專利名稱：一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術，尤其是涉及一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，該
重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體由缺失性的腺病毒和丙型肝炎病毒的至少兩個抗原序列 構成。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)是導致慢性肝炎的主要致病因子之一。在我國，HCV人群感染 率為3.2%，估計受感染者在4000萬以上，高于亞洲地區(qū)平均水平，在世界上屬高發(fā)地區(qū)。 當健康人群感染HCV后約75-85%會發(fā)展成為慢性丙型肝炎，其中20%病人會進一步發(fā)展 為肝硬化和肝細胞性肝癌等導致最終死亡的嚴重疾病。目前除干擾素外尚無理想的預防 和治療手段，且干擾素治療率不到50%，尤其對于基因型1型，這種占全球所有HCV感染者 70 %以上，占我國HCV感染者約80 %的型別，治療效果尤差；除此之外干擾素還弓I起一系列 的副作用。因此，目前亟需發(fā)展一種有效的疫苗來預防或用以治療HCV感染。
研究證明，HCV感染人體后，體內(nèi)針對HCV的特異性細胞免疫是控制HCV病毒復 制的關鍵，正是因為患者體內(nèi)特異性T細胞的存在，特別是特異性細胞毒性T淋巴細胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)的存在，使感染者在感染HCV后的一個相當長的時間內(nèi)， 病毒被控制在一個較低的水平。誘導特異性細胞免疫反應的HCV疫苗通常是依靠疫苗載體 系統(tǒng)將HCV病毒抗原基因帶入人體細胞表達，然后通過抗原遞呈細胞將HCV的抗原蛋白加 工成能與MHC分子結合的短肽，從而經(jīng)MHC通路激活特異性細胞免疫。因此研究開發(fā)誘導 特異性細胞免疫反應的疫苗就變得非常有必要。 目前HCV基因型主要分為6種(以1至lj 6表示)，其中六個基因型又可分為100多種 亞型(以a，b，c等表示)。HCV包括3種結構蛋白C、El、E2和6種非結構蛋白NS2、NS3、NS4a、 NS4b、NS5a、NS5b，其中結構蛋白參與病毒顆粒裝配，非結構蛋白參與基因的復制。目前全球 進入臨床實驗的誘導特異性細胞免疫反應的HCV疫苗涉及到HCV的各種基因，如merck公 司的以El和E3缺失的5或6型腺病毒為載體，目的基因為Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B， 或者優(yōu)化的上述基因序列，能達到預防和治療HCV感染的作用。Transgene公司的以El和 E3缺失的腺病毒為載體，其中目的基因CMV-NS3-NS4位于El區(qū)，SV40-NS5B位于E3區(qū)。 1996年8月16日韓國KOREA公司申請的KR19960033924專利申請公開了 El區(qū)缺失的Ad5 載體，缺失區(qū)插入了 core, El和E2區(qū)。 HCV具有顯著異源性和高度可變性，在HCV的編碼基因中，C區(qū)最保守、非結構(NS) 區(qū)次之，E1和E2區(qū)可變性最高稱為高可變區(qū)。由于HCV型別眾多，而且會在免疫壓力下不 斷地發(fā)生變異，如果T細胞反應針對的T細胞表位過于狹窄，病毒就可能很容易地通過變異 來逃避細胞免疫的攻擊；此外，人群中HLA分子多樣性的存在，使不同HLA類型的人體內(nèi)T 細胞識別的抗原表位千差萬別，所以選擇較為保守的基因作為誘導特異性細胞免疫反應疫 苗的目的基因是較為理想的選擇。06年12月31日美國globelmmune申請的美國專利US20080069831,保護了NS3和core的融合蛋白在酵母中表達；03年11月13日英國葛蘭素集團申請的中國專利
200380108869. 8保護的是core和NS3的融合蛋白，均不是在腺病毒載體中表達。 腺病毒在自然界分布廣泛，在許多哺乳動物和畜類中都發(fā)現(xiàn)其存在。至今已分離
到100種以上不同血清型的各種腺病毒。腺病毒是二十面體病毒殼體結構，其基因組為線
性的雙鏈DNA。由于腺病毒做為載體具有高的感染效率和高的外源基因表達水平、同時高滴
度重組病毒的制備較簡單、容量適合裝載大多數(shù)外源基因、不整合入靶細胞基因組等等的
優(yōu)點，故腺病毒被廣泛用于基因治療的載體。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體。
為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案為一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，該 載體包括病毒載體和丙型肝炎病毒的至少兩條抗原序列，所述抗原含有B細胞表位和T細 胞表位，該重組載體能使免疫動物產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應。 所述病毒載體是腺病毒載體、腺相關病毒載體、SV40病毒載體、反轉錄病毒載體、
單純皰疹病毒載體或痘苗病毒載體。 所述腺病毒載體是缺失性腺病毒載體。 所述核苷酸序列插入至腺病毒的E1、E2、E3或E4區(qū)域。 所述腺病毒載體是人5型腺病毒載體、35型腺病毒載體、2型腺病毒載體或6型腺 病毒載體。 所述抗原序列可通過內(nèi)部核糖體進入位點序列連接，從啟動子雙順反子地表達。
所述抗原序列可融合表達于載體。 所述丙型肝炎病毒的抗原選自選自核心、NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5和其它含T細胞表 位的抗原。 所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS3抗原，其序列如SEQ ID N0 :1所示。
所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS4A抗原，其序列如SEQ ID NO :2所示。
所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS4B抗原，其序列如SEQ ID NO :3所示。
所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS5A抗原，其序列如SEQ ID NO :4所示。
所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS5B抗原，其序列如SEQ ID NO :5所示。
所述重組載體還含有至少一個免疫剌激物基因序列。 所述免疫剌激物是白細胞介素、干擾素、粒細胞集落剌激因子或者粒細胞_巨噬 細胞集落剌激因子。 上述新型重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體在制備用于預防和治療由丙型肝炎病 毒引起的疾病的藥物中的應用。 —種用上述重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體制備的疫苗。 本發(fā)明的新型重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體是通過如下方法獲得的，是將兩個 或兩個以上的目的基因通過基因工程方法進行融合或者通過內(nèi)部核糖體進入位點IRES序 列連接，然后以酶切方式插入到經(jīng)改良過的腺病毒載體中形成重組體，在大腸桿菌中進行 擴增，經(jīng)分離、提取、純化后，轉染293細胞(人胚腎細胞)，在293細胞內(nèi)包裝成的類病毒顆 粒。
根據(jù)上述方案，首先通過PCR擴增得到所需目的基因，將兩個目的基因如核心抗 原序列和NS3序列通過PCR擴增方法進行連接，得到帶有核心抗原序列和NS3基因序列的 新的片段。將該新得到的目的基因片段克隆入穿梭質粒載體PDC315 (io)，通過FLP-frt重 組酶系統(tǒng)在293細胞中獲得重組腺病毒。 上述目的基因還可以是核心抗原和NS4A，核心抗原和NS4B、核心抗原和NS5A、核 心抗原和NS5B。 丙型肝炎核心抗原和NS3抗原具有引起CTL反應和體液免疫應答的作用。用丙型 肝炎核心抗原序列和NS3抗原序列做為目的基因的重組體作用于動物能引起動物體內(nèi)CTL 反應及體液免疫應答。本申請所述重組腺病毒載體作用于動物后能引起較強的CTL反應。 由于腺病毒做為載體具有高的感染效率和高的外源基因表達水平、不整合入靶細胞基因組 等等的優(yōu)點，因此注射本發(fā)明所述重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體具有高度安全性。另外， 用丙型肝炎核心抗原序列、NS3序列做為目的基因的重組腺病毒載體也能引起很強的體液 免疫反應。因此，注射本發(fā)明的重組病毒載體后，能使動物體內(nèi)引起體液免疫反應和細胞免 疫反應，從而達到預防和治療疾病的目的。


圖1A、圖1B是重組人丙肝病毒抗原腺病毒疫苗構建流程圖。 圖2是PDC315(io)質粒圖譜。 圖3是pBHGlox(delta)El，3Cre質粒圖譜。 圖4是重組腺病毒RAd-CNS3的PCR鑒定。 圖5是RT-PCR檢測感染細胞H印G2中的HCV-CNS3的轉錄。 圖6是重組腺病毒RAd-CNS3免疫Balb/c小鼠2周細胞免疫反應。 圖7是重組腺病毒RAd-CNS3免疫Balb/c小鼠4周細胞免疫反應。
具體實施例方式
實施例1、重組人丙肝病毒抗原腺病毒疫苗的構建 下面結合圖1對Ad/CNS3重組人丙肝病毒抗原腺病毒疫苗的構建做進一步詳細描 述。 以下所述5型腺病毒還可以是2型腺病毒、6型腺病毒、35型腺病毒或者動物腺病毒。 以下所述目的基因還可以是核心抗原和NS4A，核心抗原和NS4B、核心抗原和 NS5A、核心抗原和NS5B。 1、編碼丙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列core的獲得從丙肝患者血清提取 總RNA，通過逆轉錄的方法獲得cDNA，以獲得的cDNA為模板，設計引物
Core-S-out :5， -TTGTGGTACTGCCTGATAGGG-3， Core-A :5， -AGCGGAAGCTGGG(A/G)TGGTCA(A/G) (A/G)C-3'(上海英俊生物科技有 限公司合成)， 進行pcr擴增，擴增條件為第一循環(huán)94t:變性2分鐘，以后各循環(huán)94t:變性25 秒，55t:退火25秒，72t:延伸1分，共35個循環(huán)，之后72。C延伸10分鐘，得到PCR片段。
再以該獲得的PCR產(chǎn)物為模版，設計PCR引物
Core-S : 5 ， —ATGAGCAC(A/G)AATCCTAAACC—3 ， Core-A :5， -AGCGGAAGCTGGG(A/G)TGGTCA(A/G) (A/G)C-3'(上海英俊生物科技有 限公司合成) 進行PCR擴增，擴增條件為第一循環(huán)94t:變性1分鐘，以后各循環(huán)94t:變性25 秒，55t:退火25秒，72t:延伸40秒，共35個循環(huán)，之后72。C延伸10分鐘，之后得到core片 段，其具體序列如SEQ ID N0:6所示。將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司) 中，經(jīng)PCR鑒定和測序鑒定后得到T/core載體。 2、編碼丙型肝炎病毒NS3抗原的核苷酸序列NS3的獲得抽取丙肝病人血清，從 病人血清中提取丙肝病毒RNA，通過逆轉錄的方法獲得cDNA，以獲得的cDNA為模板，設計引 物NS3-S-out :5' -GAGACCAAGATCATCACCTGGG-3'
NS3-S : 5 ， -GCGCC (C/T)ATCACGGCCTG(C/T)(G/T)C—3 ，
NS3-A : 5 ， - (A/C)GTGACGACCTCCAGGTCAGCCGAC—3 ，
NS3-in-Sl :5' -GCAGCCCAAGGGTACAAGGT-3'
NS3-in-Al :5' -ACCTTGTACCCTTGGGCTGC-3'
NS3-in-S2 :5' -CT (C/T)GATGTGTCCGTCATACC-3'
NS3-in-A2 :5 ， -GGTATGACGGACACATC(A/G)AG—3 ，
(上述引物均由上海英俊生物科技有限公司合成)， 首先以NS3-S-out和NS3-in-Al為引物，cDNA為模版，進行PCR擴增。擴增條件 為第一循環(huán)94t:變性1分鐘，以后循環(huán)94t:變性25秒，5(TC退火25秒，72。C延伸1分 鐘，共35個循環(huán)，之后72t:延伸10分鐘，得到A片段，將其得到的PCR片段插入到T載體 (Takara公司)中，經(jīng)PCR鑒定和測序鑒定后命名為T/A載體。 同時以NS3-in-Sl和NS3-A為引物，cDNA為模版，Taq酶進行PCR擴增。擴增條 件為第一循環(huán)94t:變性1分鐘，以后5循環(huán)94t:變性25秒，45。C退火25秒，72。C延伸1 分30秒，以后循環(huán)94。C變性20秒，5(TC退火25秒，72。C延伸1分30秒，共30個循環(huán)，之 后72t:延伸10分鐘，得到B片段，將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司)中，經(jīng) PCR鑒定和測序鑒定后得到T/B載體。 再以NS3-S和NS3-in-Al為引物，提取T/A質粒為模版，Taq酶進行PCR擴增。擴 增條件為第一循環(huán)94t:變性1分鐘，以后5循環(huán)94t:變性25秒，45。C退火25秒，72。C 延伸50秒，以后循環(huán)94t:變性25秒，5(TC退火25秒，72。C延伸45秒，共30個循環(huán)，之后 72t:延伸10分鐘，得到NS3-1片段，將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司)中， 經(jīng)PCR鑒定和測序鑒定后得到T/NS3-1載體。 再以NS3-in-Sl和NS3-in-A2為引物，提取T/B質粒為模版，Taq酶進行PCR擴增。 擴增條件為第一循環(huán)94t:變性1分鐘，以后5循環(huán)94t:變性25秒，45。C退火25秒，72°C 延伸50秒，以后循環(huán)94t:變性25秒，5(TC退火25秒，72。C延伸50秒共30個循環(huán)，之后 72t:延伸10分鐘，得到NS3-2片段，將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司)中， 經(jīng)PCR鑒定和測序鑒定后得到T/NS3-2載體。 再以NS3-in-S2和NS3-A為引物，提取T/B質粒為模版，Taq酶進行PCR擴增。擴增條件為第一循環(huán)94t:變性1分鐘，以后5循環(huán)94t:變性25秒，45。C退火25秒，72。C延 伸50秒，以后循環(huán)94t:變性25秒，5(TC退火25秒，72。C延伸50秒共30個循環(huán)，之后72°C 延伸10分鐘，得到NS3-3片段，將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司)中，經(jīng) PCR鑒定和測序鑒定后得到T/NS3-3載體。 提取T/NS3-2和T/NS3-3質粒為模版，NS3-in-Sl+NS3-in-A2和NS3-in-S2+NS3-A 為引物，分別擴增出NS3-2和NS3-3片段，再以NS3_in_Sl和NS3-A為引物，以NS3-2和 NS3-3為模版，進行PCR擴增。擴增條件為第一循環(huán)94t:變性2分鐘，以后各循環(huán)94。C變 性25秒，55t:退火25秒，72t:延伸1分30秒，共30個循環(huán)，之后72。C延伸10分鐘，得到 NS3-2+3片段，將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司)中，經(jīng)PCR鑒定和測序鑒 定后得到T/NS3-2+3載體。 提取T/NS3-1和T/NS3-2+3質粒為模版，NS3-S+NS3_in_Al和NS3-in_Sl+NS3_A為 引物，分別擴增出NS3-1和NS3-2+3片段，再以NS3-S和NS3-A為引物，以NS3-1和NS3-2+3 為模版，Taq酶進行PCR擴增。擴增條件為第一循環(huán)94。C變性2分鐘，以后各循環(huán)94。C變 性25秒，49t:退火25秒，72。C延伸2分鐘，共30個循環(huán)，之后72。C延伸10分鐘，得到NS3 片段，其具體序列如SEQ ID N0:7所示。將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司) 中，經(jīng)PCR鑒定和測序鑒定后得到T/NS3載體。 3、 CNS3融合基因片段的獲得設計引物Core基因上游引物HCV-C-F :CGGCTAGCA CCATGAGCACAAATCCTAAACC (含NHe I位點)；C基因下游重疊引物HCV-CN3-R :GAGCAGGCCGTG ATAGGCGCAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG， T/core為模板擴增出帶重疊序列的core片段；NS3基因 上游引物HCV-N3C-F :CTGACCACCCCAGCTTCCGCTGCGCCTATCACGGCCTGCTC ;NS3基因下游引物 HCV-N3-R :GCGTCGACTCAAGTGACGACCTCCAGGTCAGCC(含Sail位點)，T/NS3為模板，擴增出帶 重疊序列的NS3片段。 再以該所得core和NS3為模版，以上述HCV_C_F和HCV_N3_R為引物，進行PCR擴 增，先不加引物，擴增條件為94°C變性3分30秒，45°C退火30秒，72°C延伸2分鐘40秒；再 向管中加入引物后，94t:預變性3分鐘，之后各循環(huán)94t:變性30秒，5(TC退火30秒，72。C 延伸2分鐘40秒，25個循環(huán)后，72t:延伸10分鐘，得到CNS3融合基因片段，其具體序列如 SEQ ID N0 :1所示。將其得到的PCR片段插入到T載體(Takara公司)中，得到T/CNS3載 體。 4、腺病毒穿梭載體PDC315/CNS3的獲得用NHe I和Sal I酶切質粒T/CNS3得到 CNS3/NHe I+Sal1片段；用NHe I和Sail酶切載體PDC315 (io)(加拿大MICRO公司)，其質 粒圖譜如圖2所示，得到PDC315/NHe I+Sal I片段，用T4 DNA連接酶連接上述兩個片段， 得到攜帶丙肝核心抗原基因core和非結構基因NS3的穿梭質粒pDC315/CNS3，命名為腺病 毒穿梭載體pDC315/CNS3。 5、同源重組與骨架載體pBHGlox(delta)El，3Cre((Microbix Biosystems公司， 其質粒圖譜如圖3所示，利用LipofectamineTM2000(invitrogen)共轉染至293細胞，通過 同源重組的方法獲得病毒。轉染第10-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3次有限稀釋法純化病毒 空斑，得到表達丙肝核心抗原和非結構抗原NS3的重組腺病毒，命名為RAd-CNS3重組腺病 毒疫苗。提取重組腺病毒DNA， PCR法檢測插入的CNS3序列和腺病毒E2區(qū)，目的基因檢測 引物為引物HCV-C-F，HCV-N3-R(同前)和穿梭質粒引物pDC315F， pDC315R，腺病毒載體E2區(qū)檢測引物為E2BF和E2BR，其序列為E2BF :5' -TCG TTT CTC AGC AGC TGT TG 3'，E2BR :5， -CAT CTG AAC TCA AAG CGT GG 3';(華大基因上海鼎安)，
檢測結果見圖4 :泳道M為500bp DNA Marker,泳道1_3以雙引物E2BF+E2BR與 HCV-C-F+HCV-N3-R進行PCR所得產(chǎn)物1為樣品(重組腺病毒RAd-CNS3) ， 2為腺病毒陽性 對照(空載腺病毒)3為陰性對照。 同時對腺病毒DNA進行測序(華大基因上海鼎安)，測序結果正確的腺病毒命名為
腺病毒疫苗RAd-CNS3。 實施例2 :重組腺病毒載體的檢測 RT-PCR檢測感染細胞H印G2中的HCV-CNS3的轉錄 用重組腺病毒RAd-CNS3感染H印G2細胞，之后從感染的H印G2細胞中提 取總RNA，以上述配對引物HCV-C-F+HCV-N3-R(同前)為引物，用RT/Plati皿m Taq Mixkit (Invitogen)進行RT-PCR擴增目的條帶。結果見圖5 :泳道M為DL15000bp DNAMarker，泳道1為樣品，泳道2為陰性對照。
實施例3重組腺病毒生產(chǎn)實驗
重組腺病毒擴增 培養(yǎng)293細胞(人胚腎細胞)，接種重組腺病毒于293細胞中進行擴增。擴增方法
為本技術領域已知的，可以參考《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術》(鄂征北京出版社)
重組腺病毒純化 采用離子交換柱HPLC純化系統(tǒng)對重組腺病毒進行純化。
重組腺病毒活性測定 TCID50方法測得重組腺病毒RAd-CNS3的比滴度為3.82%。
實施例4、重組腺病毒疫苗免疫小鼠實驗 整合了丙肝核心抗原基因與非結構抗原NS3基因的腺病毒疫苗RAd-CNS3在感染 動物后會模擬正常腺病毒感染模式，誘導免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對丙肝核心抗原基因與非結構抗 原NS3基因的特異性細胞免疫和體液免疫，當機體再次接觸病原體時，通過多信號途徑剌 激特異性免疫記憶細胞分泌細胞因子Y-IFN， Y-IFN已經(jīng)證實具有抗病毒效果。ELISPOT 實驗即通過檢測Y-IFN的分泌從而間接檢測特異性CTL反應。重組腺病毒RAd-CNS3免疫 Balb/c小鼠，以空載腺病毒作為對照，于免疫后第2周、4周取其脾臟制備單個脾細胞懸液， 分別以丙肝核心抗原多肽和非結構抗原NS3多肽為體外剌激物，進行ELISP0T試驗，檢測試 驗組分泌Y-IFN的鼠脾細胞即形成斑點的細胞(spot forming cell，SFC)。
實驗共分2組，分別注射RAd-CNS3，空載腺病毒RAd，每組注射6只Balb/c小鼠 (雌性，4-6周齡，中山大學試驗動物中心)。后腿肌肉注射200ul， 100ul/側，RAd-CNS3組: 10"vp/小鼠，RAd組"vp/小鼠。注射后2周、4周時，每組取3只動物處死。
ELISP0T實驗動物處死后無菌取脾臟研磨制成單個細胞懸液，進行稀釋，將之加 于預先包被并封閉好的ELISP0T板96孔內(nèi)，每孔5X 105個脾細胞。加入丙肝核心抗原多 肽和非結構抗原NS3多肽(華大基因上海天源合成)作為剌激物。進行ELISPOT實驗，具 體步驟參見U-Cytech試劑盒說明書。 試驗組同時攜帶丙肝核心抗原表位和非結構抗原NS3表位，在誘導CTL反應上具有優(yōu)勢。由圖6、圖7結果可知試驗組產(chǎn)生了很強的針對丙肝核心抗原和非結構抗原NS3特 異性的CTL反應。 由上可知小鼠注射重組腺病毒RAd-CNS3后在體外經(jīng)特異性多肽剌激后能釋放
Y -IFN，從而證明重組腺病毒RAd-CNS3可以誘導機體產(chǎn)生特異性細胞免疫反應，當激活的
細胞再次遇到相同病原體時，就會釋放Y -IFN等細胞因子發(fā)揮抗病毒作用。 所以說本發(fā)明的重組腺病毒RAd-CNS3可以誘導小鼠產(chǎn)生針對HCV核心抗原特異
性CTL反應和HCV非結構抗原NS3的特異性CTL反應，從而提示重組腺病毒RAd-CNS3對丙
肝具有更好的治療作用。 SEQUENCE LISTING 〈110〉深圳市源興生物醫(yī)藥科技有限公司 〈120〉 一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體及其應用 〈160>7 〈170>PatentIn version 3. 5
〈210>1
〈211>2469
〈212>DNA
〈213〉丙型肝炎病毒
〈400〉 1atccteaacc3C3CC皿CCgccgcccacag60gacgtc皿gttcccgggcggtggtcagatcgtcggtggagtttecctgttgccgcgcagg120ggccccaggttgggtgtgcgcgcgacteggaagacttccg3gCggtC3C3acctcgtgga1803ggCg3C皿CctetccccaaggctcgccgaCCCg3gggC3ggacctgggcccagcccggg240tecccttggcccctctecggteacgagggcatggggtgggc郷atggctcctgtcaccc300cgtggctcccggcctegttggggccccacggacccccggcgteggtcgcgteatttgggt360皿ggtcatcgateccctcacatgcggcttcgccgacctcatggggt織ttccgctcgtc420ggcgcccccctegggggcgctgccagggccttggcacatggtgtccgggttctgg郷ac■ggcgtg雄t3CgC皿C3gggaatttgcccggttgctctttctctetcttcctcttggct540ctgctgtcctgcctgaccaccccagcttccgctgcgcctetcacggcctgctcccaacag6003C3CggggCCtecttggttgcatcatcactagcctcacaggccgggac皿g皿ccaggtc660g郷ggg郷ttcaggtggtctccaccgcaacacaatctttcctggcgacctgtgtcaac720ggcgtgtgttggactgtcteccatggcgccggctcteagaccttegccggccc皿皿ggt780ccgatcaccca皿tgtec3cC皿tgtgg3Ccaagacctcgttggctggcaggcgcccccc840ggggcgcgatccatgacaccatgcacctgcggcagttcggacctctecttggtC3Cg3g3■catgctgatgtcattccggtgcgccggcggggCg3C3gC3ggggg解tctactctccccc960aggcccatctcctecttgaagggctcttcg ggtggcccactgctctgccctttggggcat1020gttgtgggcatctttcgagctgccgtgtgc紅cgggggg ttgcg皿ggcggtggacttc1080gtacccgttg3gtctetggaaaccaccatg cggtctccgg tcttcacaga caactcatcc1140cccccggccgtaccgcagacatttcaagtg gcccatctec acgctcctectggcagcggc1200皿g3gC3CC3朋gtgccggctgcatetgc3 gccc朋gggt ac皿ggtgctcgtcctgaac1260
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1權利要求
一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于該載體包括重組病毒載體和編碼來自丙型肝炎病毒的至少兩個抗原序列，含B細胞和T細胞表位，該重組載體能使免疫動物產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述病毒是腺病毒，腺相關病毒等腺伴隨病毒，SV40病毒，反轉錄病毒，單純皰疹病毒和痘苗病毒。
3. 根據(jù)權利要求2所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述腺病毒是缺失性腺病毒。
4. 根據(jù)權利要求3所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述抗原序列被定位于腺病毒的El或E2或E3或E4區(qū)域。
5. 根據(jù)權利要求4所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述腺 病毒是人5型或35型或2型或6型腺病毒。
6. 根據(jù)權利要求1所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述抗 原序列通過內(nèi)部核糖體進入位點序列連接，從啟動子雙順反子地表達。
7. 根據(jù)權利要求1所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述抗原序列融合表達于載體。
8. 根據(jù)權利要求1所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述丙型肝炎病毒抗原選自核心、NS3、 NS4、 NS5和其它含T細胞表位的抗原。
9. 根據(jù)權利要求8所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述丙 型肝炎病毒抗原是核心和NS3抗原，其序列如SEQ ID N0:1所示。
10. 根據(jù)權利要求8所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于 所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS4A抗原，其序列如SEQ ID NO :2所示。
11. 根據(jù)權利要求8所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于 所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS4B抗原，其序列如SEQ ID NO :3所示
12. 根據(jù)權利要求8所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于 所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS5A抗原，其序列如SEQ ID NO :3所示。
13. 根據(jù)權利要求8所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于 所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS5B抗原，其序列如SEQ ID NO :4所示。
14. 根據(jù)權利要求l所述的一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，其特征在于所述 重組載體還含有至少一個免疫剌激物。
15. 根據(jù)權利要求14所述的重組載體，其特征在于所述免疫剌激物選自白細胞介素， 干擾素，粒細胞集落剌激因子和粒細胞_巨噬細胞集落剌激因子。
16. 根據(jù)權利要求1-15中任一項所述的重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體在制備用于 預防和治療由丙型肝炎病毒引起的疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術，尤其是涉及一種重組人丙肝病毒抗原腺病毒載體，該載體包括病毒載體和丙型肝炎病毒的至少兩個抗原序列，所述抗原含有B細胞表位和T細胞表位，該重組載體能使免疫動物產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應，從而達到預防和治療疾病的目的。同時注射本發(fā)明所述重組腺病毒載體具有高度安全性。
文檔編號A61P31/14GK101748151SQ20081024163
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權日2008年12月19日
發(fā)明者侯金林, 劉俊云, 周向軍, 唐云霞, 李進, 王戰(zhàn)會, 秦華, 鄔冬云 申請人:深圳市源興生物醫(yī)藥科技有限公司