明的一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
從歷史上來看，病毒疫苗要么是滅活的病毒或者活減毒活病毒，但是這些類型的疫苗對追蹤某些病毒例如皰疹病毒或HIV不可行。當(dāng)前對包括病毒載體如單純性皰疹病毒-I (Herpes Simplex Virus-I, HSV-I)的新型病毒疫苗研究正在進行中。單純性皰疹病毒需要HSV-I蛋白ICPO的表達，以允許來自病毒基因組的基因的有效表達，更重要的是提高病毒滴度(titer)，從而提高疫苗的產(chǎn)量。然而，ICPO的表達也干擾先天免疫(innate immunity)，一種與理想疫苗載體不兼容的性質(zhì)。ICPO的一個功能是游離細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)域10 (nuclear domain 10,ND10)復(fù)合物，以及泛素化早幼粒細(xì)胞(promyelocytic，PML)蛋白導(dǎo)致其降解。PML是細(xì)胞的守護者 (gatekeeper)之一，其對干擾素誘導(dǎo)負(fù)責(zé)。在此揭露了一種采用單純性皰疹病毒基因組作為骨架，但是用ICPO被替代的重組病毒。該重組病毒復(fù)制達到相對高的滴度，并對于干擾素敏感。因此，該載體僅僅保留了 ICPO的在疫苗發(fā)展期所需的性質(zhì)。發(fā)明概述一種重組脫氧核糖核酸，該重組脫氧核糖核酸包含一段(種)整合的異源 (heterologous)DNA^rt的入Jpi屯個生;)(human herpes simplex virus, HSV)月兌fi 核糖核酸(DNA)，其中該異源DNA編碼一種包含環(huán)-指(RING-finger)域的多肽。一種包含編碼一種帶有環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的多肽的異源DNA的重組人單純性皰疹病毒 (HSV)，該異源DNA (a)被插入進該HSV基因組的一個非必要區(qū)域(non-essential region) 中，以及(b)在引入該重組HSV的宿主細(xì)胞中被表達。一種疫苗其包含(1) 一種藥學(xué)可接受載體和( 一種包含人單純性皰疹病毒 (HSV)基因組的重組脫氧核糖核酸的重組病毒，，該人單純性皰疹病毒(HSV)基因組(a)具有一段編碼包含一種環(huán)-指結(jié)構(gòu)域多肽的整合的異源DNA以及(b)具有一段或多段整合的異源DNA，其中每段DNA編碼一種糖蛋白。一種使受試者抗水痘帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus, VZV)感染的免疫方法，該方法包含給予受試者一定量即時(instant)疫苗，以有效引起受試者對該水痘帶狀皰疹病毒的免疫應(yīng)答，從而使受試者免疫。一種制備用于預(yù)防一種病毒感染的組合物的方法，該方法包括將即時重組病毒與一種活疫苗穩(wěn)定劑結(jié)合，從而制備該組合物。附圖簡要說明圖 1 JCPO 和 0RF61p 的氨基酸序列比對(Alignment) (SEQ ID NOs :1 (ICPO) 和2 (0RF61))。ICPO和0RF61p的氨基酸序列(NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的編號分別為 NP_044601. 1 和 NP_040183. 1)是采用 Gonnet 矩陣(Gonnet Matrix)來排列的，其空位開放罰分(Open Gap Penalty)為10.0以及其空位延展罰分(Extend Gap Penalty)為0· 1。 C3HC4環(huán)指(RING finger)共同序列的半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)基團用d來標(biāo)記。在 ICPO 的 C-末端的 NDlO 的靶域(NDlOtargeting domain) (18)也被標(biāo)記了。ICPO 和 0RF61p 的NLS區(qū)域用下劃線標(biāo)注(52,63). USP7的相互作用位點(interaction site)用黑色框標(biāo)記，相互作用所必需的氨基酸用箭頭來示出(19)。用于編碼E3泛素連接酶(ubiquitin ligase)活性(30)的兩個區(qū)域也被標(biāo)注了。圖2 :PML和SplOO在ICPO和0RF61p表達細(xì)胞中的重新分布。生長在玻璃蓋玻片 (coverslips)上的MeWo細(xì)胞被模擬處理(A和D)或者用表達ICPO (B和E)或0RF61p (C和 F)的質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后48小時，細(xì)胞被固化，病毒蛋白和PML(A-C)或SplOO(D-F) 的定位通過間接免疫熒光顯微鏡法來監(jiān)測。采用赫斯特染劑赫斯特染劑(赫斯特染劑)對細(xì)胞核進行著色。圖像用IOOx物鏡捕獲，并通過體積去褶積法(volume deconvolution) 分析。圖 3 =PML 和 SplOO 在 ICPO 或 0RF61p 表達細(xì)胞中的豐度(Abundance)。MeWo 細(xì)胞被模擬處理或用Adempty、AdICPO或Ad0RF61在感染復(fù)數(shù)(MOI) 5處感染。感染后48小時(Forty-eight hpi)，總細(xì)胞溶菌液(Iysates)采用 SDS-PAGE 分析。PML、SplOO, ICP0, 0RF61p和微管蛋白的水平通過western蛋白印跡法(western blotting)分析。PML和 SplOO的不同種類用星號來表示出。圖 4 :0RF61p 靶向 NDlOs 并不導(dǎo)致 PML 的降解。(A) ICP0、0RF61p 和 0RF61p 翻譯融合到ICPO的C-末端的示意圖。B)MeWo細(xì)胞被模擬處理或用表達ICP0、0RF61p或0RF61p 融合蛋白的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化。感染后48小時，總細(xì)胞溶菌液采用SDS-PAGE分析。ICP0、0RF61p 和微管蛋白的水平通過western蛋白印跡法分析。(C-E)生長在玻璃蓋玻片上的MeWo細(xì)胞被模擬處理(C)或者用表達0RF61p融合蛋白(D和E)的質(zhì)粒構(gòu)建物轉(zhuǎn)化。48小時后，細(xì)胞被固化，0RF61p和PML的定位通過間接免疫熒光顯微鏡法來監(jiān)測。采用赫斯特染劑赫斯特染劑對細(xì)胞核進行著色。圖像用IOOx物鏡捕獲，并通過體積去褶積法分析。圖5 在單純性皰疹病毒(HSV)和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)感染期間PML的定位。生長在玻璃蓋玻片上的MeWo細(xì)胞用HSV在感染復(fù)數(shù)MOI為1處(A)或用無細(xì)胞 (cell-free) VZV在MOI大約0.01處進行感染(B-D)。HSV感染的細(xì)胞在感染后6小時被固化，VZV感染的細(xì)胞在感染后24小時被固化；ICPO (A)、0RF61p(B)、0RF62p (C)、gE (D)和 PML(A-D)的存在通過間接免疫熒光顯微鏡法來監(jiān)測。采用赫斯特染劑對細(xì)胞核進行著色。 圖像用IOOx的物鏡捕獲，并通過體積去褶積法分析。圖6 在HSV和VZV感染期間SplOO的定位。生長在玻璃蓋玻片上的MeWo細(xì)胞用 HSV在MOI為1處(A)或用無細(xì)胞VZV在MOI大約0. 01處進行感染(B和C)。HSV感染的細(xì)胞在感染后6小時被固化，VZV感染的細(xì)胞在感染后M小時被固化；ICPO (A)、0RF62p⑶、 gE(C)和SplOO (A-C)的存在通過間接免疫熒光顯微鏡法來監(jiān)測。采用赫斯特染劑赫斯特染劑對細(xì)胞核進行著色。圖像用IOOx物鏡捕獲，并通過體積去褶積法分析。圖7 :PML, SplOO和Daxx在HSV和VZV感染期間的豐度。(A)MeWo細(xì)胞用HSV在 MOI為5處或用無細(xì)胞VZV在MOI大約0. 01處進行感染。在感染后的指定時間，PML、Sp 100、 Daxx、ICP0、0RF61p和微管蛋白的水平通過western蛋白印跡法分析。(B)MeWo細(xì)胞被模擬處理或用包含1000或2000U/ml的干擾素α的媒介培養(yǎng)。處理后48小時，總細(xì)胞溶菌液用于監(jiān)測 PML、SplOO, Daxx, STAT1、磷酸化 STATU STAT2 和磷酸化 STAT2。圖 8 :PML、SplOO 和 Daxx 對于 VZV 復(fù)制的影響.(A)來自 sicontrol，siPML, siSplOO和siDaxx細(xì)胞的總細(xì)胞溶菌液通過western蛋白印跡法分析其PML、SplOO, Daxx 和微管蛋白水平。(B)sicontrol、siPML、siSplOO和siDaxx細(xì)胞用VZV的系列稀釋物感染。 感染后5天，單層(monolayers)被固化，著色，菌斑被計數(shù)，并對照在sicontrol細(xì)胞中形成的數(shù)目。誤差線(error bars)表明五個獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個實驗都操作兩遍。(C) sicontrol、siPML、siSpl00和siDaxx細(xì)胞用無細(xì)胞VZV在MOI大約0. 01處進行感染。在感染后的指定時間，細(xì)胞溶菌液通過western蛋白印跡法分析其中的0RM9p、0RF63p和微管蛋白。用ImageJ來量化帶強度(Band intensities)并以微管蛋白歸一化。(D) sicontrol、 siPML、siSpl00和siDaxx細(xì)胞用無細(xì)胞VZV在MOI大約0. 01處進行感染。在感染后的指定時間，細(xì)胞被收集并通過滴定來測定在新鮮的MeWo單層的感染中心的數(shù)目。感染后4天， 單層被固化，著色，菌斑被計數(shù)以計算感染中心的滴度。D圖是一個代表實驗，其顯示每個細(xì)胞系的生長曲線。每個數(shù)據(jù)點代表兩個樣品的平均值。E圖顯示這四個獨立實驗的時間點的平均值，以及誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖 9 在 sicontrol、siPML、siSplOO 和 siDaxx 細(xì)胞上的感染病灶(infected foci)的形態(tài)學(xué)。Sicontrol、siPML、siSplOO和siDaxx細(xì)胞用無細(xì)胞VZV在MOI的大約 0. 01處進行感染。在感染后2和3小時，細(xì)胞被固化，0RF63P和gE的定位通過免疫熒光顯微鏡法進行。采用赫斯特染劑赫斯特染劑對細(xì)胞核進行著色。圖像用IOx物鏡捕獲。

圖10 表達水痘帶狀皰疹病毒0RF61p的單純性皰疹病毒的結(jié)構(gòu)。㈧ICPO位點 (locus)的示意圖。(B)由dll403或HSV-0RF61感染細(xì)胞制備的pCPC-061和Hirt DNA被擴增，使用本文后述結(jié)果II的原料和方法(Materials and Methods of results II)中具體說明的引物集合(primer sets)。(C)MeWo細(xì)胞被模擬處理或者是用野生型的HSV-I、 dll403或HSV-0RF61在MOI為5處進行感染。在感染后8小時，細(xì)胞被收集，并采用在原料和方法中描述的抗體進行western蛋白印跡法分析以監(jiān)測ICP0、ICP4、0RF61p和微管蛋白的豐度。圖11 表達水痘帶狀皰疹病毒0RF61p的單純性皰疹病毒的生長分析。(A)用野生型的HSV-I、dll403或HSV-0RF61的系列稀釋物來感染Vero或L7細(xì)胞。感染后3天，單層被固化，著色，菌斑被計數(shù)。相對菌斑形成效率(Relative plaquing efficiency)為X 100。誤差線表明來自四個獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中每個實驗操作兩遍。(B)MeWo細(xì)胞用野生型的HSV-I、dll403或HSV-0RF61在MOI為0. 1處進行感染。感染后2小時、12小時、 24小時和48小時，收集感染細(xì)胞，將其進行3輪的融化(freeze-thaw)；在L7細(xì)胞上滴定后計算收率。圖12 病毒特有蛋白(virus-specified proteins)表達的時間進程。MeWo細(xì)胞在MOI為0. 2處用野生型的(HSV-I)、ICPO-(dl 1403)和HSV-0RF61來進行感染。在指定的時間收集感染細(xì)胞，并western蛋白印跡法檢測ICP4、ICP27、ICPO和0RF61p的合成和豐度。所有泳道(lanes)都被用抗-微管蛋白抗體進行著色以證明每一泳道承載了等量的細(xì)胞蛋白。圖13 在用一種表達水痘帶狀皰疹病毒0RF61p的單純性皰疹病毒感染期間的 PML和SplOO的命運(fate)和條件。(A)MeWo細(xì)胞或者用模擬處理，或者用野生型HSV-I、 dll403或HSV-0RF61在MOI為10處進行感染。感染后2小時和4小時，細(xì)胞被收集，并用 western蛋白印跡法監(jiān)測PML、Spl00、ICP0、0RF61p和微管蛋白的豐度。(B)空白(Empty)、 siPML和SiSplOO細(xì)胞用野生型的HSV-I、dl 1403或HSV-0RF61的系列稀釋物進行感染。感染后3天，單層被固化和著色，菌斑被計數(shù)并對照在空白細(xì)胞中形成的數(shù)目。誤差線表明來自3個獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差，每個獨立實驗被進行兩遍。圖14 一種表達水痘帶狀皰疹病毒0RF61p的單純性皰疹病毒對于干擾素α的敏感性。經(jīng)過模擬處理或用干擾素α處理過夜的MeW0，Ver0或U20S細(xì)胞用野生型的HSV-I、 dll403或HSV-0RF61的系列稀釋物感染。感染后3天，單層被固化，著色，菌斑被計數(shù)。每種病毒在每個細(xì)胞系上的相對菌斑形成效率被計算為模擬處理的細(xì)胞中的滴度/在干擾素α處理的細(xì)胞中的滴度Χ100。圖15 =VZV基因組的代表性示意圖，標(biāo)明編碼糖蛋白的開放閱讀框(ORFs)。發(fā)明的詳細(xì)描述HSV的非限制性例子包括Glasgow病毒菌株7 (Glasgow strain 7)；人皰疹病毒 1 (Human herpesvirus 1，HSV_1)HF VR-260 ；人皰疹病毒 1 (Human herpesvirus 1，HSV_1) MaclntyreVR-539 ；人皰疹病毒 1 (Human herpesvirus 1, HSV-I) KOS VR-1493 ；人皰疹 ^ 2 (Human herpesvirus 2, HSV-2)G VR-734 -,X'M^M^ 2 (Human herpesvirus 2, HSV-2)MS VR-MO ;如存放在馬納薩斯的美國模式培養(yǎng)物集存庫(theATCC at Manassas, VA 20108, USA.)的人皰疹病重組毒GHSV-UL46 VR-1544 VZV的非限制性例子包括Jones 菌株(Jones strain) ；Oka VZV病毒(Oka strain of VZV)，如存放在馬納薩斯的美國模式培養(yǎng)物集存庫(the ATCC at Manassas, VA 20108, USA.)的 VR-795。在此所述的有關(guān)核酸或病毒的“重組”是指一個分子或病毒個體，其具有兩個獨立的原始來源并組合在一起成為單個形式的核酸或病毒。例如，重組脫氧核糖核酸可以是由一個單純性皰疹病毒基因組和一個來自水痘帶狀皰疹病毒的基因組合得到一個單一的DNA 分子。例如，重組病毒是一種病毒，其具有一種包含了一個外來的或異源的編碼序列/基因的核酸。在一個實施例中，這兩種不同的過程是不同的物種。在此所述的關(guān)于例如異源脫氧核糖核酸中的“異源(Heterologous)”是指其DNA 衍生自一個不同的生物體(或者具有一個相同的序列)，而非源自被相對地描述為異源的生物本體DNA。在一個非限制性例子中，一個衍生自水痘帶狀皰疹病毒的DNA，其插入進一個來自單純性皰疹病毒的DNA，該新DNA就是異源的DNA，相對于來自該單純性皰疹病毒的 DNA?！碍h(huán)-指結(jié)構(gòu)域(RING finger domain) ” 是一個鋅-指多肽(zinc finger polyp印tide)，其包含了一個連接了兩個鋅陽離子的Cys3HiSCyS4的氨基酸模體。字首“環(huán) (RING) ”代表了實質(zhì)上很有趣的新型基因(Really Interesting New Gene)。在此所述的有關(guān)一個異源基因或編碼序列被整合入一個病毒DNA中的“整合”是指該異源基因或編碼序列被功能性包含入該DNA中，從而當(dāng)該病毒DNA被此病毒感染的宿主細(xì)胞表達時，該異源基因或編碼序列也被表達。為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員所知，一個病毒DNA的“非必要(non-essential)”基因或區(qū)域是指DNA的一個區(qū)域，當(dāng)一個DNA序列插入該區(qū)域時，并不阻止該病毒感染宿主細(xì)胞的能力和在其中復(fù)制的能力。水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白和編碼其的核酸序列是本領(lǐng)域所熟知的，例如糖蛋白 H、B和E(分別為gH、gB和gE)，例如參考Maresova等人出版的2005，J.Virol. 79(2) 997-1007，其全文被并入以作參考。水痘帶狀皰疹病毒的中和表位是本領(lǐng)域所熟知的，例如參考Akahori等人出版的病毒學(xué)雜志(Journal of Virology), February 2009，p. 2020-2024, Vol. 83, No. 4 ；禾口 Forghani 等人出版的臨床微生物學(xué)雜志(J Clin Microbiol). 1990 November ；28 (11) 2500-2506，每個出版物全文被并入以作參考。感染細(xì)胞多肽O(ICPO) [Infected Cell Polypeptide 0 (ICPO)]是一種蛋白質(zhì)， 由皰疹病毒DNA[參見美國國家生物技術(shù)信息中心的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號NP_0446011(NCBI protein database accession numberNP_044601. 1)，在此全部并入以作參考]編碼。0RF61 是開放閱讀框61蛋白(水痘帶狀皰疹病毒，varicella zoster virus)[參見美國國家生物技術(shù)信息中心的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號NP_040183. 1(NCBI protein database accession number NP_040183. 1)，在此全部并入以作參考]。在此所述的免疫是提供病毒抗原(例如在一種疫苗中)到受試者，例如人的免疫系統(tǒng)中，此舉激發(fā)了免疫應(yīng)答并在與該病毒抗原后續(xù)接觸時，引發(fā)防御性的體液和/或細(xì)胞免疫。用于病毒疫苗的組合物是本領(lǐng)域所知的，并被記載在Burke等人的2003年9月9 日的美國專利U. S. 6，616，931，Loudon等人的2001年7月10日的美國專利U. S. 6，258，362， Chen等人的2004年9月7日的美國專利U. S. 6，787，351中，這些出版物被全文并入以作參考。在此公開的病毒載體疫苗能以一種藥學(xué)上可接受的溶劑來施用，例如但不限于無菌鹽水或無菌緩沖鹽水，用或者不用本領(lǐng)域所知的疫苗佐劑一起來施用?！笆┯?(Administering)，，一種疫苗可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員所知的各種方法和遞送系統(tǒng)中的任意一種來實現(xiàn)或操作。該病毒疫苗可以采用本領(lǐng)域所知的方法施用，包括但不限于注射、 局部黏膜/鼻黏膜給藥。在此所述的一種“藥用載體”是一種藥學(xué)上可接受溶劑、懸浮劑或媒介，用于遞送即時病毒載體到動物或人。該載體可以是液體、氣溶膠、凝膠或固體；可以由考慮的施用計劃方式來選擇。在一個實施例中，該藥用載體是一種無菌的藥學(xué)可接受溶劑。疫苗生產(chǎn)和儲存方法為本領(lǐng)域所知，并被描述在W0/2006/012092中，其全文被并于此以作參考。正如其所描述的，用于例如麻疹(measles)、風(fēng)疹(rubella)和流行性腮腺炎(mumps)病毒的活疫苗的常用穩(wěn)定劑通常包括一種或多種糖類、氨基酸、糖醇、明膠和明膠衍生物，以穩(wěn)定病毒，并在很多情況下保持病毒在濃縮步驟中免于變性。在此描述的重組病毒可以被配制成一種疫苗，通過使用一種穩(wěn)定劑或其它包含天然或重組血清蛋白添加劑來達成目的)。美國專禾Ij U. S. Nos. 6，210，683 ；5，728，386，6，051，238，6，039，958 和 6，258，362也包含了穩(wěn)定劑的詳細(xì)說明和更加溫和地處理活病毒疫苗的方法。這些公開內(nèi)容，尤其是描繪穩(wěn)定劑組合物和穩(wěn)定方法的這些部分特地被完整并入本文。在與穩(wěn)定劑一起制備后，該疫苗可以被儲存為一種例如凍干疫苗、凍干混合疫苗、液體疫苗或液體混合疫苗。制備這些疫苗的方法是已知的。典型地，凍干疫苗可通過凍干在小瓶或安剖瓶中的具有3_30ml體積的疫苗制備，其被緊緊地密封和儲存在5攝氏度或更低溫度下。儲存的疫苗制品通常按照說明書使用，其作為產(chǎn)品內(nèi)附物或是貼在小瓶或其它容器上的標(biāo)簽。在多數(shù)情況下，凍干疫苗在使用前通過加入無菌蒸餾水重構(gòu)，得到的溶液通過皮下注射按照一定量接種，例如每劑0. 5ml。這種疫苗也可以通過口服或鼻腔施用。一種重組脫氧核糖核酸，其包含一種具有整合的異源DNA的人單純性皰疹病毒 (HSV)的脫氧核糖核酸DNA，其中該異源DNA編碼包含一種環(huán)_指結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個實施例中，該HSV DNA是基因組DNA并且該異源DNA被整合入該HSV DNA 以替代編碼一種HSV感染的細(xì)胞多肽0 (HSV Infected Cell Polypeptide 0，ICP0)的基因組HSV DNA的一部分。在一個實施例中，該異源DNA被插入進該基因組HSV DNA的一個HSV ICPO 5'的非翻譯域(UTR)和一個HSV ICPO 3'的非翻譯域(UTR)之間。在一個實施例中，該插入的異源DNA是在該ICPO啟動子和3' UTR控制下。在一個實施例中，包含了該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該多肽具有水痘帶狀皰疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中， 包含該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該異源多肽具有一種馬皰疹病毒、牛皰疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，該HSV DNA是一個HSV基因組。在一個實施例中，該重組脫氧核糖核酸還包含一種編碼一種糖蛋白的異源DNA。在一個實施例中，該重組脫氧核糖核酸還包含多達8個異源DNA，且每個DNA編碼一個不同的糖蛋白。在一個實施例中，該糖蛋白具有一種水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，該糖蛋白包含一個水痘帶狀皰疹病毒的中和表位。在一個實施例中，由該重組脫氧核糖核酸編碼的多肽未降解哺乳動物類的前骨髓細(xì)胞癌(mammalian promyelocytic leukemia，PML)蛋白。在一個實施例中，編碼該多肽的該異源DNA被整合，從而當(dāng)該重組脫氧核糖核酸被整合入一種合適的宿主細(xì)胞的基因組時，該多肽被表達。在一個實施例中，編碼該糖蛋白的該異源DNA被插入進該HSV DNA的一個非必要基因或區(qū)域中。一種包含編碼一種帶有環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的多肽的異源DNA的重組人單純性皰疹病毒 (HSV)，該異源DNA (a)被插入進該HSV基因組的一個非必要區(qū)域中，以及(b)在引入該重組 HSV的宿主細(xì)胞中被表達。在一個實施例中，該異源DNA被插入進該HSV基因組以替代編碼一種HSV感染的細(xì)胞多肽O(ICPO)的HSV基因組的一部分。在一個實施例中，該異源DNA被插入進該HSV 基因組的一個HSV ICPO 5'的非翻譯域(UTR)和一個HSV ICPO 3'的非翻譯域(UTR)之間。在一個實施例中，包含了該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該多肽具有水痘帶狀皰疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，包含該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該多肽具有一種馬皰疹病毒、牛皰疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，該重組HSV還包含一種編碼一種糖蛋白的異源DNA，被插入進該HSV基因組的一個非必要域。在一個實施例中，一種水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，該糖蛋白包含一個水痘帶狀皰疹病毒的中和表位。在一個實施例中，編碼該糖蛋白的該異源DNA被插入進該HSV基因組的一個非必要基因或域中。在一個實施例中，沒有由該重組HSV基因組編碼的多肽降解PML。在一個實施例中，該重組HSV包含多達8個不同的異源DNA，且每個DNA編碼一個不同的水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白。在一個實施例中，該重組病毒是通過本領(lǐng)域已知的方法減毒的。一種疫苗，該疫苗包含⑴一種藥學(xué)可接受載體和⑵一種重組病毒，該重組病毒包含一種包含人單純性皰疹病毒(HSV)基因組的重組脫氧核糖核酸，該人單純性皰疹病毒 (HSV)基因組(a)具有一段編碼包含一個環(huán)-指結(jié)構(gòu)域多肽的整合的異源DNA以及(b)具有一段或多段整合的異源DNA，其中每段DNA編碼一種糖蛋白。在一個實施例中，該異源DNA被整合入該HSV基因組以替代編碼一種HSV感染的細(xì)胞多肽O (ICPO)的HSV DNA的一部分。在一個實施例中，該異源DNA被插入進該HSV基因組的一個HSV ICPO 5'的非翻譯域(UTR)和一個HSV ICPO 3'的非翻譯域(UTR)之間。 在一個實施例中，包含了一個環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該異源多肽具有水痘帶狀皰疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，包含一個環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該異源多肽具有一種馬皰疹病毒(EHV)、牛皰疹病毒(BHV)或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，該糖蛋白具有一種水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。在一個實施例中，該糖蛋白包含一個水痘帶狀皰疹病毒的中和表位。在一個實施例中，編碼該糖蛋白的異源DNAs和編碼包含該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的多肽的該異源DNA都被插入進該HSV基因組的非必要基因或區(qū)域中。在一個實施例中，該重組病毒是通過本領(lǐng)域已知的方法減毒的。一種使受試者抗水痘帶狀皰疹病毒感染的免疫方法，該方法包含給予受試者一定量即時疫苗，以有效引起受試者對該水痘帶狀皰疹病毒的免疫應(yīng)答，從而使受試者免疫。一種用于預(yù)防一種病毒感染的組合物的制備方法，該方法包括將即時(instant) 重組病毒與一種活疫苗穩(wěn)定劑結(jié)合，從而制備該組合物。在此描述方法的一個實施例中，受試者是哺乳動物類。在一個實施例中，受試者是人類。在該方法的一個實施例中，宿主細(xì)胞是哺乳動物類的或衍生自一種哺乳動物的。在一個實施例中，宿主細(xì)胞來自人類。在此描述的各種元素的組合都涵蓋在本發(fā)明的范圍中。通過參考以下的實驗細(xì)節(jié)，本發(fā)明可被更好地理解；但本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員可以容易地了解到，具體的實驗細(xì)節(jié)只是為了闡明在隨后的權(quán)利要求書中更完整描述的本發(fā)明。實驗細(xì)節(jié)以下公開的研究表明在水痘帶狀皰疹病毒中的HSV ICPO所對應(yīng)的直系同源基因 (ortholog) 0RF61，不會降解PML，從而不會干擾宿主的先天免疫。在此公開了一種重組HSV 的構(gòu)建，其中用于α基因ICPO的編碼序列被編碼0RF61p的序列替代。結(jié)果I細(xì)胞核結(jié)構(gòu)域10 (Nuclear domains 10，NDlOs)，也被稱為 PML 核體(nuclear bodies)和PML致癌結(jié)構(gòu)域(oncogenic domains)，它形成于細(xì)胞核的染色體內(nèi)部空間，是細(xì)胞蛋白的有活力的大分子包含物(dynamic macromolecular inclusionsM2，65)。取決于細(xì)胞種類和所處的細(xì)胞周期的階段，這些實體(bodies)的尺寸和頻率范圍分別在0.2 到lum，每個細(xì)胞中從2到30(2，17，62)。在這些位點聚集的細(xì)胞蛋白分為兩組一組為永久成分的蛋白質(zhì)，例如PML(前骨髓細(xì)胞癌蛋白質(zhì)promyelocytic leukemia protein)、 SplOO (IOOkDa的斑點蛋白)、Daxx、SUMO—I和青春綜合癥解旋酶(Bloom syndromehelicase)BLM;另一組為僅在特殊條件下(例如DNA修復(fù)機)或在過度表達時(例如 BRCA1)與NDlOs結(jié)合的蛋白質(zhì)(70)。DNA病毒基因組在其復(fù)制周期的初始階段與NDlO組分結(jié)合。新形成的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制位點集中在那些通常處于NDlOs內(nèi)部的蛋白質(zhì)附近(61)。首次提出病毒復(fù)制會影響NDlOs 是由于證實了 PML著色在感染單純性皰疹病毒HSV后即消失06)。隨之，皰疹病毒、腺病毒、 猿猴病毒40 (simian virus 40，SV40)和乳頭狀瘤病毒的親代基因組(parental genome) 也顯示了與 NDlOs 結(jié)合性(10，14，32，33，35，47)。對HSV和NDlOs組分的拮抗(antagonistic)關(guān)系已進行了深入的研究。ICPO病毒蛋白的表達對于細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的毀損是必要和充分的(18，45，46)。ICPO是一種含有C3HC4 環(huán)指的核內(nèi)磷蛋白，其具有IlOkDa的表觀分子量(56)，其作為病毒和細(xì)胞基因的混雜激活劑(promiscuous activator) (12，23，59)。缺乏ICPO基因的病毒變異體具有增強的粒與蝕斑形成單位(plaque forming unit,pfu)的比例，實質(zhì)上較低的收率和降低的α基因的表達水平(13，64)。ICPO也發(fā)揮Ε3泛素化連接酶的功能，以靶向用于降解蛋白酶的不斷新增的的宿主蛋白，包括NDlO實體(NDlObodies)組分例如PML和SplOO的SUMO-I修飾形式 (8，15，18,26,41,53)。未能表達ICPO的HSV變異體在其能力上存在缺陷，而不能修飾或降解NDlO組分 (46)。PML和SplOO的消耗加速了病毒基因的表達，并增加了 HSVICP0缺陷病毒的蝕斑形成效率，但其對野生型病毒無作用。這些數(shù)據(jù)表明了 PML和SplOO是抗-HSV固有防御機制中的成分，該機制由ICPO的Ε3連接酶活性抵消以確保病毒的有效復(fù)制和生長(21，22)。水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)是一種常見的人病原體， 其與HSV —起被分類為alpha皰疹病毒(alphaherpesviruses)。VZV編碼一種ICPO的直向同源物(0RF61p) 09，57)，其類似于ICP0，轉(zhuǎn)錄時活化病毒啟動子以及增強病毒 DNA的傳染性(49，50)。重要的是，0RF61p包含了一個環(huán)指結(jié)構(gòu)域，與ICPO的反式激活 (transactivation)和NDlO解離和降解活性所必要的區(qū)域同源。先前已表明由HSV的ICPO表達對于克服BAG3 ( 一種刺激病毒基因表達和蛋白積聚的宿主陪伴蛋白)的消耗是必須的(38)。盡管0RF61p被認(rèn)為功能與ICPO類似09)，VZV 受BAG3消耗的影響(37)，這就暗示了 ICPO和0RF61獨自地演化了以提供用于病毒復(fù)制的不同功能。該報道證明了 0RF61p和其它VZV編碼的蛋白質(zhì)不以與HSV感染的細(xì)胞中的ICPO 相同的方式來降解NDlO組分。還研究了在VZV感染期間，PML,Sp 100和Daxx的作用，這篇報道強調(diào)了這兩種相關(guān)的alpha皰疹病毒之間存在的關(guān)鍵區(qū)別。材料和方法哺乳動物類細(xì)胞.人黑色素瘤(melanoma, MeWo)、siBAG3(37)、 siPML(38)和細(xì)胞按照先前所描述獲取(37)。為得到表達靶向SplOO和Daxx mRNAs 的siRNAs的穩(wěn)定細(xì)胞系，Meffo細(xì)胞被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，并在包含200ug/ml和隨后500ug/ ml勻霉素(hygromycin)生長媒介中選取。DNA 轉(zhuǎn)化。DNAs 通過 Fugene HD[Roche, Indianapolis, IN]被轉(zhuǎn)化入合適的細(xì)胞系。藥物處理。干擾素α 購買自 PBL Biomedical [Piscataway, NJ]公司。病毒。[i] VZV. Jones，一種野生型臨床分離體，其按照Q4)描述的一樣被增殖和滴定。無細(xì)胞的病毒按照(36，58)描述一樣的制備.[ii]逆轉(zhuǎn)錄病毒.逆轉(zhuǎn)錄病毒通過將 細(xì)胞與前病毒載體 pCK-Super. retro, hygro (38)，pCK-siSplOO 或 pCK-siDaxx 和 pgag-polgpt(44)和 pHCMV_G(75) —起進行瞬時共轉(zhuǎn)化(transient co-transformation) 構(gòu)建得到。[ii]腺病毒.先前已描述過腺病毒 Adempty，AdICPO 和 Ad0RF61 (74，76)。病毒生長分析。[i]菌斑分析.用病毒存貨(virus stocks)的10倍系列稀釋物來感染MeWo、siPML、SiSplOO或SiDaxx細(xì)胞；感染細(xì)胞被固化，著色和計數(shù)菌斑。[ii]生長曲線.在MeWo、siPML、siSplOO或siDaxx細(xì)胞感染后，與VZV相關(guān)的細(xì)胞滴度(titer) 通過將感染的細(xì)胞與未感染的MeWo細(xì)胞混合在一起，并在固化和著色后計數(shù)得到的菌斑來測量得到。質(zhì)粒構(gòu)建。[i] siRNA質(zhì)粒。先前描述的靶向SplOO和Daxx mRNA的siRNA寡核苷酸(22,68)被修飾用于克隆入 pCK-super. retro, hygro (38)。為產(chǎn)生 pCK-siSplOO 和 pCK-siDaxx，退火的寡核苷酸對(oligo pairs) siSpl00_上游的(siSpl00_upper) 5' -GA TCCCCGTGAGCCTGTGATCAATAATTCAAGAGATTATTGATCACAGGCTCACTTTTTA-3 ‘和 siSpl00_ 下游的(siSpl00_lower) 5' -AGCTTAAAAAGTGAGCCTGTGATCAATAATCTCTTGAATTATTGATCACAGGCT CACGGG 或 siDaxx_ 上游的5 ‘ -GATCCCCGGAGTTGGATCTCTCAGAATTCAAGAGATTCTGAGAGATCCAA CTCCTTTTTA-3 ‘ siDaxx_ 下游的5 ‘ -AGCTTMAAAGGAGTTGGATCTCTCAGAATCTCTTGMTTCTGAG AGATCCAACTCCGGG-3 ‘被連接入 Bglll/Hindlll 裂解的 pCK-super. retro, hygro (38)。所有引物從Operon Biotechnologies [Huntsville, AL]公司獲得，以及所有載體插入物都通過DNA測序驗證。抗體。描述了0RF29p 的氨基酸(amino acids,aa) 1086 到 1201 和 0RF63p 的氨基酸H65的兔多克隆抗體G3)。描述了 ICPO的多克隆抗體00)。單克隆ICPO和0RF62p抗體購自 Rumbaugh-Goodwin Wi % [Plantation, FL]。 1 * 0RF61p 136-248 M ■ @!白勺 GST-融合蛋白的多克隆抗體在兔體中培育，并采用先前描述的親和色譜法(affinity chromatography)進行純化(37)。PML、GAPDH和微管蛋白的單克隆抗體和Daxx的多克隆抗體從 Santa Cruz Biotechnology [Santa Cruz，CA]公司獲得。PML 和 SplOO 的多克隆抗體購自Chemicon[Temecula，CA]公司。STAT1，STAT2和磷酸化STATl的抗體從 Abeam[Cambridge,MA]公司獲得。磷酸化 STAT2 抗體購自 SantaCruz Biotechnology 公司。Alexa Fluor 488-耦聯(lián)物(Alexa Fluor 488-conjugated)抗-鼠(anti-mouse) 禾口 Alexa Fluor 546—華禹聯(lián)物抗一兔(anti-rabbit)抗體從 Molecular Probes [Carlsbad, CA]公司獲得。耦聯(lián)到用于免疫印跡的辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)的山羊抗-兔和抗-鼠抗體從KPL[feiitherburg，MD]公司獲得。間接免疫熒光顯微鏡法。按照先前描述的，在玻璃蓋玻片上的細(xì)胞被固化，和用抗體和赫斯特染劑著色(37)。所有樣品都通過kiss Axiovert 200M倒置顯微鏡法 [Carl Zeiss Microimaging hc，Thornwood，NY]成像以及使用采用 Openlab 5 的軟件 [Improvision, Lexington, MA] ^ Hamamatsu C4742-80-12AG ^ 5 CCD l/l [Hamamatsu Photonics, Hamamatsu-City, Japan]獲取圖像.采用Openlab 5對圖像進行去褶積并在 Photoshop CS3[Adobe Systems, San Jose，CA]中進行裝配。
SDS-PAGE和western免疫印跡。感染的和生物化學(xué)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被用冷的磷酸緩沖液(PBS)洗滌兩次，細(xì)胞溶解在1. SDS樣品緩沖液中[75mM TrisHCl pH 6. 8,150mM DTT, 3% SDS,0. 15%溴酚藍，15%甘油]并煮沸，蛋白質(zhì)用SDS-PAGE進行分析(39)。在western 免疫印跡前將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。在含5%脫脂牛奶的PBST中封閉薄膜之后，固定的蛋白質(zhì)與合適的抗體在含脫脂牛奶的PBST中進行反應(yīng)。薄膜用PBST洗滌三次， 每次5分鐘，用偶聯(lián)到辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)的抗-兔和抗-鼠抗體培養(yǎng)；然后用PBST洗滌三次，每次5分鐘，再用PBS洗滌兩次。通過加入LumiGLO底物[KPL] 曝光X射線膠卷抗體被可視化。當(dāng)使用STAT蛋白的抗體時，封閉和抗體培養(yǎng)在添加了 50mM NaF, ImM Na3VOjP 3% BSA的PBST中進行。序列比對。0RF61p(NP_040183. 1)禾Π ICPO (ΝΡ_044601. 1)的氨基酸序列采用 Gonnet矩陣，空位開放罰分10. 0和空位延展罰分0. 1與MacVector ver 10. O [MacVector Inc，Cary，NC]進行比對。ICPO和0RF6Ip之間的序列相似性。先前的報道提出alpha皰疹病毒直向同源物， ICPO和0RF61P共同享有幾個生物學(xué)特征，包括它們活化基因表達和增強病毒DNA感染性的能力09，50，57)。然而，也報道了不同于ICPO，0RF61p在病毒感染期并不能替代BAG3損耗，這就揭示了這些蛋白在天然環(huán)境下并不發(fā)揮相同的功能(38)。ICPO的多功能被比對在其特殊的結(jié)構(gòu)域上(16)。這就導(dǎo)出這樣的假設(shè)，在這些蛋白質(zhì)之間進行氨基酸序列比對可能提供對它們差異的理解。ICPO和0RF61p的氨基酸序列取自NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(編號分別為NP_044601. 1和NP_040183. 1)比對(圖1).除去一些保守核苷酸序列(9)，發(fā)現(xiàn)它們之間的總的氨基酸保守還是較少(在氨基酸水平上10%的相似性).然而，兩者在接近 N-末端處都包含了 一個 C3HC4 環(huán)指[C-X2-C-X (9-39) -C-X (1-3) -H-X (2-3) -C-X2-C-X (4-48) -C-X2-C] (3)。兩種蛋白質(zhì)之間一個顯著差異在于在0RF61p序列中，ICPOC-末端(標(biāo)記為藍色)的缺失。重要的是，這個區(qū)域?qū)τ趯CPO靶向到NDlO體并隨后降解其組分是必要的(16，18，45)。因此，進行了有關(guān)0RF61p在介導(dǎo)PML和SplOO降解中的能力的研究。0RF61p不能有效地降解PML和SplOO。在用編碼這兩種直向同源物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的MeWo細(xì)胞中，通過免疫熒光顯微鏡法監(jiān)測了 0RF61p和ICPO對于PML和SplOO定位的作用。在模擬處理的細(xì)胞中，都出現(xiàn)了 PML和SplOO的點狀核體(圖2A和2D) (2)。正如先前報道，ICPO的表達導(dǎo)致了兩種細(xì)胞蛋白的消失(圖2B和2E)(46)。然而，細(xì)胞表達0RF61p表現(xiàn)了一個不同的表型。對照模擬處理的細(xì)胞，盡管PML包含體(PML containing bodies)更分散以及更小，但該蛋白質(zhì)還是被檢測到，主要為點狀的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(圖2C)。0RF61p在SplOO上的作用看起來更接近ICPO的作用，因為SplOO核體的著色從表達0RF61p的大多數(shù)細(xì)胞中消失了(Fig. 2F)。 為了直接分析病毒產(chǎn)品對PML和SplOO豐度的影響，Meffo細(xì)胞被模擬處理或用不表達皰疹病毒蛋白(Adempty)，ICPO (AdICPO)或0RF61p (Ad0RF61)的復(fù)制缺陷腺病毒感染，病毒和細(xì)胞蛋白的水平通過western免疫印跡法監(jiān)測(圖3)。采用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection) (MOI) 5來確保每個細(xì)胞都被感染并表達感興趣的蛋白質(zhì)。在模擬感染的細(xì)胞中或用Adempty感染的細(xì)胞中，PML顯示為具有不同分子量的一系列條帶。這些條帶代表了 PML的剪切和翻譯后(post-translationally)修飾形式(54)。如先前描述，檢測到Sp 100 (Sp 100A，Sp100A-SUM0和Spl00-HMG)的三種主要形式。ICPO的表達導(dǎo)致了多種PML 異構(gòu)體的完全消失和遷移較慢品種的SplOO的優(yōu)選缺失(圖3) (8)。相反，0RF61p的表達對由此分析檢測到的PML的豐度和種類沒有影響。0RF61p —致地降低SplOO水平，盡管并不如ICPO那樣有效(圖幻。平行的感染細(xì)胞通過免疫熒光分析證實了所有的細(xì)胞都被感染和表達ICPO或0RF61p(數(shù)據(jù)沒有給出)。在感染了 Adempty的細(xì)胞中的PML被重新組織為延伸軌跡(elongated tracks)，可能是應(yīng)答腺病毒E4 0RF3的表達(6)。由AdICPO的 ICPO的表達導(dǎo)致缺失PML，而在Ad0RF61感染細(xì)胞中的PML著色與Adempty樣品相同(數(shù)據(jù)沒有給出)。這個觀察結(jié)果進一步將ICPO和0RF61P區(qū)分開來。將免疫熒光數(shù)據(jù)和western免疫印跡分析結(jié)合起來，證明了盡管0RF61p改變NDlO 體的完整性和著色圖案，其表達并不導(dǎo)致PML的消失。然而，0RF61p的表達但影響SplOO的水平。0RF6Ip靶向NDlOs并不引起PML的降解。如上述提到的，ICPO的C-末端，其對于靶向NDlOs和PML的有效降解是必要的，從0RF61p中缺失了(圖1)。添加這個區(qū)域到β -半乳糖苷酶(β-galactosidase)導(dǎo)致其與PML的部分共定位(co-localization) (18)。為了檢測0RF61p未能降低PML水平是否是因為它缺失了該區(qū)域而不能靶向NDlOs，創(chuàng)造了 0RF61p與ICPO的C-末端的188個氨基酸的翻譯融合物(圖4A)。得到的蛋白質(zhì)應(yīng)該包含對于PML靶向和降解(一個同源的環(huán)指和該靶向區(qū)域的C-末端)所必要的ICPO的所有區(qū)域(16)。MeWo細(xì)胞用模擬處理或者用表達ICP0、0RF61p或該融合蛋白的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化。細(xì)胞溶解產(chǎn)物的western免疫印跡分析揭示了所有的蛋白產(chǎn)物在相似水平上聚集，以及ICPO 的C-末端域的添加并不改變0RF61p的穩(wěn)定性(圖4B)。隨后監(jiān)測了這些蛋白和PML的定位和豐度。如以上描述，ICPO的表達導(dǎo)致PML著色的消失，而0RF61p的表達導(dǎo)致了在其細(xì)胞內(nèi)的著色圖案上的微小變化(圖2B和2C)。該融合蛋白具有一個不同于ICPO或0RF61p 的亞細(xì)胞(subcellular)定位模式。在大多數(shù)細(xì)胞中(大約80-90% )，該融合蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中(圖4D)。與在融合了這個域的該半乳糖苷酶中所觀察到的類似(18)，細(xì)胞質(zhì)中(cytoplasmic)PML包含體的一個次級種群(subpopulation)與該融合蛋白共-定位 (co-localized)。在10-20%的該核蛋白質(zhì)種群中，核染色質(zhì)是加邊緣的(marginated)，以及該融合蛋白填充在其余的細(xì)胞核空間(圖4E)。然而在這兩種情況下，盡管PML分布改變了，但它還是被檢測到了。因此，0RF61p未能降低PML的分子內(nèi)水平是該蛋白質(zhì)的內(nèi)在性質(zhì)，并不是因為0RF61p缺失了一個NDlO靶向區(qū)域。在VZV感染期間PML和SplOO的分布和豐度。0RF61p單獨并不有效地降解PML和 SplOO (圖2和3)。為了回答這個問題，即在感染期其它VZV蛋白是否影響這些蛋白的分布，Meffo細(xì)胞用HSV或無細(xì)胞的VZV進行感染，以及通過免疫熒光顯微鏡法監(jiān)測病毒和細(xì)胞蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布。如先前報道，在感染了 HSV的細(xì)胞中，用于PML和SplOO的著色消失了(圖5A和6A)。在初期分析期間，0RF61p的著色是用于病毒感染細(xì)胞的標(biāo)記(marker)。 在表達0RF61p的細(xì)胞中，PML包含體在尺寸上變得更小了，以及與未感染的細(xì)胞對照時變得暗了。然而，與在感染了 HSV的細(xì)胞中不同，在VZV感染的細(xì)胞中PML還是被檢測到了 (圖5B)。不過，由于還沒有完全理解VZV編碼蛋白的表達動力學(xué)，很可能是在0RF61p在感染期導(dǎo)致PML的缺失后，其它蛋白表達了，0RF62p被當(dāng)做用于感染細(xì)胞的另一個可選擇標(biāo)記。這個蛋白質(zhì)最初定位在感染細(xì)胞的細(xì)胞核上；然而，它隨后磷酸化了并在感染后期轉(zhuǎn)位到了細(xì)胞質(zhì)里(11)。因此，作為感染細(xì)胞的標(biāo)記以及作為病毒復(fù)制周期階段的指示劑，其細(xì)胞內(nèi)的定位模式是有用的。在0RF62p處于細(xì)胞核內(nèi)的那些細(xì)胞中，PML和SplOO 二者都顯現(xiàn)為球形結(jié)構(gòu)；這就非常類似于在非感染細(xì)胞中所觀察到的(圖5C和6B)。在感染后的后期時間點，感染細(xì)胞用用于糖蛋白gE著色來監(jiān)測。在VZV感染后期，NDlO組分的定位與在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中所觀察到的相似(圖幻。特別地，PML體仍然存在，盡管其豐度變得降低了以及其著色強度也比在未感染細(xì)胞中所觀察到的更弱(圖5D)。相反，沒有觀察到SplOO的特征點狀著色(圖6C)。為了進一步研究在VZV感染期的NDlO組分的去向(fate)并定量地測量其豐度， Meffo細(xì)胞用HSV或無細(xì)胞VZV感染，以及通過western免疫印跡法監(jiān)測病毒和細(xì)胞蛋白的水平。如先前描述，HSV感染導(dǎo)致了 PML和SplOO多種異構(gòu)體(multiple isoforms)的快速降解(圖7A) (8)。對照HSV，VZV無細(xì)胞滴度低且病毒復(fù)制動力學(xué)是非常慢的。因此，為了分析病毒感染對這些蛋白質(zhì)的影響，在感染后幾天里跟蹤了其水平。與在HSV感染期所發(fā)生的形成對比，在觀察階段PML和SplOO 二者的水平都增加了(圖7A)。PML和SplOO增加率都顯著地高于微管蛋白的增加率，表明這兩種蛋白在豐度上的增加并不是細(xì)胞生長和復(fù)制的結(jié)果。為了證明此論點，監(jiān)測了 Daxx(NDK)的另一個構(gòu)成成分)細(xì)胞內(nèi)水平。與PML 和SplOO不同，在觀察期間Daxx的細(xì)胞內(nèi)水平幾乎保持不變(圖7A)。因為PML和SplOO被干擾素誘導(dǎo)05，60)，這個實驗嘗試回答這個問題，即在MeWo 細(xì)胞中這些蛋白質(zhì)的表達是否對干擾素敏感，以及干擾素是否對于Daxx有影響。MeWo細(xì)胞被兩種不同濃度的干擾素α處理。為了證明干擾素通路在MeWo細(xì)胞中被激發(fā)，STATU STAT2水平以及其活化的磷酸化形式被借助western免疫印跡法監(jiān)測(圖7B)。由這些信號分子豐度和磷酸化所證明，干擾素響應(yīng)在MeWo細(xì)胞中是激活的。測量了三種NDlO組分的豐度。盡管PML和SplOO表達被誘導(dǎo)了，干擾素處理的Daxx水平保持不變(圖7B)。這些實驗揭示了在VZV感染期，增加的PML和SplOO水平是由于回應(yīng)由感染細(xì)胞分泌的干擾素的誘導(dǎo)以及VZV未能以降解為目的靶向這些蛋白質(zhì)而導(dǎo)致。在VZV感染期間PML、Spl00和Daxx的功能。ICPO指向PML和SplOO的降解對于 HSV復(fù)制是有利的(21，22)。Daxx限制由HCMV和腺病毒的感染(34,68,72) 0因為VZV并不有效地降低NDlO組分的水平，這個實驗嘗試了回答這個問題，即這些蛋白質(zhì)的向下-調(diào)控是否改變VZV復(fù)制的動力學(xué)和收率。表達不帶靶向、靶向PML、SplOO或Daxx mRNAs的siRNAs重組逆轉(zhuǎn)錄病毒被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)MeWo細(xì)胞以及產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系(分別為sicontrol、siPML、siSplOO和siDaxx)。通過western免疫印跡法(圖8A)和免疫熒光顯微鏡法(數(shù)據(jù)沒有示出)監(jiān)測了在這些細(xì)胞系中的這些靶蛋白的豐度和定位。如先前報道(21，22)，PML的消耗導(dǎo)致了 NDlO體完整性的缺失，SplOO表達模式的變化，但是在Daxx水平上無明顯變化。相反，SplOO或Daxx的向下-調(diào)控沒有改變其它的NDlO組分的水平和分布。之后，這些細(xì)胞系被用于測量VZV的菌斑形成效率。匯合的單層(Confluent monolayers)用無細(xì)胞病毒存貨(stocks)的系列稀釋物來感染。感染后幾天，單層被固化和著色，菌斑被計數(shù)。在每個細(xì)胞系形成的菌斑數(shù)目被標(biāo)準(zhǔn)化為在對照細(xì)胞中形成的數(shù)目。 這個結(jié)果揭示了當(dāng)PML水平下降，增加菌斑的數(shù)目在大約2.5倍左右(t(val) =0. 0017)(圖8B)。這個結(jié)果模擬了在HSV的一個ICP0_變異體中所觀察到的02)。相反，SplOO的向下-調(diào)控導(dǎo)致較小的(1.2倍)，雖是一慣的，在VZV滴度上的增加(t(val) =0.031)。Daxx 的消耗沒有任何影響(圖8B)。為了進一步研究NDlO組分對VZV生長的作用，siRNA細(xì)胞系用無細(xì)胞病毒感染， 并隨時間監(jiān)測病毒蛋白的聚集(圖8C)。每個消耗的細(xì)胞系中的病毒蛋白所對應(yīng)的帶強度被標(biāo)準(zhǔn)化為在相同時間點對照細(xì)胞中所呈現(xiàn)的。0RF63p[—種立早蛋白(immediate early protein) ]、0RF29p [—種早期蛋白(early protein)]的細(xì)胞內(nèi)水平在 siPML 和 siDaxx 細(xì)胞感染后早期時間點增加了。然而，在后期時間，其水平與在對照細(xì)胞中觀察到的類似。類似菌斑形成效率結(jié)果，SplOO的消耗僅僅對病毒蛋白水平產(chǎn)生很小的影響。為了研究感染中心的形成，siRNA細(xì)胞系用無細(xì)胞VZV感染，在感染后的不同時間測量了細(xì)胞關(guān)聯(lián)(cell-associated)病毒滴度。與western分析一致(圖8C)，在達到與在 sicontrol細(xì)胞中觀察到的類似穩(wěn)定水平(plateau)前，感染早期在siPML和siDaxx細(xì)胞中形成的感染中心的數(shù)目增加了(圖8D和8E)。SplOO的消耗對于感染中心產(chǎn)率的影響很小(圖8D和8E)。在siPML細(xì)胞感染期間，細(xì)胞病理效應(yīng)(Cytopathic effect, CPE)更顯著，并且在早于其它細(xì)胞系大約M小時菌斑即可見。相反，相比所有其它細(xì)胞系，在siDaxx 單層中的菌斑尺寸是相當(dāng)小的，并且病毒誘導(dǎo)的CPE是最小的，甚至是在感染后期。此外， 盡管該蛋白積聚和感染中心分析證明了加速的病毒復(fù)制，類似于在siPML細(xì)胞中所發(fā)生的 (圖8C-E)，令人驚奇的是，在siDaxx中的菌斑形成效率(plaquing efficiency)與在對照細(xì)胞中的相同(圖8B)。為了探測這些差異存在的基礎(chǔ)，在蓋玻片上生長的siRNA細(xì)胞被感染，并且在感染后2和3天(at 2and 3dpi)，細(xì)胞被固化，立早蛋白(0RF63p)和晚期糖蛋白(gE)的表達通過免疫熒光顯微鏡法進行監(jiān)測(圖9)。在感染后2天對照細(xì)胞的核形成了特征的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)表明了細(xì)胞融合和有效的病毒擴張(37，71)。在SplOO消耗細(xì)胞中，感染病灶(Infected foci)與那些在sicontrol細(xì)胞中的尺寸相似。相反，VZV在缺乏 PML或Daxx細(xì)胞中擴展更快，這被在感染后2天(at 2dpi)更大的病灶形成所證實的。然而，不像siPML細(xì)胞，其發(fā)生了廣泛的融合；而siDaxx細(xì)胞感染擴展不伴隨明顯的CPE。此外在感染后2天(at 2dpi)，細(xì)胞僅僅從siPML單層分離，這導(dǎo)致了評為菌斑的洞。在感染后3天(at 3dpi)(圖9)，CPE在來自除了 siDaxx的所有細(xì)胞系的單層都是明顯的。廣泛的細(xì)胞融合被檢測到，正如被多核體形成和病毒蛋白的同質(zhì)著色模式所證明。相對其它的細(xì)胞系，在siDaxx細(xì)胞中的感染擴展是不同的。盡管VZV擴展以感染相鄰的細(xì)胞，檢測到了獨自完好的感染細(xì)胞且無證據(jù)顯示細(xì)胞融合。這種形態(tài)學(xué)與sicontrol 細(xì)胞顯著不同。重要的是，甚至是在病毒感染的后期細(xì)胞沒有被分離，這就解釋了相當(dāng)小的菌斑尺寸。重要的是，因為感染的細(xì)胞保持在單層并未能集攏，在siDaxx系中它們通常沒有評為菌斑，從而導(dǎo)致表面上看起來更低的菌斑形成效率(圖8B)。在缺乏NDlO體的主要成分的細(xì)胞中的病毒復(fù)制分析證實了 PML是野生型VZV生長的抑制劑，而SplOO在此過程中如果起任何作用也僅僅是一點點的。Daxx表現(xiàn)出具有一個區(qū)別的功能，因為盡管該蛋白的消聲(silencing)最初地導(dǎo)致加速的復(fù)制和蛋白質(zhì)積聚，病毒導(dǎo)向的多核體形成是缺陷的。討論NDlO體的組分，包括PML、SplOO和Daxx，聯(lián)合DNA病毒基因組并促成了一種內(nèi)在的抗病毒機制，該機制作用是抑制這些基因組的表達(10，21，22，32，35，47，67-69)。皰疹病毒演化了對策，其繞開這個細(xì)胞抑制機制以確保它們的有效復(fù)制和擴展。HSV編碼一種潛在的轉(zhuǎn)錄激活劑，ICP0，其靶向NDlO相關(guān)的用于蛋白酶降解的蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致立早病毒基因的表達增加01，22)。VZV，一種密切相關(guān)的alpha皰疹病毒，其編碼0RF61P，ICPO的一種直向同源物。 先前的研究已經(jīng)強調(diào)了在這兩種蛋白之間的生物活性的保守性，以及已經(jīng)證明了這兩者都是基因表達的激活體09，50)。然而，先前也表明了不同于ICPO，0RF61p未能在病毒復(fù)制期間克服用于陪伴蛋白(co-chaperone protein)BAG3的需求，揭示了直向同源物具有不同的功能(38)。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對(sequence alignment)揭示了，雖然0RF61p保有 ICPO保守的環(huán)指殘基，但它缺乏其HSV直向同源物的C-末端(圖1)。這兩個區(qū)域?qū)τ趯?ICPO有效靶向NDlO體以及其組分的降解是必要的(16)。0RF61P缺乏ICPO的C-末端以及其相關(guān)的NDlO靶向結(jié)構(gòu)域提高了 0RF61p不能降解PML體的成分的可能性。細(xì)胞短暫表達ICPO或0RF61p免疫熒光分析以及來自感染了表達皰疹病毒蛋白質(zhì)的重組腺病毒的細(xì)胞的蛋白質(zhì)western免疫印跡分析揭示了 0RF61p并不消耗PML，以及其SplOO水平的降低不如在表達ICPO的細(xì)胞中有效(圖3)。此外，通過加入ICPO的靶向結(jié)構(gòu)域?qū)?RF61p靶向 NDlO的嘗試并不改變這種表型(圖4)。因為ICPO包含兩種分離的E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase)活性，它被描述為一種雙頭的泛素連接酶(在(30)中有回顧)(圖1)。單純性皰疹病毒泛素連接酶(Herpes simplex virus ubiquitin ligase，HUL)_l 是由 ICPO 的外顯子 3編碼以及其對于 cdc34 的降解負(fù)責(zé)08，四，31)。然而，HUL-2的促進PML和SplOO降解的活性映射到ICPO的環(huán)指結(jié)構(gòu)域G，31)。在合適的分子環(huán)境中的環(huán)結(jié)構(gòu)域與蛋白酶的降解相關(guān)02)。重要的是，連接一種泛素蛋白酶(HAUSP-USP7)到ICPO的C-末端預(yù)示可以促進環(huán)指底物(substrates)的降解(30)。這種連接可能導(dǎo)致USP7從新的泛素化HUL-2底物隔離，并確保其用于蛋白酶降解的有效靶向(5，20，30)?；谶@些觀察，可以預(yù)想到兩個情形，其解釋了為什么0RF61p并沒有引起PML和 SplOO的消失。盡管環(huán)指結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄滢D(zhuǎn)錄激活活性是必要的(48)，但0RF61p的其余部分的分子環(huán)境可能對其作為一種E3泛素連接酶并不適合?；蛘?，在0RF61p內(nèi)缺乏一種泛素特殊蛋白酶連接位點可能導(dǎo)致USP7可用，其靶標(biāo)的快速去-泛素化，從而保護其不受蛋白酶體(proteasomal)降解。更傾向于后一種假設(shè)，因為積聚證據(jù)揭示了不同于ICPO的自保留性質(zhì)，其依賴于USP7的結(jié)合(5)，0RF61p以一種需要一種功能環(huán)指結(jié)構(gòu)域的蛋白酶體依賴方式快速降解了(Kyratsous，DeLong和Silverstein，未發(fā)表)。這個觀察暗示0RF61p 的環(huán)指結(jié)構(gòu)域具有E3連接酶的活性以及能驅(qū)動自-泛素化，然而蛋白酶連接位點的缺失導(dǎo)致其消耗。作為這個論點的支持，在0RF61p中沒有發(fā)現(xiàn)對于結(jié)合USP7所必要的在ICPO序列內(nèi)的氨基酸(19)(圖1)。根據(jù)VZV蛋白質(zhì)和NDlOs組分之間關(guān)系的更進一步分析，注意到不同于在HSV感染期所觀察到的，在VZV感染期PML和Sp 100的豐度增加了(圖7A)。這種增加是NDlOs的干擾素-激發(fā)組分所特有的(圖7B)，因為Daxx水平在整個感染期并沒有改變(圖7A)。因為VZV誘導(dǎo)干擾素，病毒蛋白被認(rèn)為并不直接誘導(dǎo)NDlO組分的合成，因此PML和SplOO豐度增加是干擾素刺激的一個間接作用。不能排除這種可能性，即與干擾素不相關(guān)的其它途徑或許有助于PML和SplOO在感染細(xì)胞中的水平增加。令人驚奇的是，盡管0RF61p的自發(fā)表達導(dǎo)致SplOO水平的降低(圖3)，VZV感染導(dǎo)致一種增加(圖7)。在感染期干擾素的誘導(dǎo)被認(rèn)為掩蓋了 0RF61p對SplOO的降解。這就與在HSV感染期所觀察到的形成對比，但對照0RF61p時ICPO導(dǎo)致SplOO更有效的降解與這個觀察又保持一致(圖3)。缺乏ICPO的HSV變異體對干擾素高度敏感(51)，以及這個作用是由PML介導(dǎo)的 (7)。相反，盡管VZV對干擾素敏感；但0RF61變異體不同于ICPO變異體那樣對干擾素高度敏感(1)。這些數(shù)據(jù)與在VZV感染期PML是不降解的這個觀察一起揭示了干擾素通過特有的機制來抑制這兩種人alpha皰疹病毒的復(fù)制，以及這些病毒演化了不同的特別對策。作為結(jié)論，不同于HSV，VZV可能并不需要PML的降解來克服由干擾素引起的抑制。還有報道稱PML、Sp 100和Daxx抑制皰疹病毒復(fù)制的早期階段(21，22，67-69)。消耗每種上述蛋白質(zhì)的穩(wěn)定細(xì)胞系被用于分析這些蛋白質(zhì)是否也影響VZV的復(fù)制動力學(xué)和產(chǎn)率(圖8A)。不同于其在HSV感染中的作用，SplOO在感染了 VZV的細(xì)胞中對菌斑形成效率、基因表達和感染中心滴度幾乎沒有影響。然而，SiPML和SiDaxx兩者的感染細(xì)胞系導(dǎo)致滴度增加和在早期病毒蛋白的積聚。因而，這些蛋白質(zhì)專一地阻止病毒復(fù)制的早期階段。除去這些差別，VZV 的細(xì)胞關(guān)聯(lián)滴度在所有細(xì)胞系中的感染后期都達到相同的滴度峰值。VZV復(fù)制被假設(shè)是由兩種獨立的宿主介導(dǎo)步驟控制由PML、Daxx和可能的其它宿主蛋白介導(dǎo)的早期限制，以及決定病毒產(chǎn)率的后期限制。盡管那些在早期發(fā)揮抑制病毒生命周期的初始階段的蛋白質(zhì)的消耗導(dǎo)致加速的復(fù)制動力學(xué)，但這對于增加感染中心的擴展和發(fā)展并不是充分的。研究NDlO組分在野生型HSV感染期間的功能是困難的，因為這些蛋白質(zhì)在ICPO 表達后快速降解了，從而從感染細(xì)胞中缺失了。因此，這些宿主產(chǎn)物的消耗對野生型病毒復(fù)制動力學(xué)和產(chǎn)率并無作用，但是提高了一種未能導(dǎo)向降解的ICPO-病毒的復(fù)制01，22)。這項研究的結(jié)果證明了在PML消耗的細(xì)胞中，野生型VZV模擬ICP0_病毒復(fù)制(圖8)，并且未能導(dǎo)向NDlO體的主要組分的降解(圖3)。與PML相反，當(dāng)0RF61p被表達，SplOO豐度部分地降低了(圖3)，以及該蛋白的消耗對病毒復(fù)制只有很小的作用(圖8)。因此，VZV可能已演化了，以便滴定(titrate) SplOO的水平達到有效復(fù)制所必要的程度。或者，在siRNA消耗后在細(xì)胞內(nèi)保持的少量SplOO可能對于其用于靜默VZV是足夠的?？傊?，這項研究表明VZV在細(xì)胞培育中的生長顯示其作為alpha皰疹病毒家族的一個獨特的成員。不同于其它的ICPO直向同源物(55)，0RF61P并不導(dǎo)向NDlO組分的降解。VZV與這個內(nèi)在的防御機制的相互作用與腺病毒如何對付宿主介導(dǎo)的靜默最相似(72， 73)。這兩種病毒都不能降解NDlO蛋白質(zhì)，然而兩者都克服由干擾素帶來的限制。此外，與 HSV相反，但其同樣是腺病毒，VZV復(fù)制不受由SplOO消耗的影響，但當(dāng)PML和Daxx被靜默時，它的復(fù)制被加速了。盡管認(rèn)為HSV和VZV非常相似，這項研究證實了它們已經(jīng)演化了獨特的和專一的途徑以干擾宿主細(xì)胞的抑制，從而確保其有效的生長和擴展。結(jié)果IIAlpha皰疹病毒編碼單純性皰疹病毒(HSV) α基因產(chǎn)物ICPO的直向同源物。 ICPO是一種細(xì)胞核磷蛋白，其作用為一種病毒和細(xì)胞基因的混雜激活劑(promiscuous activator) (83，87，104，105)。ICPO也發(fā)揮作為E3泛素連接酶的作用以靶向用于蛋白酶降解的幾種宿主蛋白(80,86,87,92,102).通過此活性，ICPO促進核域10 (NDlO)體組分，包括前骨髓細(xì)胞癌(promyelocytic leukemia, PML)蛋白和SplOO的降解。這些蛋白質(zhì)與皰疹病毒基因組的靜默相關(guān)(86，87，98，110)。因此，ICPO介導(dǎo)的NDlO組分的降解可能破壞 HSV基因靜默，以允許有效的基因表達。這個假設(shè)對于ICPO如何誘導(dǎo)基因活化提供了一種似乎合理的機理解釋。引入編碼來自HSV、牛皰疹病毒、馬皰疹病毒和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)的ICPO直向同源物的DNA也能夠影響細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)(103)。另外對于此報道更具體的是， 0RF61p作為VZV的直向同源物，它和這個基因家族中的原型ICPO —樣激活病毒啟動子和提高病毒DNA的易感性(100，101)。然而，HSV和VZV的直向同源物之間的兩個關(guān)鍵的生物學(xué)差異在先前已被證明了。不同于ICP0，0RF61p不能補足BAG3(—種宿主陪伴蛋白)的消耗。結(jié)果就是，VZV受到靜默BAG3的影響(91)，而HSV的生長僅僅當(dāng)ICPO沒有被表達時變化(9 。此外，由于兩種蛋白都靶向NDlOs組分，ICPO的表達導(dǎo)致PML和SplOO這兩者都降解，而0RF61p專一地降低SplOO的水平(9 。這些發(fā)現(xiàn)表明這些蛋白質(zhì)分別地演化了以提供用于病毒復(fù)制的不同功能。缺失ICPO基因的病毒變異體具有增加的粒子與菌斑形成單元(plaque forming unit) (pfu)比例，實質(zhì)上較低的產(chǎn)率和降低的α基因表達水平，以一種感染復(fù)數(shù) (multiplicity of infection,moi)和細(xì)胞類型依賴的方式(78，80，84，109)。這些變異體在降解NDlO組分上也是有缺陷的(99)。PML和SplOO的消耗加速了病毒基因的表達，并增加了 HSV ICPO缺陷病毒菌斑形成效率，但對于野生型病毒沒有作用這就提出PML和SplOO 是一種內(nèi)在的抗-HSV防御機制的成分，該機制由ICPO的E3連接酶的活性抵消(86，87)。 有趣的是，ICPO零病毒(ICP0 null viruses)也對于干擾素(IFN)高度敏感(102)，一種預(yù)示為通過PML介導(dǎo)的性質(zhì)(79)。構(gòu)建了一種表達0RF61p以替代ICPO的HSV變異體病毒，以便直接對照這兩種直向同源物的活性。得到的嵌合病毒僅僅部分地補救了這種ICPO零表型(ICP0 null phenotype)。這樣的研究強調(diào)了 ICPO和0RF61p之間的生物學(xué)差異，并闡明了在感染期對于PML和SplOO需求。材料和方法哺乳動物類細(xì)胞.人黑色素瘤(MeWo)、siPML(93)、siSpl00(92)、 L7(106)和U20S細(xì)胞按照先前描述的獲取(91，111)。DNA 轉(zhuǎn)化·通過 Fugene HD[Roche，Indianapolis，IN]，DNAs 被轉(zhuǎn)化入合適的細(xì)胞系。藥物治療.干擾素α 購自 PBL Biomedical [Piscataway, NJ]公司。病毒.[i]HSV.使用的菌株是野生型HSV-I (Glasgow strain 17)和一種菌株 17(dll403)的 ICPO零病毒衍生物(109)。[ii]表達VZV 0RF61p&HSV(HSV-0RF61).dll403 病毒粒子(nucleocapsids)被用線性化的pCPC-061共感染入MeWo細(xì)胞。挑選出大的菌斑并通過PCR擴增篩選重組病毒。那些對0RF61p而非ICPO編碼序列為陽性的菌斑是被純化五次的菌斑。病毒生長分析.[i]菌斑分析』610、8丨 1^、8丨5 100、1^7或似05細(xì)胞的匯合單層用病毒存貨(Stocks)的10倍系列稀釋物感染，單層被固化和著色，以及菌斑被計數(shù)。[ii] 生長曲線.在分析前，所有HSV存貨的滴度通過在ICPO-互補細(xì)胞系L7上滴定來測量。病毒產(chǎn)率按照先前描述的來測定(93)。
Hirt DNA 提取。Hirt DNA 按照描述制備(90)。質(zhì)粒構(gòu)建物。VZV 0RF61 PCR擴增自VZV基因組DNA (Jones菌株)，其采用RV61 ( 5' -GGGTCGACTTGCATTACCCTATCCCAGTATT-3' )(SEQ ID NO :7)禾口3, Sal61(5' -CCGTCGACC CCAACAAACTAGGACTTCT-3 ‘ ) (SEQ ID NO 8)。這些 PCR 產(chǎn)物被克隆入 pCR2. 1-T0P0 以產(chǎn)生 pCPC-T61cJ。0RF61編碼序列被切離為一種Ncol/Sall片段，該片段用于在Ncol/Sall消化的pDS17中替代編碼ICPO的序列(113)，以產(chǎn)生pCPC-061。所有引物從Operon Biotechnologies[Huntsville,AL]公司獲得以及所有載體插入物通過DNA測序驗證。重組病毒基因組的分析。Hirt DNAs中的0RF61序列的存在性被驗證以及通過PCR 方法證實IE-O編碼序列的缺失，采用引物0for 5' -ACAGAAGCCCCGCCTACGTT-3‘，Orev 5 ‘ -GGTGCCCGTGTCTTTCACTTTTC-3 ‘ ,61for 5 ‘ GGGAATTCGGGGCCCCTTCAATCGTCGGCTAG-3 ‘,61rev 5' TGCGGCCGCGAATCTCGCGTTTCCCTCTGTTCC-3‘ (SEQ ID NOS 3-6，分別地)?？贵w。對于ICPO的多克隆抗體已描述00)。對于ICPO和ICP4的單克隆抗體購自 Rumbaugh-Goodwin 研究院[Plantation, FL]。描述過抗 ORF δ Ip 的多克隆抗體(92)。 對于微管蛋白的單克隆抗體從Santa Cruz Biotechnology [Santa Cruz，CA]公司獲得?？?PML和SplOO的多克隆抗體購自Chemicon[Temecula，CA]公司。結(jié)合了用于免疫印跡的辣根過氧化物酶的山羊抗-兔和抗-鼠抗體從KPUfeiithersburg，MD]公司獲得。SDS-PAGE和western免疫印跡。感染的或生物化學(xué)法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被用冷的磷酸鹽緩沖液(PBQ洗滌兩次，細(xì)胞溶解在1.切SDS樣品緩沖液[75mM TrisHCl pH 6. 8，150mM DTT，3% SDS，0. 15%溴酚藍，15%甘油]中，并煮沸。宿主和病毒蛋白被用于SDS-PAGE分析(94)。在western免疫印跡前，蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。在含有5%脫脂牛奶的 PBST中封閉薄膜之后，固定的蛋白質(zhì)與合適的抗體在含1 %脫脂牛奶的PBST中反應(yīng)。薄膜用PBST洗滌三次，每次5分鐘，用結(jié)合到辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)的抗-兔和抗-鼠抗體接種；然后用PBST洗滌三次，每次5分鐘，再用PBS洗滌兩次。通過加入LumiGLO底物[KPL]并曝光X射線膠卷抗體被可視化。結(jié)論產(chǎn)生一種VZV-HSV重組其表達0RF6Ip。用VZV共感染(Coinfection)補充了一種 HSV-ICPO變異體的生長(109)。隨后，一種有條件地表達0RF61p的細(xì)胞系被用于補充一種 ICPO零變異體(ICPO null mutantM24)。后一實驗揭示了這些病毒的直向同源物共同享有一些生物活性。然而，這些蛋白質(zhì)區(qū)別地影響NDlO組分和野生型VZV，而非HSV，表明對這些組分的不同需求(92)。因此，為進一步剖析0RF61p的功能，這項研究探討了當(dāng)它在代替重復(fù)的立早O (immediate early 0) (IE-O)位點時是否能替代HSV ICPO0為了替代編碼ICPO HSV 的位點(the loci encoding ICPO HSV)，用 dl 1403作為病毒骨架。dl 1403編碼前105個氨基酸和額外的56個氨基酸，他們衍生自IE-O基因的第二個和第三個外顯子的幀頻失調(diào)融合蛋白(out of frame fusion) 0按照在材料和方法中的描述，0RF61p編碼序列被擴增以及插入進一個Ncol/Sall消化的ICPO克隆抗體。該Ncol位點包含了 AUG密碼子，該密碼子被這兩個基因用于啟動它們各自的蛋白質(zhì)合成。得到的質(zhì)粒 (pCPC-061)結(jié)構(gòu)完整性，其保持了該IE-O啟動子和3' UTR，被通過限制性內(nèi)切核酸酶裂解以及DNA測序分析驗證。隨后，pCPC-061被線性化并與dll403病毒粒子(nucleocapsids)一起共-轉(zhuǎn)染入MeWo細(xì)胞(107)。得到的重組病毒被滴定在MeWo細(xì)胞上，以及挑選出大菌斑并推測0RF61p的表達會補足ICPO-缺陷(100，109)。由這些菌斑制得的Hirt DNAs 通過PCR方法被篩查，采用引物IE-O的上游和下游以及與0RF61同源的兩個內(nèi)部引物(圖 10A)。包含帶有編碼0RF61p序列并不編碼ICP0DNA的病毒DNA的菌斑(圖10B)被進一步純化以及用于感染細(xì)胞，以測定它們是否表達0RF61p。該分析結(jié)果顯示在圖IOC并總結(jié)如下感染了 dll403或HSV-0RF61的細(xì)胞的western免疫印跡分析證實了它們在感染后6小時表達相似數(shù)量的ICP4且無ICPO表達，并且HSV-0RF61表達0RF61p。因此，在HSV-0RF61 中一個缺陷的IE-O基因的兩個復(fù)制品被0RF61p編碼序列替代以及得到的病毒在IE-O啟動子的控制下表達0RF61p。HSV-0RF61的生長和菌斑形成效率。進行了兩個實驗以測試是否0RF61p的表達補救了 ICPO零表型。首先，野生型dll403和HSV-0RF61被相對于L7和Vero細(xì)胞滴定以及相對菌斑形成效率被計算為在L7細(xì)胞上的滴度相對于在Vero細(xì)胞上的滴度的百分比。 HSV dll403，和其它的ICPO變異體病毒，具有高的顆粒/菌斑形成單元(pfu)比例，這在當(dāng)在補充細(xì)胞例如L7上測試它們的滴度被并在親代的Vero細(xì)胞系上對照它們的滴度時是明顯的。這三種病毒的菌斑形成效率是野生型=0. 9，dll403 = 340和HSV-0RF61 = 9. 5 (圖 11A)。因此，盡管0RF61p的表達提高HSV-0RF61相對于dll403的菌斑形成效率達大約35 倍，但這對于恢復(fù)野生型菌斑形成不是充分的。這項研究接著探究了 0RF61p的表達如何影響重組病毒在MeWo細(xì)胞中的生長動力學(xué)。細(xì)胞在低的感染復(fù)數(shù)(moi)下被感染，樣品隨時間被收集，每一細(xì)胞感染病毒的產(chǎn)率通過在L7細(xì)胞上的菌斑分析來測定。生長曲線的分析揭示了 HSV-0RF61復(fù)制的動力學(xué)介于野生型和dll403 二者之間(圖11B)。這些實驗導(dǎo)出這樣的結(jié)論，依據(jù)菌斑形成效率和病毒產(chǎn)率，0RF61p不能完全補償ICPO的缺乏。在感染了 HSV-0RF61的細(xì)胞中病毒指定蛋白的積聚。在低感染復(fù)數(shù)(mois)下 ICPO變異體的生長缺陷表現(xiàn)為所有類別的病毒-指定蛋白的延遲表達和降低的積聚(2， 4)。因此，在moi 0. 2處MeWo細(xì)胞用野生型、dll403和HSV-0RF61進行感染。免疫熒光分析 ICP4(沒有給出數(shù)據(jù))被用于驗證每一病毒感染了相同數(shù)量的細(xì)胞。細(xì)胞溶解產(chǎn)物在指定的時間制備得到并處理用于western免疫印跡分析。蛋白質(zhì)豐度分析和合成動力學(xué)揭示了在低感染復(fù)數(shù)(moi)的條件下，在感染后4小時在感染野生型病毒的細(xì)胞中檢測到ICP4的積聚。相反，這種蛋白質(zhì)在直到感染后6小時在感染dll403或HSV-0RF61的細(xì)胞中都沒有檢測到(圖12)。此外，在感染后8小時ICP4的豐度在感染了變異體病毒的細(xì)胞中相對于在野生型感染細(xì)胞中明顯降低了。如先前描述，ICP27的合成動力學(xué)和積聚依賴功能的ICPO 的表達(97)。這個表型在當(dāng)0RF61p被表達時僅僅部分反轉(zhuǎn)了(reversed)(圖13)。正如預(yù)期，ICPO和0RF61p僅僅在感染了表達這些蛋白質(zhì)的病毒的細(xì)胞中被檢測到。這些數(shù)據(jù)， 與菌斑形成效率和生長的研究(圖11) 一致，證明了 0RF61p不完全表型復(fù)制(phenocopy) ICPO的生物學(xué)性質(zhì)，盡管它明顯地提高了一種ICPO-病毒的復(fù)制。感染后NDlO成分的命運.ICPO對于游離NDlOs和靶向其兩個主要成分PML和 SplOO并用于蛋白酶體降解是必要和充分的，。與之相對，0RF61p不降解PML，但降低SplOO 水平(92)。相應(yīng)地，PML和SplOO的命運在感染HSV-0RF61期間被跟隨，并與在感染野生型或dll403的細(xì)胞中所發(fā)生的進行對照。Western免疫印跡分析揭示了在感染了野生型病毒的細(xì)胞中，在較早的時間如感染后2小時就檢測到了 PML的降解。相反，PML水平在感染了 dll403或HSV-0RF61的細(xì)胞中都沒有改變(圖13A)。這些結(jié)論更加堅定了先前的發(fā)現(xiàn)并證實了 0RF61p不影響PML的穩(wěn)定狀態(tài)水平(steady state level)，甚至在其它HSV立早或早期蛋白存在的情況下。SplOO是NDlOs的另外一個主要組分，眾所周知它在感染HSV 后以一種ICPO依賴的模式有效降解了(80)。這項研究證明了在HSV基因表達的環(huán)境下， 0RF61p有效導(dǎo)向SplOO的降解(圖13A)。野生型HSV和VZV病毒區(qū)別地受PML或SplOO的消耗影響(92)。在siPML和 SiSplOO細(xì)胞中測定了 HSV-0RF61相對菌斑形成效率，并對照了野生型HSV和dll403的效率以測定HSV-0RF61是否受到宿主蛋白PML或SplOO向下調(diào)控的影響。如先前報道，野生型病毒的菌斑形成效率在當(dāng)?shù)味ㄔ谙牧?PML(SiPML)或SplOO (SiSplOO)的細(xì)胞上時不受影響(圖13B)。相反，dll403在缺失這些NDlO成分時僅部分被補償(圖13B)。HSV-0RF61 的相對菌斑形成效率表型模擬(phen0C0pied)VZV(9》。更具體地，在siPML細(xì)胞中病毒滴度增加，而在SiSplOO細(xì)胞中其保持不變(圖13B)。干擾素對于病毒復(fù)制的影響。先前的研究建議了 HSV的干擾素(IFN)敏感性是 PML介導(dǎo)的，并提出一種ICPO-病毒在某種程度上是高度敏感的，因為它未能降解這種細(xì)胞蛋白。已顯示了 HSV-0RF61不能降解PML，這項研究探索了 IFN處理如何影響這種變異體病毒的生長。對比了 HSV-0RF61p、MeWo上的野生型HSV-I和dll403、Vero [其響應(yīng)但不表達 IFN(8 ]和U20S [—種補充ICPO變異體病毒的細(xì)胞系(112)]細(xì)胞在存在和不存在干擾素 (IFN)的情況下的菌斑形成效率。在MeWo和Vero細(xì)胞中dll403和HSV-0RF61這兩者的菌斑形成效率都受假定為響應(yīng)干擾素而合成的干擾素-刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的影響(圖14)。這個在野生型病毒的MeWo和Vero細(xì)胞上觀察到的敏感度上小的差異0到5_倍)并不是由絕對菌斑形成效率(absolute plaquing efficiency)差異造成的結(jié)果，而是反射出在Vero細(xì)胞中所有病毒對干擾素(IFN)作用的較大敏感度(表 1)。
表1 病毒滴度
權(quán)利要求
1.一種重組脫氧核糖核酸，該重組脫氧核糖核酸包含一種具有整合的異源DNA人單純性皰疹病毒(HSV)的脫氧核糖核酸(DNA)，其中該異源DNA編碼一種包含環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組脫氧核糖核酸，其中該HSVDNA是基因組DNA，以及該異源DNA被整合入該HSV DNA以替代該HSV基因DNA組中編碼HSV感染細(xì)胞多肽0 (ICPO)的部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組脫氧核糖核酸，其中該異源DNA被插入進該HSV基因組 DNA的一個HSV ICPO 5'的非翻譯域(UTR)和一個HSV ICPO 3'的非翻譯域(UTR)之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的重組脫氧核糖核酸，其中包含了該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該多肽具有水痘帶狀皰疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的重組脫氧核糖核酸，其中包含該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該異源多肽具有一種馬皰疹病毒、牛皰疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組脫氧核糖核酸，其中該HSVDNA是一種HSV基因組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項所述的重組脫氧核糖核酸，該重組脫氧核糖核酸還包含一種編碼一種糖蛋白的異源DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組脫氧核糖核酸，其中該糖蛋白具有一種水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組脫氧核糖核酸，其中該糖蛋白包含一個水痘帶狀皰疹病毒的中和表位。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項所述的重組脫氧核糖核酸，其中由該重組脫氧核糖核酸編碼的多肽都不降解哺乳動物類的前骨髓細(xì)胞癌(PML)蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任意一項所述的重組脫氧核糖核酸，其中編碼該多肽的該異源 DNA被整合，從而當(dāng)該重組脫氧核糖核酸被整合入一種合適的宿主細(xì)胞的基因組時，該多肽被表達。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-11任意一項所述的重組脫氧核糖核酸，其中編碼該糖蛋白的該異源DNA被插入進該HSV DNA的一個非必要基因或區(qū)域中。
13.一種包含編碼一種帶有環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的多肽的異源DNA的重組人單純性皰疹病毒 (HSV)，該異源DNA (a)被插入該HSV基因組的一個非必要區(qū)域中，以及(b)在該重組HSV引入的宿主細(xì)胞中被表達。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的重組HSV，其中該異源DNA被插入進該HSV基因組以替代該HSV基因組中編碼HSV感染細(xì)胞多肽0 (ICPO)的部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的重組HSV，其中該異源DNA被插入進該HSV基因組的一個HSV ICPO 5'的非翻譯域(UTR)和一個HSV ICPO 3'的非翻譯域(UTR)之間。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15任意一項所述的重組HSV，其中包含了該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該多肽具有水痘帶狀皰疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-15任意一項所述的重組HSV，其中包含該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該多肽具有一種馬皰疹病毒、牛皰疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-17任意一項所述的重組HSV，該重組HSV還包含一種編碼一種糖蛋白并被插入該HSV基因組的一個非必要區(qū)域中的異源DNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組HSV，其中該糖蛋白具有一種水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組HSV，其中該糖蛋白包含一個水痘帶狀皰疹病毒的中和表位。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組HSV，其中編碼該糖蛋白的該異源DNA被插入進該HSV 基因組的一個非必要基因或區(qū)域中。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的重組HSV，其中由該重組HSV基因組編碼的多肽都不降解PML。
23.根據(jù)權(quán)利要求13-22任意一項所述的重組HSV，其中該重組HSV包含多達8個不同的異源DNA，且每個DNA編碼一個不同的水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白。
24.一種疫苗，該疫苗包含(1) 一種藥學(xué)可接受載體和( 一種重組病毒，該重組病毒包含一種包含人單純性皰疹病毒(HSV)基因組的重組脫氧核糖核酸，該人單純性皰疹病毒 (HSV)基因組(a)具有一種編碼包含一個環(huán)-指結(jié)構(gòu)域多肽的整合的異源DNA以及(b)具有一個或多個整合的異源DNA，其中每個DNA編碼一種糖蛋白。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的疫苗，其中該異源DNA被整合入該HSV基因組以替代該HSV DNA中編碼一種HSV感染的細(xì)胞多肽0 (ICPO)的部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或沈所述的疫苗，其中該異源DNA被插入進該HSV基因組的一個 HSV ICPO 5'的非翻譯域(UTR)和一個HSV ICPO 3'的非翻譯域(UTR)之間。
27.根據(jù)權(quán)利要求M46任意一項所述的疫苗，其中包含一個環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該異源多肽具有水痘帶狀皰疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求M-27任意一項所述的疫苗，其中包含一個環(huán)-指結(jié)構(gòu)域的該異源多肽具有馬皰疹病毒、牛皰疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求M-觀任意一項所述的疫苗，其糖蛋白具有一種水痘帶狀皰疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求M-四任意一項所述的疫苗，其糖蛋白包含一個水痘帶狀皰疹病毒的中和表位。
31.根據(jù)權(quán)利要求M-30任意一項所述的疫苗，其中編碼該糖蛋白的異源DNA和編碼包含該環(huán)-指結(jié)構(gòu)域多肽的異源DNA都被插入進該HSV基因組的非必要基因或區(qū)域中。
32.一種使受試者抗水痘帶狀皰疹病毒感染的免疫方法，該方法包含給予受試者一定量根據(jù)權(quán)利要求26-31任意一項所述的疫苗，以有效引起受試者對該水痘帶狀皰疹病毒的免疫應(yīng)答，從而使受試者免疫。
33.一種制備用于預(yù)防一種病毒感染的組合物的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求 13-23任意一項所述的重組病毒與一種活疫苗穩(wěn)定劑結(jié)合，從而制備該組合物。
全文摘要
提供了一種重組脫氧核糖核酸，該重組脫氧核糖核酸包含一種具有異源DNA整合的人單純性皰疹病毒(HSV)的脫氧核糖核酸(DNA)，其中該異源DNA編碼一種包含環(huán)-指(RING-finger)結(jié)構(gòu)域的多肽，一種包含如所述的重組病毒，一種疫苗以及免疫方法。
文檔編號A61K39/12GK102573898SQ201080040508
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月28日
發(fā)明者C·A·克雷特蘇, C·A·帕奈格勞蒂茲, M·S·沃爾特斯, S·J·西爾弗斯坦 申請人:紐約哥倫比亞大學(xué)理事會