專利名稱：丙型肝炎病毒疫苗的制作方法
丙型肝炎病毒疫苗本申請是以下申請的分案申請申請日2002年10月10日；申請?zhí)?02824665. 9 (PCT/US02/32512)；發(fā)明名稱同上。相關申請本申請要求申請日為2002年3月13日的美國臨時申請流水號60/363，774和申 請日為2001年10月11日的美國臨時申請流水號60/328，655的優(yōu)先權，以上兩份申請分 別被收作本文參考。
背景技術：
在本申請中所引用的參考文獻并非承認是本發(fā)明的現(xiàn)有技術。世界人口的大約3%受到了丙肝病毒(HCV)的感染(Wasley等，Semin. Liver Dis. 20，1-16，2000)。接觸HCV導致明顯的急性疾病的只占很小的百分比，而在大多數(shù)情 況下所述病毒會形成慢性感染，導致肝臟炎癥并且緩慢發(fā)展成肝臟衰竭和硬化(Iwarson， FEMSMicrobiol. Rev. 14，201-204，1994)。另外，流行病學調查表明，HCV在肝細胞癌的發(fā) 病方面起著重要作用(Kew, FEMS Microbiol. Rev. 14，211-220，1994，Alter, Blood 85， 1681-1695，1995)。在1992年對HCV進行常規(guī)血液篩查之前，大部分感染是通過意外接觸受感染的血 液、血液制品或移植器官而感染的。在進行HCV液篩查的地方，HCV主要是通過直接透過皮 膚接觸受感染的血液，即靜脈內用藥而感染的。較少見的傳播方法包括圍產期接觸，血液透 析，以及與 HCV 感染患者的性接觸(Alter 等，N. Engl. J. Med. 341 (8)，556-562，1999, Alter, J. Hepatol. 31Suppl. 88—91，1999. Semin. Liver. Dis. 201，1—16，2000)。HCV基因組由大約9. 5kb的單鏈RNA組成，它編碼具有大約3000個氨基酸的前 體多蛋白(Choo 等，Science 244，362-364，1989，Choo 等，Science 244，359-362，1989， Takamizawa等，J. Virol. 65，1105-1113，1991)。所述HCV多蛋白包括以下順序的病毒蛋白 C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。各個病毒蛋白是通過HCV多蛋白的蛋白水解而產生的。宿主細胞蛋白酶能釋放推 測的結構蛋白(』132，和？7，并且在810號氨基酸上產生賂2的N-末端(Mizushima等， J. Virol. 68，2731-2734，1994，Hijikata 等，P. N. A. S. USA 90，10773-10777，1993)。推測非結構蛋白NS3，NS4A, NS4B, NS5A和NS5B形成了病毒復制機制，并且是從 所述多蛋白中釋放出來的。與NS2和NS3的N-末端相關的鋅-依賴型蛋白酶負責NS2和 NS3 之間的裂解(Grakoui 等，J. Virol. 67，1385-1395，1993，Hijikata 等，P. N. A. S. USA90, 10773-10777，1993)。位于NS3的N-末端結構域中的一種特殊的絲氨酸蛋白酶，負責在 NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A 和 NS5A/NS5B 接合處的蛋白水解裂解(Bartenschlager 等，J. Virol. 67，3835-3844，1993, Grakoui 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90，10583-10587， 1993，Tomei 等，J. Virol. 67，4017-4026，1993)。NS4A 提供了 NS3 活性的輔因子(FaiIla 等，J. Virol. 68，3753-3760，1994，De Francesco 等，美國專利號 5，739，002)。 NS5A是能產生干擾素抗性的高度磷酸化的蛋白(De Francesco等，Semin. Liver Dis.，20(1),69-83，2000，Pawlotsky, ViralHepat.Suppl. 1，47-48，1999)。
NS5B提供了一種RNA-依賴型RNA聚合酶(De Francesco等，國際公開號WO 96/37619，Behrens 等，EMBO 15，12-22，1996，Lohmann 等，Virology 249，108-118，1998)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及Ad6載體和編碼含有失活的NS5B RNA-依賴型RNA聚合酶區(qū)的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸。所述核酸特別適合用作提供多種抗原的腺病 毒載體或DNA質粒疫苗的成分，用于產生針對HCV的HCV特異性細胞介導的免疫(CMI)反應。HCV特異性CMI反應表示能識別HCV抗原的細胞毒性T淋巴細胞和T輔助細胞的 產生。CMI反應還可以包括非HCV特異性免疫作用。優(yōu)選的核酸編碼Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，它基本上與 SEQ. ID. NO. 1 相似，并且具有足夠的蛋白酶活性，以便對它自身進行加工，產生基本上相似于存在于 SEQ. ID. NO. 1中的NS5B區(qū)的至少一種多肽。所產生的相當于NS5B區(qū)的多肽是無酶促活性 的。更優(yōu)選的是，所述HCV多肽具有足夠的蛋白酶活性，以便產生基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 1 中的 NS3, NS4A, NS4B, NS5A，禾口 NS5B 區(qū)的多肽。所提到的“基本上相似的序列”表示與參考序列的同一性至少為大約65%。因此， 舉例來說，具有基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的氨基酸序列的多肽，與SEQ. ID. NO. 1具有至少 大約65%的總體氨基酸同一性。相當于賂3，賂44，賂48，賂54，和賂58的多肽，與SEQ. ID. NO. 1上的相應的區(qū)具有 至少大約65%的氨基酸序列同一性。所述相應的多肽在本文中又被稱為NS3，NS4A, NS4B, NS5A 禾口 NS5B 多肽。
因此，本發(fā)明的第一方面披露了包括編碼基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列的核酸。所編碼的多肽具有足夠的蛋白 酶活性，以便對它自身進行加工，產生無酶促活性的NS5B多肽。在一種優(yōu)選實施方案中，所述核酸是能夠在需要的人細胞中表達 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的表達載體。在人細胞內的表達具有治療作用，可以有 效治療HCV感染，并且預防性治療HCV感染。表達載體包括編碼一種多肽的核苷酸序列以及進行正確轉錄和加工的調節(jié)元件。 可以存在的調節(jié)元件包括與編碼所述多肽的核苷酸天然相關的調節(jié)元件，以及不是與所述 核苷酸序列天然相關的外源調節(jié)元件。諸如外源激發(fā)子的外源調節(jié)元件可用于在特定宿主 中表達，如在人細胞中表達?？捎糜诠δ苄员磉_的調節(jié)元件的例子包括激發(fā)子，終止子，核 糖體結合位點和聚腺苷酸化信號。本發(fā)明的另一方面，披露了包括能夠在人細胞中表達基本相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表達盒的核酸。所述多肽能夠對它自身進行加 工，以便產生無酶促活性的NS5B蛋白。所述基因表達盒至少包括以下部分a)與編碼多肽的核苷酸序列轉錄性偶聯(lián)的激發(fā)子；b)與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的5'核糖體結合位點；c)與所述核苷酸序列的3'末端連接的終止子；和d)與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的3'聚腺苷酸化信號。所提到的“轉錄性偶聯(lián)”表示所述激發(fā)子的定位使得可以通過結合在所述激發(fā)子上的RNA聚合酶使核苷酸序列轉錄。轉錄性偶聯(lián)并不要求被轉錄的序列靠近所述激發(fā)子。所提到的“功能性偶聯(lián)”表示介導一種對所述核苷酸序列的作用的能力。功能性 偶聯(lián)并不需要所偶聯(lián)的序列彼此接近。與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的聚腺苷酸化信號有 利于轉錄的RNA的裂解和聚腺苷酸化。與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的5’核糖體結合位 點有利于核糖體結合。在優(yōu)選實施方案中，所述核酸是適合用于治療HCV的治療性用途或用作生產治療 載體的中間物的DNA質粒載體或腺病毒載體。治療HCV，包括主動治療HCV感染和預防性治 療HCV感染。本發(fā)明的另一方面披露了包括能夠表達基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的多肽的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表達盒的腺病毒載體，所述腺病毒載體是通過以下方法生 產的，該方法包括(a)同源重組和(b)腺病毒載體回收(rescue)。所述同源重組步驟中產 生了一種腺病毒基因組質粒。所述腺病毒載體回收步驟產生了來自所述腺病毒基因組質粒 的腺病毒載體。本文所披露的腺病毒基因組質粒包括一種重組腺病毒基因組，它具有一個在El 區(qū)上的缺失，和任選在E3區(qū)上的缺失，以及插入所述缺失區(qū)之一中的基因表達盒。所述重 組腺病毒基因組是由基本上相似于一種或多種腺病毒血清型的區(qū)域組成的。本發(fā)明的另一方面披露了包括SEQ. ID. NO. 4的核酸序列的腺病毒載體或它的衍 生物，其中，所述衍生物的存在于SEQ. ID. NO. 4上的HCV多蛋白編碼序列被SEQ. ID. NO. 3， SEQ. ID. NO. 10或SEQ. ID. NO. 11中任一個的HCV多蛋白編碼序列所取代。本發(fā)明的另一方面披露了一種包括含有編碼基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的序列的核酸的培養(yǎng)的重組細胞。所述重組細胞具有 多種用途，如用于通過載體構建方法復制編碼所述多肽的核酸。本發(fā)明的另一方面披露了一種制備包括能夠表達基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 多肽的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表達盒的腺病毒載體的方法。該方法包括以下步 驟(a)生產包括重組腺病毒基因組的腺病毒基因組質粒，它在El和E3區(qū)具有缺失，并且 具有插入所述缺失區(qū)之一中的基因表達盒，和(b)從所述腺病毒基因組質粒中回收腺病毒 載體。本發(fā)明的另一方面披露了包括用于表達基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的載體和可以藥用載體的藥物組合物。所述載體適合 給患者施用，并且在患者體內表達多肽?！盎颊摺北硎灸軌蚋腥綡CV的哺乳動物?；颊呖赡芨腥玖嘶驔]有感染HCV?；颊叩?例子有人和黑猩猩。本發(fā)明的另一方面披露了一種治療患者的方法，包括給所述 患者施用有效量的表 達基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的載體的步驟。所述 載體適合給患者施用，并且在患者體內表達多肽。進行治療的患者可能有或沒有感染HCV。對于感染了 HCV的患者來說，有效量足以 獲得以下作用中的一種或多種減弱HCV復制的能力，減少HCV負荷，提高對病毒的清除，并 且增強一種或多種HCV特異性CMI反應。對于沒有感染HCV的患者來說，有效量是足以獲 得下列一種或多種效果的用量增強產生針對HCV感染的HCV特異性CMI反應的一種或多種成分的能力，降低了對HCV感染的易感性，和減弱了傳染性病毒建立導致慢性疾病的持 久感染的能力。本發(fā)明的另一方面涉及包括Ad6區(qū)和一個不存在于Ad6中的區(qū)的重組核酸。所提 到的“重組”核酸表示存在兩個或兩個以上不是天然彼此相關的核酸區(qū)。所述Ad6重組核 酸優(yōu)選包括Ad6區(qū)和編碼與Ad6異源的多肽的基因表達盒。通過本文所提供的包括不同實施例的其他說明，可以理解本發(fā)明的其他特征和優(yōu) 點。所提供的實施例說明了用于實施本發(fā)明的不同成分和方法。這些實施例不構成對本發(fā) 明的限定。根據(jù)本發(fā)明的說明，技術人員能夠確定和采用可用于實施本發(fā)明的其他成分和 方法。附圖的簡要說明圖 IA 和 IB 表示 SEQ. ID. NO. 1。圖 2A, 2B, 2C 和 2D 表示 SEQ. ID. NO. 2。SEQ. ID. NO. 2 提供了編碼 SEQ. ID. NO. 1 的 核苷酸序列，同時提供了優(yōu)化的內部核糖體進入位點和TAAA終止序列。1-6號核苷酸提供 了優(yōu)化的內部核糖體進入位點。7-5961號核苷酸編碼HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，5137-5145號位置上的核苷酸提供了 1711-1713號氨基酸位置上的AlaAlaGly序列， 它使得NS5B失活。5962-5965號核苷酸提供了 TAAA終止序列。圖 3A, 3B, 3C 和 3D 表示 SEQ. ID. NO. 3。SEQ. ID. NO. 3 是 SEQ. ID. NO. 2 的密碼子優(yōu) 化形式。7-5961 號核苷酸編碼 HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽。圖 4A-4M 表示 MRKAd6-NSmut (SEQ. ID. NO. 4)。SEQ. ID. NO. 4 是包括一個表達盒的腺 病毒載體，其中，SEQ. ID. NO. 1的多肽是由SEQ. ID. NO. 2編碼的。堿基對1-450相當于Ad5 的堿基對1-450 ；堿基對462-1252相當于人CMV激發(fā)子；堿基對1258-1267相當于Kozak 序列；堿基對1264-7222相當于NS基因；堿基對7231-7451相當于BGH聚腺苷酸化信號； 堿基對7469-9506相當于Ad5堿基對3511-5548 ；堿基對9507-32121相當于Ad6堿基對 5542-28156 ；堿基對 32122-35117 相當于 Ad6 堿基對 30789-33784 ；堿基對 35118-37089 相 當于Ad5堿基對33967-35935。圖5A-50表示SEQ. ID. NOs. 5和6。SEQ. ID. NO. 5編碼具有有活性的RNA依賴型 RNA 聚合酶的 HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽。SEQ. ID. NO. 6 提供了所述多肽的氨
基酸序列。圖 6A-6C 提供了 pVlJnsA 的核酸序列(SEQ. ID. NO. 7)。圖7A-70提供了 Ad6基因組的核酸序列(SEQ. ID. NO. 8)。圖8A-8K提供了 Ad5基因組的核酸序列(SEQ. ID. NO. 9)。
圖9表示Ad6基因組的不同的區(qū)。線性(35759bp)ds DNA基因組用雙平行線表示， 并且被劃分成100個作圖單位。轉錄單位是以相對它們在基因組上的位置和方向形式示出 的。早期基因(E1A，E1B，E2A/B，E3*E4)是通過灰色箭頭表示的，通過黑色箭頭表示的晚 期基因(LI-L5)，是通過對由主要晚期激發(fā)子(MLP)產生的轉錄物的可變剪接而產生的，并 且它們都包括位于5'末端的三聯(lián)前導序列(1，2，3)。E1區(qū)位于大約1.0-11.5的作圖單位， E2區(qū)位于75. 0-11. 5的作圖單位，E2位于76. 1-86. 7的作圖單位，E4區(qū)位于99. 5-91. 2 的作圖單位。所述主要晚期轉錄單位位于16. 0和91. 2作圖單位之間。

圖10表示回收含有Ad6和Ad5區(qū)的pAdEl_E3+的同源重組。
圖11表示回收包括Ad6區(qū)的pAdEl_E3+的同源重組。圖12表示來自用表達不同的HCV NS盒的質粒DNA轉染的293細胞的全細胞提 取物的Western印跡。用特異性抗體檢測成熟的NS3和NS5A產物?！皃VlJns-NS 〃表 示 pVlJnsA 質粒，其中，Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽是由 SEQ. ID. NO. 5 編碼的， 并且 SEQ. ID. NO. 5 被插入 SEQ. ID. NO. 7 的 1881-1912 號堿基之間?！皃VlJns-NSmut “ 表示pVlJnsA質粒，其中，SEQ. ID. NO. 2被插入SEQ. ID. NO. 7的1882-1925號堿基之 間?！皃VlJns-NSOPTmut “表示 pVlJnsA 質粒，其中 SEQ. ID. NO. 3 被插入 SEQ. ID. NO. 7 的 1881-1905號堿基之間。圖13A禾口 13B表示通過IFNyELIspot顯示的在C57black6小鼠(A)和BalbC小 鼠(B)體內誘導的T細胞反應，包括用基因電轉移裝置(GET)分別注射25微克和50微克 的編碼不同HCV NS盒的質粒DNA。圖14表示在感染HeLa細胞之后，來自不同腺病毒載體的蛋白表達。MRKAdS-NSmut 是基于Ad5序列的腺病毒載體(SEQ. ID. NO. 9)，其中，Ad5基因組具有堿基對451-3510的El 缺失，堿基對28134-30817的E3缺失，并且具有插入450-3511號位置之間的SEQ. ID. NO. 4 的堿基對451-7468所提供的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表達盒。Ad5_NS是基于Ad5主鏈的 腺病毒載體，具有堿基對342-3523的El缺失，和堿基對28134-30817的E3缺失，并且包括 編碼來自 SEQ. ID. NO. 5 的 NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 的表達盒?！癕RKAd6_NS0PTmut 〃 表 示具有修飾過的SEQ. ID. NO. 4序列的腺病毒載體，其中，SEQ. ID. NO. 4的堿基對1258-7222 被SEQ. ID. NO. 3所取代。圖15表示由IFN γ ELIspot顯示的通過兩次注射109vp含有不同HCV非結構基因 盒的腺病毒載體，在C57black6小鼠體內誘導的T細胞反應。圖16A-16D表示由I FN y EL I s po t顯示的通過一次或兩次注射10lclvp(A)或 IO11Vp(B)含有不同HCV非結構基因盒的腺病毒載體，在獼猴體內誘導的T細胞反應。圖17A和17B表示由IFNyELIspot顯示的通過兩次注射IOicVp(A)或IO11Vp(B) 編碼不同HCV非結構基因盒的腺病毒載體，在獼猴體內誘導的CD8+T細胞反應。圖18A-18F表示由大量CTL分析顯示的通過兩次注射IO1Vp的Ad5_NS (A)， MRKAdS-NSmut (B)，或MRKAd6_NSmut (C)在獼猴體內誘導的T細胞反應。圖19表示質粒pE2。圖 20A-D 表示部分密碼子優(yōu)化序列 NSsuboptmut (SEQ. ID. N0. 10)。 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的編碼序列是從7-5961號堿基。本發(fā)明的詳細說明本發(fā)明涉及Ad6載體和編碼含有失活的NS5B區(qū)的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B 多肽的核酸。提供失活的NS5B區(qū)，提供了 NS5B抗原，同時降低了由活性病毒RNA聚合酶導 致的不利副作用的可能性。所述核酸的用途包括用作疫苗成分，以便將HCV多肽導入細胞， 它能提供用于產生針對HCV的CMI反應的多種抗原，并且用作用于生產所述疫苗成分的中 間產物。適應性細胞免疫反應，由于主要組織相容性復合物(MHC) I型和II型表達的普遍 分布，起著能夠在整體身體內的HCV感染的細胞中識別病毒抗原的作用，以便誘導免疫學 記憶，并且保持免疫學記憶。上述功能是由抗原特異性⑶4+T輔助細胞(Th)和⑶8+細胞毒性T細胞(CTL)提供的。在通過它們的特異性T細胞受體激活之后，HCV特異性Th細胞實現(xiàn)了多種免疫調 控功能，其中大部分功能是通過Thl和Th2細胞因子介導的。HCV特異性Th細胞有助于B 細胞的激活和分化，并且有助于病毒特異 性細胞毒性T細胞的誘導和刺激。Th細胞與CTL 一起還能分泌能抑制若干病毒的復制和基因表達的IFN-γ和TNF-α。另外，Th細胞和CTL 即主要效應細胞，可以誘導病毒感染過的細胞的程序凋亡和裂解。HCV特異性CTL是由專門的抗原呈遞細胞(pAPCs)加工的抗原產生的?？乖梢?是在pAPCs內合成的或者是導入的。PAPC中的抗原合成，可以通過將編碼序列所述抗原的 表達盒導入所述細胞而完成。施用核酸疫苗的一種優(yōu)選途徑是肌內途徑。肌內施用似乎會導致將核酸導入體細 胞和pAPCs，并且在那里表達。在所述體細胞中產生的HCV抗原可以轉移到pAPCs，以便在 I 類 MHC 分子中呈遞(Donnelly 等，Annu. Rev. Immunol. 15 :617_648，1997)。PAPCs在蛋白酶體復合物中將較長的抗原加工成較小的肽抗原。所述抗原被轉運 到內質網(wǎng)/高爾基復合體分泌途徑中，以便與I類MHC蛋白結合。CD8+T淋巴細胞通過T細 胞受體(TCR)和CD8細胞表面蛋白識別與I類MHC結合的抗原。用編碼Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸作為疫苗成分，可以從一種單 一載體生產多種能夠產生CMI反應的抗原。所述多肽應當能夠對它自身進行充分加工，以 便產生至少一個相當于NS5B的區(qū)。優(yōu)選的核酸編碼基本上相似于SEQ. ID. NO. 1的氨基酸 序列，它具有足夠的蛋白酶活性，以便對它自身進行加工，產生基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 1 上的 NS3, NS4A, NS4B, NS5A 和 NS5B 的各個 HCV 多肽?；旧舷嗨朴赟EQ. ID. NO. 1的多肽，具有足夠的蛋白酶活性，在細胞中對它自身 進行加工，給所述細胞提供存在于若干不同HCV菌株中的T細胞表位。蛋白酶活性是由NS3 和NS3/NS4A蛋白提供的，在合適的裂解位點上消化Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽， 以便釋放相當于賂3，賂4六，賂48，賂5六，和賂58的多肽。Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B的 自我加工，產生了接近天然存在的HCV多肽的多肽。根據(jù)本文所提供的指導，可以產生足夠強的免疫反應，以便在患者體內獲得有益 作用。所提供的指導包括與HCV序列選擇，載體選擇，載體生產，組合治療和施用相關的信 肩、οI. HCV 序列可以將多種不同的核酸序列用作疫苗成分，以便給細胞提供 HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，或作為生產疫苗成分的中間物。用于獲得合適核 酸序列的起點，優(yōu)選是被修飾而產生失活的NS5B的天然存在的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽。在以下文獻中披露了利用HCV核酸序列提供HCV非結構抗原，以便產生CMI反應 Cho 等，Vaccinel7 :1136_1144，1999，Paliard 等，國際公開號 W001/30812 (并不被認為是 本發(fā)明的現(xiàn)有技術)，和Coit等，國際公開號W001/38360(并不被認為是本發(fā)明的現(xiàn)有技 術)。例如，所述文獻沒有披露對它自身進行加工以便產生失活的NS5B的多肽，特別是沒有 披露HCV序列與本文所采用的遞送載體的組合。對HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽序列的修飾，可以通過改變其編碼核酸而產生。可以進行改變，以便產生缺失，插入和取代。可以在NS5B上進行小的修飾，以便通過導向于復制所必需的基序產生失活的聚 合酶。NS5B活性所必需的基序的例子，以及為了生產失活的NS5B而可以進行的修飾披露 于以下文獻中Lohmann等，Journal of Virology 71 :8416_8426，1997，和Kolykhalov等， Journal of Virology 74 :2046_2051，2000。在產生對HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的修飾時需要考慮的其他因 素，包括保持自身加工的能力和保持T細胞抗原。HCV多肽進行自身加工的能力，在很大程 度上是通過功能性NS3蛋白酶確定的。能保持NS3活性蛋白酶活性的修飾，可以通過NS3 蛋白，用作NS3的輔因子的NS4A，和存在于NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽中的NS3蛋白酶 識別位點而獲得。可以對天然存在的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽序列進行不同的修飾，以便產 生能夠誘導多種T細胞反應的多肽。影響一種多肽誘導多種T細胞反應的能力的因素，包 括HCV特異性T細胞抗原區(qū)的保存或導入，以及不同T細胞抗原區(qū)在不同HCV分離物中的 優(yōu)勢。天然存在的HCV分離物的多種例子為本領域所熟知。HCV分離物可以劃分成以下 六種包括一種或多種亞型的主要基因型HCV-l/(la，lb，lC)，HCV-2/(2a,2b,2c), HCV-3/ (3a,3b,10a), HCV—4/(4a)，HCV_5/(5a)禾口 HCV—6/(6a，6b，7b，8b，9a，1la)(Simmonds， J. Gen. Virol.，693-712，2001)。諸如 HCV-BK, HCV-J, HCV-N, HCV-H 的特定 HCV 序列的例 子，業(yè)已在GenBank保藏，并且在多個文獻中披露(例如，參見Chamberlain等，J. Gen. Virol.，1341-1347，1997)。例如，HCV T細胞抗原可以通過經驗性實驗鑒定。鑒定T細胞抗原的一種方法包 括用較大長度的多肽產生一系列重疊的短肽，然后從受感染的患者中篩選T細胞群體的陽 性克隆。陽性克隆是通過特定肽激活/激發(fā)的。可以將諸如IFNY-ELISP0T，IFNy-細胞 內染色和大量(bulk) CTL分析的技術用于測定肽活性。由此鑒定的肽可以視為代表了各病 原體的T細胞表位。例如，通過生產包括來自兩種或兩種以上天然存在的序 列的區(qū)域的雜合 NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，可以將來自不同HCV分離物的HCV T細胞抗原區(qū)導入一種 單一序列。所述雜合體可以包括其他修飾，所述修飾優(yōu)選不會減弱所述多肽產生HCV CMI 反應的能力?？梢杂帽疚乃兜幕驗楸绢I域所熟知的技術，確定修飾過的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽對它自身進行加工，并且產生CMI反應的能力。所述 技術包括使用IFN y -ELISPOT, IFN γ -細胞內染色和大量CTL分析，測定HCV特異性CMI反應。A. Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 序列SEQ. ID. NO. 1 提供了 優(yōu)選的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B 序列。SEQ. ID. NO. 1 包 括大量的HCV特異性T細胞抗原，這些抗原存在于若干不同的HCV分離物中。SEQ. ID. NO. 1 與HCV BK菌株核苷酸序列(GenBank保藏號M58335)的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B部分相 似。在SEQ. ID. NO. 1中，對于I類MHC分子識別來說，重要的錨定位點是保守的或代表HCV多蛋白的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B部分上的20種已知T細胞表位中的18種的保守 性取代。就其余兩種已知的T細胞表位而言，一種在SEQ. ID. NO. 1上具有一個非保守性錨 定取代，該取代仍然能被不同的HLA超類型識別，而一種表位具有一個不是保守的錨定殘 基。HCV T-細胞表位披露于以下文獻中Chisari 等，Curr. Top. Microbiol Immunol.，242 299-325，2000，和 Lechner 等 J. Exp. Med. 9 1499-1512，2000。HCV-BK NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 核苷酸序列和 SEQ. ID. NO. 1 之間的差別包括 在5，末端引入一個甲硫氨酸，以及修飾過的NS5B活性位點殘基在SEQ. ID. NO. 1上的存在。 所述修飾將GlyAspAsp換成了 AlaAlaGly (1711-1713號殘基)，以便使NS5B失活。所編碼的HCVMet-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，優(yōu)選具有基本 上相似于SEQ. ID. NO. 1的氨基酸序列。在不同的實施方案中，所編碼的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽，與 SEQ. ID. NO. 1 的氨基酸同一'性為至少 65%，至少 75%，至少 85%，至少 95%，至少 99%或 100% ；或與 SEQ. ID. NO. 1 具有 1-2，1-3，1-4，1-5， 1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11,1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17,1-18,1-19,或 1-20 個氨 基酸的差別。Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 多肽和 SEQ. ID. NO. 1 之間的氨基酸差別，是通過 確定兩種序列不同的氨基酸修飾的最低數(shù)量計算的。氨基酸修飾可以是缺失，添加，取代或 它們的任意組合。氨基酸序列同一性，是通過本領域眾所周知的方法確定的，所述方法將一種多肽 的氨基酸序列與第二種多肽的氨基酸序列進行比較，并且產生一種序列比對。氨基酸同一 性是通過所述比對計算的，包括統(tǒng)計具有相同氨基酸的比對的殘基對的數(shù)量。用于確定序列同一性的方法包括披露于以下文獻中的方法Schuler，G. D. in Bioinformatics :A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins， Baxevanis, A. D.禾口 Ouelette，B. F. F.，eds.，John Wiley&Sons, Inc，2001 ；Yona，等，in Bioinformatics :Sequence，structure and databanks，Higgins，D.and Taylor, W. eds, Oxford University Press,2000 ；andBioinformatics :Sequence and Genome Analysis, Mount，D. W.，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001o 確定氨基酸序列同一 性的方法，在可公幵獲得的計算機程序中進行了匯編，如GAP (Wisconsin Package Version 10. 2, Genetics Computer Group (GCG)，Madison，Wise), BLAST (Altschul 等，J. Mol. Biol.215(3) 403-10,1990),禾P FASTA(Pearson，Methods in Enzymology 183:63-98， 1990，R. F. Doolittle，ed)。
在本發(fā)明的一種實施方案中，兩種多肽之間的序列同一性是通過使用GAP程序 石角定的(Wisconsin Package Version 10. 2, GeneticsComputer Group (GCG), Madison, Wise)。GAP 采用了 Needleman 和 Wunsch 的比對方法(Needleman,等，J. Mol. Biol. 48 443-453，1970)。GAP考慮了兩種序列之間的所有可能的比對和空位位置，并且產生一種 將匹配的殘基數(shù)量最大化以及將空位的數(shù)量和大小最小化的總體比對。利用一種評分距陣 確定符號匹配值。另外，為了限制向所述比對中插入空位，需要空位產生罰分和空位延伸罰 分。利用GAP進行多肽比較的默認程序參數(shù)是BL0SUM62 (Henikoff等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 10915-10919，1992)氨基酸評分距陣(MATrix = blosum62. cmp)，空位產生參 數(shù)(GAP權重=8)，而空位延伸參數(shù)(LENgth權重=2)。
更優(yōu)選的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽，除了在它們的整個長度上基 本上相似于SEQ. ID. NO. 1之外，還能產生基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 1上的相應的區(qū) 域的各個NS3，NS4A, NS4B, NS5A和NS5B區(qū)，SEQ. ID. NO. 1上的相應的區(qū)是以如下形式提供 的Met-NS3的1-632號氨基酸；NS4A的633-686號氨基酸；NS4B的687-947號氨基酸；NS5A 的948-1394號氨基酸和NS5B的1395-1985號氨基酸。在不同實施方案中，NS3，NS4A, NS4B, NS5A和/或NS5B區(qū)與SEQ. ID. NO. 1上的相 應區(qū)域的氨基酸同一性為至少65 %，至少75 %，至少85 %，至少95 %，至少99 %或100 % ；或 具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7,1-8,1-9,1-10,1-11,1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17, 1-18，1-19，或1-20個氨基酸的氨基酸差別。SEQ. ID. NO. 1的氨基酸修飾，優(yōu)選保持了所有的或大部分的T細胞抗原區(qū)。天然 存在的氨基酸差別，是由于不同的氨基酸側鏈(R基團)產生的。R基團能影響氨基酸的不 同的性質，如物理尺寸，電荷，和疏水性?？梢詫被釀?分成以下不同類型中性和疏水性 (丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，和甲硫氨酸)；中性和極性 (甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺)；堿性(賴氨酸，精氨 酸，和組氨酸)；和酸性(天冬氨酸和谷氨酸)。一般，在取代不同的氨基酸時，優(yōu)選用具有相似性質的氨基酸取代。在特定類型內 部取代不同的氨基酸，如用纈氨酸取代亮氨酸，用精氨酸取代賴氨酸，和用天冬酰胺取代谷 氨酰胺是不會導致多肽三級結構改變的很好的候選取代?；谔囟ǖ陌被嵝蛄泻鸵阎倪z傳密碼的間并性，可以獲得大量不同的編碼 核酸序列。遺傳密碼的間并性是由于幾乎所有氨基酸都是由核苷酸三聯(lián)體或"密碼子" 的不同組合編碼的。特定密碼子翻譯成特定氨基酸為本領域所熟知(例如，參見Lewin GENESIV, p. 119，Oxford University Press, 1990)。氨基酸是由以下密碼子編碼的A = Ala =丙氨酸密碼子 GCA，GCC, GCG, GCUC = Cys =半胱氨酸密碼子UGC，UGUD = Asp =天冬氨酸密碼子GAC，GAUE = Glu =谷氨酸密碼子 GAA，GAGF = Phe =苯丙氨酸密碼子UUC，UUUG = Gly =甘氨酸密碼子 GGA，GGC, GGG, GGUH = His =組氨酸密碼子 CAC，CAUI = Ile =異亮氨酸密碼子 AUA，AUC，AUUK = Lys =賴氨酸密碼子 AAA，AAGL = Leu =亮氨酸密碼子 UUA，UUG, CUA, CUC，CUG，CUUM = Met =甲硫氨酸密碼子AUGN = Asn =天冬酰胺密碼子AAC，AAUP = Pro =脯氨酸密碼子 CCA，CCC, CCG, CCUQ = Gln =谷氨酰胺密碼子CAA，CAGR = Arg =精氨酸密碼子 AGA, AGG，CGA, CGC, CG G, CGUS = Ser =絲氨酸密碼子 AGC，AGU, UCA，UCC, UCG, UCUT = Thr =蘇氨酸密碼子 ACA，ACC, ACG, ACU
V = Val =纈氨酸密碼子GUA，⑶C，⑶G，⑶UW = Trp =色氨酸密碼子UGGY = Tyr =酪氨酸密碼子 UAC，UAU?？梢詢?yōu)化核酸序列，以便增強在宿主中的表達。要考慮的因素包括C:G含量，優(yōu)選 的密碼子，以及避免抑制性二級結構。所述因素能夠以不同的方式組合，以便獲得在特定宿 主中具有增強了的表達的核酸序列(例如，參見Donnelly等，國際公開號WO 97/47358)。特定序列在特定宿主中具有增強了的表達的能力涉及某些經驗實驗。所述實驗包 括測定保護性核酸序列的表達，以及，如果必要的話，改變所述序列。B.編碼核苷酸序列SEQ. ID. NOs. 2 和 3 提供 了編碼 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A_NS5B 序列的核苷酸 序列的兩種例子。SEQ. ID. NO. 2的編碼序列，與天然存在的HCV-BK序列(GenBank保藏 號 M58335)的 NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 區(qū)相似(核苷酸序列同一'性為 99. 4 % )，SEQ. ID. NO. 3是SEQ. ID. NO. 2的密碼子優(yōu)化形式。SEQ. ID. NOs. 2和3具有78. 3%的核苷酸序列 同一性。HCV-BK NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 核苷酸(GenBank 保藏號 M58335)和 SEQ. ID. NO. 2之間的差別，包括SEQ. ID. NO. 2具有一個核糖體結合位點，一個ATG甲硫氨酸密碼 子，一個編碼修飾過的NS5B催化結構域的區(qū)，一種TAAA終止信號和另外30個核苷酸的差 另U。編碼AlaAlaGly(1711-1713號殘基)的修飾過的催化結構域取代了 GlyAspAsp，以便使 NS5B失活。編碼HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核苷酸序列，優(yōu)選基本上相似于 SEQ. ID. NO. 2的編碼區(qū)。在不同實施方案中，編碼HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多 肽的核苷酸序列，與SEQ. ID. NO. 2編碼區(qū)的核苷酸序列的同一性為至少65%，至少75%， 至少 85%，至少 95%，至少 99%，或 100% ；或與 SEQ. ID. NO. 2 具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6， 1-7，1-8，1-9，1-10，1-11，1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17,1-18,1-19,1-20,1-25,1-30, 1-35，1-40，1-45，或1-50個核苷酸的差別。編碼Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的序列和SEQ. ID. NO. 2編碼區(qū)之間的核苷酸 差別，是通過確定兩種序列差別的核苷酸修飾的最低數(shù)量計算的。核苷酸修飾可以是缺失， 添加，取代或它們的任意組合。核苷酸序列同一性，是通過本領域熟知的方法確定的，該方法比較了一種序列的 核苷酸序列和另一種序列的核苷酸序列，以便產生一種序列比對。序列同一性是根據(jù)所述 比對，通過統(tǒng)計具有相同核苷酸的比對位置的數(shù)量確定的。用于確定兩種多核苷酸之間的核苷酸序列同一性的方法，包括披露于以下文獻中 的方法Schuler，in Bioinformatics :A PracticalGuide to the Analysis of Genes and Proteins，Baxevanis,A. D.禾口 Ouelette，B. F. F.，eds.，John Wiley&Sons,Inc，2001 ；Yona 等，.in Bioinformatics :Sequence， structure anddatabanks， Higgins， D.禾口 Taylor， W.eds, Oxford UniversityPress,2000 ；and Bioinformatics :Sequence and Genome Analysis, Mount，D. W.，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001。確定核苷酸 序列同一性的方法，在可公幵獲得的計算機程序中進行了匯編，如GAP (Wisconsin Package Version 10. 2, Genetics ComputerGroup (GCG)，Madison，Wise), BLAST (Altschul 等，J. Mol.Biol. 215(3) :403_10，1990)，和FASTA(Pearson，W. R. ,Methods inEnzymology 183 63-98，1990，R.F. Doolittle, ed)。在本發(fā)明的一種實施方案中，兩種多核苷酸之間的序列同一性，是通過采用GAP 石角定的(Wisconsin Package Version 10. 2, GeneticsComputer Group (GCG), Madison, Wise)。GAP 采用 了 Needleman 和 Wunsch 的比對方法(Needleman 等，J. Mol. Biol. 48 443-453，1970)。GAP考慮了兩種序列之間所有可能的比對和空位位置，并且產生了使匹配 的殘基數(shù)量最大化，并且使空位的數(shù)量和大小最小化的總體比對。用一種評分距陣確定符 號匹配值。另外，需要用空位產生罰分和空位延伸罰分來限制將空位插入所述比對中。采 用GAP的多核苷酸比較的默認程序參數(shù)是nwsgapdna. cmp評分距陣(MATrix = nwsgapdna. cmp)，空位產生參數(shù)(GAP權重=50)和空位延伸參數(shù)(LENgth權重=3)。更優(yōu)選的HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B核苷酸序列，除了在其整個長度 上基本上相似之外，產生了基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 2中的相應區(qū)域的各個NS3， NS4A，NS4B，NS5A和NS5B區(qū)。SEQ. ID. NO. 2上的相應的編碼區(qū)是以如下形式提供的Met_NS3 的7-1902號核苷酸；NS4A的1903-2064號核苷酸；NS4B 2065-2847號核苷酸；NS5A的 2848-4188號核苷酸；NS5B的4189-5661號核苷酸。在不同實施方案中，NS3，NS4A, NS4B, NS5A和/或NS5B編碼區(qū)與SEQ. ID. NO. 2上 的相應的區(qū)域上的核苷酸序列同一性為至少65 %，至少75 %，至少85 %，至少95 %，至少 99%，或 100% ；或與 SEQ. ID. NO. 2 具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7，1-8，1-9，1-10，1-11， 1-12，1-13，1-14，1-15，1-16,1-17,1-18,1-19,1-20,1-25,1-30,1-35,1-40,1-45,或 1-50 個核苷酸的差別。C.基因表達盒基因表達盒包括多肽表達所需要的元件。所提到的“多肽”沒有提供大小限制，并 且包括蛋白。存在于基因表達盒中的調節(jié)元件通常包括(a)與編碼所述多肽的核苷酸序 列轉錄性偶聯(lián)的激發(fā)子，(b)與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的5'核糖體結合位點，(c)與 所述核苷酸序列的3'末端連接的終止子，和(d)與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的3'聚腺 苷酸化信號。還可以存在用于增強或調控基因表達或多肽加工的其他調節(jié)元件。激發(fā)子是由RNA聚合酶識別，并且介導下游區(qū)域轉錄的遺傳元件。優(yōu)選的激發(fā)子 是強激發(fā)子，它能提供較高水平的轉錄。強激發(fā)子的例子包括立即早期人巨細胞病毒激發(fā) 子(CMV)，和具有內含子 A 的 CMV (Chapman 等，Nucl. Acids Res. 19 :3979_3986，1991)。激發(fā) 子的其他例子包括天然存在的激發(fā)子，如EFl α激發(fā)子，鼠CMV激發(fā)子，Rous肉瘤病毒激發(fā) 子，和SV40早期/晚期激發(fā)子和β-肌動蛋白激發(fā)子；以及人工激發(fā)子，如合成的肌肉特異 性激發(fā)子和嵌合型肌肉_特異性/CMV激發(fā)子(Li等，Nat. Biotechnol. 17 =241-245,1999， Hagstrom 等，Blood 95 :2536_2542，2000)。所述核糖體結合位點位于起始密碼子上或靠近起始密碼子。優(yōu)選的核糖體結合位 點的例子包括CCACCAUGG，CCGCCAUGG,和ACCAUGG，其中AUG是起始密碼子(Kozak，Cell44 283-292，1986)。核糖體結合位點的另一種例子是 GCCACCAUGG (SEQ. ID. NO. 12)。聚腺苷酸化信號負責裂解轉錄的RNA，并且在所述RNA上添加poly (A)尾。高等真 核生物中的聚腺苷酸化信號包括AAUAAA序列，距離聚腺苷酸化添加位點大約11-30個核苷 酸。AAUAAA 序列參與 RNA 裂解的信號傳遞(Lewin，Genes IV，Oxford University Press,NY，1990)。poly (A)尾對于mRNA加工來說是重要的?？梢杂米骰虮磉_盒的一部分的聚腺苷酸化信號，包括最小兔珠蛋白聚腺苷 酸化信號和牛生長激素聚腺苷酸化(BGH) (Xu等，Gene272 =149-156, 2001, Post等，美國專 利U. S. 5，122，458)。其他例子包括合成的聚腺苷酸化信號(SPA)和SV40聚腺苷酸化信 號。所述 SPA 序列如下AAUAAAAGAUCUUUAUUUUCAUUAGAUCUGUGUGUUGGUUUUUU⑶⑶G (SEQ. ID. NO. 13)?？梢源嬖诘挠糜谠鰪娀蛘{控基因表達或多肽加工的其他調節(jié)元件的例子，包括 增強子，前導序列和操縱子。增強子區(qū)能增強轉錄。增強子區(qū)的例子包括CMV增強子和 SV40 增強子(Hitt 等，Methods inMolecular Genetics 7 13-30，1995，Xu，等，Gene 272 149-156,2001)。增強子區(qū)可以與激發(fā)子結合。
前導序列是多肽上的氨基酸區(qū)，它能引導所述多肽進入蛋白酶體。編碼序列所述 前導序列的核酸是結構基因的5'末端，并且是隨所述結構基因一起轉錄的。前導序列的例 子是tPA?？梢杂貌倏v子序列調控基因表達。例如，可以利用Tet操縱子序列抑制基因表達。II.治療性載體可以用適合治療性施用的載體將編碼Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核 酸導入患者體內。合適的載體能夠將核酸遞送到靶細胞中，而又不會導致不可接受的副作用。細胞表達是利用編碼Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表達盒實現(xiàn)的。 所述基因表達盒包括用于在靶細胞內產生并且加工足夠數(shù)量的核酸，以便獲得有利效果的 調節(jié)元件?？捎糜谥委熜杂猛镜妮d體的例子包括第一和第二代腺病毒載體，輔助依賴型 腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，逆轉錄病毒載體，α病毒載體，Venezuelan馬腦炎病毒 載體，和質粒載體(Hitt 等，Advancesin Pharmacology 40 137-206，1997，Johnston 等，美國專利號6，156，588，和Johnston等，國際公開號WO 95/32733)。用于將 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽導入對象體內的優(yōu)選載體，是第一代腺病毒載體和質 粒DNA載體。A.第一代腺病毒載體用于表達基因表達盒的第一代腺病毒載體，包括El和任選的E3缺失重組腺病毒 基因組內的表達盒。El區(qū)上的缺失足夠大，以便去除腺病毒復制所必需的元件。用于表達Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的第一代腺病毒載體，包括El和 E3缺失的重組腺病毒基因組。El區(qū)的缺失足夠大，以便去除腺病毒復制所必需的元件。El 和E3區(qū)缺失的組合足夠大，以便能容納編碼Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的基因表 達盒。所述腺病毒具有雙鏈線性基因組，在兩端具有反向末端重復。在病毒復制期間，將 所述基因組包裝在病毒衣殼內，以便形成毒粒。所述病毒通過病毒附著以及隨后的內化，進 入它的靴細胞(Hitt 等，Advances in Pharmacology 40 137-206，1997)。腺病毒載體可以基于不同的腺病毒血清型，如出現(xiàn)在人或動物體內的血清型。動 物腺病毒的例子包括牛，豬，黑猩猩，鼠，犬和禽(CELO)腺病毒。優(yōu)選的腺病毒載體是基于人血清型的，更優(yōu)選基于B，C或D型血清型。人腺病毒B，C，D或E血清型的例子包括2型 (“Ad2" )，4型(“Ad4" )，5型(“Ad5" )，6型(“Ad6" )，24 型(〃 Ad24" )，26 型 (〃 Ad26〃)，34型(〃 Ad34〃)和35型(〃 Ad35〃)。腺病毒載體可以包括來自單一腺 病毒或來自兩種或兩種以上腺病毒的區(qū)域。 在不同的實施方案中，腺病毒是基于Ad5，Ad6，或它們的組合的。Ad5披露于以下 文獻中Chroboczek 等，J. Virology 186 :280_285，1992。Ad6 披露于圖 7A-7N 中。包括 Ad5 區(qū)的基于Ad6的載體披露于下面所提供的實施例部分。腺病毒載體不一定完全去掉了它們的El和E3區(qū)。相反，去掉了足夠數(shù)量的El區(qū)， 使得在缺乏El蛋白的條件下，不能復制的載體是以反式形式提供的；并且El缺失和El或 E3缺失的組合大到足夠容納一個基因表達盒。El缺失可以從Ad5的大約堿基對342開始一直進行到大約堿基對3523，或相當于 來自其他腺病毒的區(qū)域。所缺失的區(qū)域包括去掉從Ad5的大約堿基對450到大約堿基對 3511的區(qū)域，或來自其他腺病毒的相應區(qū)域。始于大約堿基對341的較大的El區(qū)缺失，去 掉了有利于病毒包裝的元件。E3缺失能夠從Ad5的大約27865號堿基對到大約30995號堿基對，從或者其他腺 病毒載體的相應的區(qū)域獲得。所述缺失區(qū)優(yōu)選包括去掉了從Ad5的大約28134號堿基對到 大約30817號堿基對的區(qū)域，或其他腺病毒載體的相應的區(qū)域。El區(qū)以及任選的E3區(qū)的缺失的組合應當足夠大，以便包括所述基因表達盒的 重組基因組的總體大小，不超過野生型腺病毒基因組的大約105%。例如，當重組腺病毒 Ad5基因組的大小增加超過大約105%時，所述基因組會變得不穩(wěn)定(Bett等，Journal of Virology 67:5911-5921,1993)。包括所述基因表達盒的重組腺病毒基因組的大小優(yōu)選為野生型腺病毒基因組的 大約85% -大約105%。在不同實施方案中，包括所述表達盒的重組腺病毒基因組的大小 為野生型基因組大小的大約100% -大約105. 2%，或大約100%。可以將大約7，500kb插入具有El和E3缺失的腺病毒基因組中。在沒有任何缺失 的情況下，Ad5基因組為35，935個堿基對，而Ad6基因組為35，759個堿基對。第一代腺病毒載體的復制可以通過提供反式El基因產物而實現(xiàn)。El基因產物能 夠以反式形式提供，例如，通過使用業(yè)已用腺病毒El區(qū)轉化過的細胞系。用腺病毒El區(qū) 轉化過的細胞和細胞系的例子有HEK 293細胞，911細胞，PERC. 6 細胞和轉染過的原代人 aminocytes 細胞(Graham Journal of Virology 36 :59_72,1977, Schiedner 等，Human Gene Therapy 11 :2105_2116，2000，F(xiàn)allaux等，Human Gene Therapy 9:1909-1917,1998， Bout等，美國專利號6，033，908)。應當將Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表達盒插入重組腺病毒基因組的相當于 缺失的El區(qū)或缺失的E3區(qū)的區(qū)域。所述表達盒可以具有平行的或反向平行的取向。在平 行取向中，所述插入基因的轉錄方向與缺失的El或E3基因的方向相同。在反向平行取向 的轉錄中，將相反的鏈用作模板，而轉錄方向是沿相反方向進行的。在本發(fā)明的一種實施方案中，所述腺病毒載體具有插入到El缺失區(qū)的基因表達 盒。該載體包括a)從相當于Ad5或Ad6的大約堿基對1到大約堿基對450的第一腺病毒區(qū)；
b)與所述第一區(qū)連接的El平行或El反向平行取向的基因表達盒；c)與所述表達盒連接的從相當于Ad5的大約堿基對3511到大約堿基對5548的第 二腺病毒區(qū)或從相當于Ad6的大約堿基對3508到大約堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；d)與所述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對5549到大約堿基對28133或 從相當于Ad6的大約堿基對5542到大約堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；e)與所述第三區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對30818到大約堿基對33966或 從相當于Ad6的大約堿基對30789到大約堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和f)與所述第四區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對33967到大約堿基對35935或 從相當于Ad6的大約堿基對33785到大約堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。在本發(fā)明的另一種實施方案中，所述腺病毒載體具有插入到E3缺失區(qū)的表達盒。 該載體包括a)從相當于Ad5或Ad6的大約堿基對1到大約堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對3511到大約堿基對5548或從 相當于Ad6的大約堿基對3508到大約堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；c)與所述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對5549到大約堿基對28133或 從相當于Ad6的大約堿基對5542到大約堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；d)與所述第三區(qū)連接的E3平行或E3反向平行取向的基因表達盒；e)與所述基因表達盒連接的從相當于Ad5的大約堿基對30818到大約堿基對 33966或從相當于Ad6的大約堿基對30789到大約堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和f)與所述第四區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對33967到大約堿基對35935或 從相當于Ad6的大約堿基對33785到大約堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。在涉及腺病毒區(qū)的優(yōu)選的不同實施方案中，存在(1)相當于Ad5的第一，第二，第 三，第四，和第五區(qū)；(2)相當于Ad6的第一，第二，第三，第四，和第五區(qū)；和(3)相當于Ad5 的第一區(qū)，相當于Ad5的第二區(qū)，相當于Ad6的第三區(qū)，相當于Ad6的第四區(qū)，和相當于Ad5 的第五區(qū)。B. DNA質粒載體DNA疫苗質粒載體包括一個基因表達盒和有利于復制并且優(yōu)選有 利于載體選擇的 元件。優(yōu)選的元件提供了用于在非哺乳動物細胞中復制的元件和選擇標記。所述載體應當 不包括提供在人細胞中復制的元件或用于整合到人核酸中的元件。有利于核酸選擇的選擇標記包括所述標記。優(yōu)選的選擇標記是能產生抗生素抗性 的標記?？股剡x擇基因的例子，包括編碼氨芐青霉素，新霉素，和卡那霉素抗性的核酸?？梢杂煤屑毦鷱椭破瘘c和選擇標記的質粒起始生產合適的DNA疫苗載體。能提 供較高產量的細菌復制起點的例子，包括ColEl質粒-衍生的細菌復制起點(Donnelly等， Annu.Rev. Immunol. 15 :617_648，1997)。細菌復制起點和選擇標記的存在，使得能夠在諸如大腸桿菌的細菌菌株中生產 DNA載體。利用選擇標記排除不包括DNA載體的細菌。III.AD6 重組核酸Ad6重組核酸包括基本上相似于存在于SEQ. ID. NO. 8中的Ad6區(qū)的Ad6區(qū)，和不存 在于Ad6核酸中的區(qū)域。包括Ad6區(qū)的重組核酸具有不同的用途，如用于生產不同的Ad6區(qū)，作為生產基于Ad6的載體的中間物，以及用作遞送重組基因的載體。如圖9所示，Ad6的基因組組構與Ad5的基因組組構非常相似。Ad5和Ad6之間的 同源性大約為98%。在不同實施方案中，Ad6重組核酸包括基本上相似于E1A，ElB, E2B, E2A，E3，E4， Li，L2，L3，或L4的核苷酸區(qū)，或它們的任意組合。與Ad6區(qū)基本上相似的核酸區(qū)具有至 少65%，至少75%，至少85%，至少95%，至少99%或100%的核苷酸序列同一性；或具有 1-2，1-3，1-4，1-5，1-6，1-7,1-8,1-9,1-10,1-11,1-12,1-13,1-14,1-15,1-16,1-17,1-18, 1-19，1-20，1-25，1-30，1-35,1-40,1-45，或1-50個核苷酸的核苷酸差別。在上文的I. B.節(jié) 中披露了用于確定基本上相似的核酸序列的技術和實施方案。重組Ad6核酸優(yōu)選包括編碼不存在于Ad6中的多肽的表達盒。 表達盒的例子包 括編碼HCV區(qū)的表達盒，和編碼其他類型多肽的表達盒?？梢圆捎貌煌康腁d6生產不同類型的腺病毒載體，如第一代和第二代腺病毒載 體。正如在上文的II. A.節(jié)中所指出的，第一代腺病毒載體是El缺陷型的，并且在提供反 式El時能夠復制。第二代腺病毒載體包括比第一代載體少的腺病毒基因組，并且可用于與互補的 細胞系和/或補充腺病毒蛋白的輔助載體連接。在不同的參考文獻中，披露了第二代 腺病毒載體，如 Russell，Journal ofGeneral Virology 81 :2573_2604，2000 ;Hitt 等， 1997, HumanAd vectors for Gene Transfer, Advances in Pharmacology,Vol40Academic Press。在本發(fā)明的實施方案中，Ad6重組核酸是El缺陷型腺病毒載體，它能夠在補充反 式El時復制?？梢詫⒈磉_盒插入缺失的El區(qū)和/或缺失的E3區(qū)。具有在缺失的El區(qū)提供的表達盒的基于Ad6的腺病毒載體的例子包括以下成分 或由其組成a)從相當于Ad5或Ad6的大約堿基對1到大約堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的El平行或El反向平行取向的基因表達盒；c)與所述表達盒連接的從相當于Ad5的大約堿基對3511到大約堿基對5548或從 相當于Ad6的大約堿基對3508到大約堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；d)與所述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對5549到大約堿基對28133或 從相當于Ad6的大約堿基對5542到大約堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；e)與所述第三區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對28134到大約堿基對30817或 從相當于Ad6的大約堿基對28157到大約堿基對30788的任選存在的第四個區(qū)；f)從相當于Ad5的大約堿基對30818到大約堿基對33966或從相當于Ad6的大約 堿基對30789到大約堿基對33784的第五腺病毒區(qū)，其中，如果存在第四區(qū)，所述第五區(qū)與 所述第四區(qū)連接，或如果不存在所述第四區(qū)，所述第五區(qū)與第三區(qū)連接；和g)與所述第五區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對33967到大約堿基對35935或 從相當于Ad6的大約堿基對33785到大約堿基對35759的第六腺病毒區(qū)；其中，存在至少一個Ad6區(qū)。在本發(fā)明的不同實施方案中，以上所有區(qū)都來自Ad6 ；除第一和第二區(qū)外所有的 區(qū)都來自Ad6 ；而選自第二，第三，第四，和第五區(qū)的1，2，3或4個區(qū)來自Ad6。
具有在缺失的E3區(qū)提供的表達盒的基于Ad6的腺病毒載體的例子包括以下成分 或由其組成a)從相當于Ad5或Ad6的大約堿基對1到大約堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對3511到大約堿基對5548或從 相當于Ad6的大約堿基對3508到大約堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；c)與所述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對5549到大約堿基對28133或 從相當于Ad6的大約堿基對5542到大約堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；d)與所述第三區(qū)連接的E3平行或E3反向平行取向的基因表達盒；e)與所述基因表達盒連接的相當于從Ad5的大約堿基對30818到大約堿基對 33966或從相當于Ad6的大約堿基對30789到大約堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和 f)與所述第四區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對33967到大約堿基對35935或 從相當于Ad6的大約堿基對33785到大約堿基對35759的第五腺病毒區(qū)；其中，存在至少一個Ad6區(qū)。在本發(fā)明的不同實施方案中，以上所有區(qū)都來自Ad6 ；除第一和第二區(qū)外所有的 區(qū)都來自Ad6 ；而選自第二，第三，第四，和第五區(qū)的1，2，3或4個區(qū)來自Ad6。IV.載體生產可以用重組核酸技術生產載體，如包括使用限制酶，核酸連接，和同源重組的技 術。重組核酸技術為本領域所熟知(Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley,1987-1998,禾口 Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2' dEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。利用中間載體驅動治療性載體，或將表達盒或它的一部分從一種載體轉移到另一 種載體。中間載體的例子包括腺病毒基因組質粒和穿梭載體。中間載體上的有用元件包括復制起點，選擇標記，同源重組區(qū)，和常見的限制位 點?？梢岳贸Ｒ姷南拗莆稽c促進核酸序列的克隆或釋放。同源重組區(qū)提供了與另一種核酸分子上的目標區(qū)同源的核酸序列區(qū)。該同源區(qū) 位于要插入所述目標區(qū)的核酸序列側翼。在不同實施方案中，同源區(qū)的長度優(yōu)選為大約 150-600個核苷酸，或長度為大約100-500個核苷酸。本發(fā)明的一種實施方案披露了包括Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表達盒，選擇 標記，細菌復制起點，導向于要插入或取代El區(qū)的表達盒的第一腺病毒同源區(qū)和第二腺病 毒同源區(qū)的穿梭載體。所述第一和第二同源區(qū)位于所述表達盒側翼。第一同源區(qū)包括至 少大約100個堿基對，它們基本上與野生型腺病毒區(qū)的大約堿基對4-450的至少右側末端 (3'末端)同源。第二同源區(qū)包括至少大約100個堿基對，它們基本上與Ad5的大約堿基 到3511-5792的至少左側末端(5’末端)或來自另一種腺病毒的相應區(qū)同源。所提到的“基本上同源”表示與目標區(qū)特異性重組的足夠的同源性程度。在不同 實施方案中，基本上同源表示至少85 %，至少95 %或100 %的序列同一性。序列同一性可以 按照上文I. B.節(jié)中所披露的方法進行。生產腺病毒載體的一種方法是通過產生包括一個表達盒的腺病毒基因組質粒。前 腺病毒質粒包括在需要的互補細胞系中復制所需要的所有腺病毒序列。然后用限制酶消化 所述前腺病毒質粒，以便釋放病毒ITR' s，并且轉染到所述互補細胞系中，進行病毒回收。ITR' s必須從質粒序列上釋放，以便能夠進行復制。腺病毒載體回收導致了含有所述表達 盒的腺病毒載體的產生。A.腺病毒基因組質粒腺病毒基因組質粒包括存在于較大長度質粒(它可以是粘粒)上的腺病毒載體序 列。所述較大長度的質?？梢园ㄆ渌?，如根據(jù)生產和保持所述質粒所采用的方法， 有助于真核細胞或細菌細胞生長和選擇的元件。用于生產腺病毒基因組質粒的技術，包括 與使用穿梭載體和同源重組相關的技術，和與將基因表達盒插入腺病毒粘粒相關的技術 (Hitt 等，Methods in Molecular Genetics 7 13-30,1995, Danthinne 等，Gene Therapy 7 1707-1714,2000)。腺病毒基因組質粒優(yōu)選具有插入El或E3缺失區(qū)的基因表達盒。在本發(fā)明的一種 實施方案中，所述腺病毒基因組質粒包括插入El缺失區(qū)的基因表達盒，復制起點，選擇標 記，和重組腺病毒區(qū)，該腺病毒區(qū)由以下成分組成a)從相當于Ad5或Ad6的大約堿基對1到大約堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的El平行或El反向平行取向的基因表達盒；c)與所述表達盒連接的從相當于Ad5的大約堿基對3511到大約堿基對5548或從 相當于Ad6的大約堿基對3508到大約堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；d)與所述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對5549到大約堿基對28133或 從相當于Ad6的大約堿基對5542到大約堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；e)與所述第三區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對30818到大約堿基對33966或 從相當于Ad6的大約堿基對30789到大約堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；f)與所述第四區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對33967到大約堿基對35935或 從相當于Ad6的大約堿基對33785到大約堿基對35759的第五腺病毒區(qū)；和g)相當于存在于Ad5或Ad6中的E3區(qū)的全部或一部分的任選存在的E3區(qū)，根據(jù) 需要的腺病毒載體的總體大小，可以提供較小的插入片段。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述重組腺病毒基因組質粒具有插入到E3缺失區(qū) 的基因表達盒。所述載體包括復制起點，選擇標記，和以下部分a)從相當于Ad5或Ad6的大約堿基對1到大約堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述表達盒連接的從相當于Ad5的大約堿基對3511到大約堿基對5548或從 相當于Ad6的大約堿基對3508到大約堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；c)與所述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對5549到大約堿基對28133或 從相當于Ad6的大約堿基對5542到大約堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；d)與所述第三區(qū)連接的E3平行或E3反向平行取向的基因表達盒；e)與所述基因表達盒結合的從相當于Ad5的大約堿基對30818到大約堿基對 33966或從相當于Ad6的大約堿基對30789到大約堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和f)與所述第四區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對33967到大約堿基對35935或 從相當于Ad6的大約堿基對33785到大約堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。在不同實施方案中，存在相關的腺病毒區(qū)(1)相當于Ad5的第一，第二，第三，第四和第五區(qū)；(2)相當于Ad6的第一，第二，第三，第四和第五區(qū)；和
(3)相當于Ad5的第一區(qū)，相當于Ad5的第二區(qū)，相當于Ad6的第三區(qū)，相當于Ad6 的第四區(qū)和相當于Ad5的第五區(qū)。本發(fā)明的一種實施方案披露了一種制備腺病毒載體的方法，包括生產腺病毒基因 組質粒的同源重組步驟和腺病毒回收步驟。所述同源重組步驟包括使用其側翼為腺病毒同 源區(qū)的包括Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表達盒的穿梭載體。所述腺病毒同源區(qū)將表達 盒導向于El或E3缺失區(qū)。在本發(fā)明的一種實施方案中，涉及生產腺病毒基因組質粒，將基因表達盒插入載 體，包括從相當于Ad5或Ad6的大約堿基對1到大約堿基對450的第一腺病毒區(qū)；與所 述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對3511到大約堿基對5548或從相當于Ad6的大 約堿基對3508到大約堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；與所述第二區(qū)連接的從相當于Ad5的 大約堿基對5549到大約堿基對28133或從相當于Ad6的大約堿基對5542到大約堿基對 28156的第三腺病毒區(qū)；與所述第三區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對30818到大約堿 基對33966或從相當于Ad6的大約堿基對30789到大約堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和 與所述第四區(qū)連接的從相當于Ad5的大約堿基對33967到大約堿基對35935或從相當于 Ad6的大約堿基對 33785到大約堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。所述腺病毒基因組質粒應 當包括復制起點和選擇標記，并且可以包括Ad5或Ad6的E3區(qū)的全部或一部分。在涉及腺病毒區(qū)的不同實施方案中，存在(1)相當于Ad5的第一，第二，第三，第 四和第五區(qū)；(2)相當于Ad6的第一，第二，第三，第四和第五區(qū)；和(3)相當于Ad5的第一 區(qū)，相當于Ad5的第二區(qū)，相當于Ad6的第三區(qū)，相當于Ad6的第四區(qū)，和相當于Ad5的第五 區(qū)。B.腺病毒載體回收可以用本領域已知的或本文所披露的技術，從重組腺病毒基因組質粒中回收腺 病毒載體。用于回收腺病毒的技術的例子為本領域所熟知，并且披露于以下文獻中=Hitt 等，Methods in Molecular Genetics7 13-30,1995,禾口 Danthinne 等，Gene Therapy 7: 1707-1714，2000?；厥毡疚乃兜南俨《据d體的優(yōu)選方法，包括加強腺病毒復制。例如，加強腺病 毒復制可以通過在獨立的載體上補充腺病毒功能，如E2蛋白(聚合酶，前末端蛋白和DNA 結合蛋白)以及E4或f6進行。下面的實施例10披露了加強腺病毒復制，以便回收包括密 碼子優(yōu)化的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B表達盒的腺病毒載體。V.部分優(yōu)化的HCV編碼序列HCV多蛋白編碼核酸的部分優(yōu)化提供了優(yōu)化用于在人體內表達的較少量的密碼子 而不是全面優(yōu)化。總體目標是提供由于密碼子優(yōu)化而產生的增強表達的優(yōu)點，同時有利于 生產包括具有優(yōu)化密碼子的HCV多蛋白編碼核酸的腺病毒載體。HCV多蛋白編碼序列的完全優(yōu)化，提供了每一種氨基酸的最常見的人密碼子。完 全優(yōu)化可以用本領域所熟知的密碼子頻率表進行，并且使用諸如BACKTRANSLATE的程序 (Wisconsin Package version 10，Genetics Computer Group，GCG，Madison，Wise.) 0部分優(yōu)化可以對所存在的完整HCV多蛋白編碼序列(例如，NS3-NS5B)進行，或對 存在的一個或多個局部區(qū)域進行。在不同實施方案中，所存在的完整HCV編碼多肽的GC含 量不超過至少大約65% ；并且一個或多個局部區(qū)域的GC含量不超過大約70%。
局部區(qū)域是存在于HCV編碼核酸中的區(qū)域，并且其大小可以改變。例如，局部區(qū)域 的長度可以為大約60，大約70，大約80，大約90或大約100個核苷酸。部分優(yōu)化可以通過首先構建要根據(jù)天然存在的序列部分優(yōu)化的HCV編碼多蛋白 序列而實現(xiàn)。另外，可以將優(yōu)化的HCV編碼序列用作比較的基礎，以便產生部分優(yōu)化的序 列。VI. HCV組合治療可以使用HCV Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B疫苗本身來治療患者，可以與其他 HCV治療劑組合使用，并且可以與針對其他類型疾病的試劑一起使用。其他治療劑包括治療 HCV和具有高的HCV感染傾向人體內的疾病的其他治 療劑。針對其他類型疾病的試劑包括 針對HIV和HBV的疫苗。用于治療HCV的其他治療劑，包括疫苗和非疫苗制劑(Zein，Expert Opin. Investig. Drugs 10 1457-1469，2001)。其他HCV疫苗的例子包括為了誘導針對HCV核心 抗原和HCV El, E2或p7區(qū)的免疫反應而設計的疫苗。疫苗成分可以是天然存在的HCV多 肽，HCV模擬表位(mimotope)多肽或編碼序列所述多肽的核酸。HCV模擬表位多肽包括HCV表位，但是具有與天然存在的HCV抗原不同的序列。 HCV模擬表位可以與天然存在的HCV抗原融合。在以下文獻中，提供了披露用于生產模擬 表位的一般性技術的參考文獻，并且披露了不同的HCV模擬表位Felici等，美國專利號 5，994，083 和 Nicosia 等，國際申請?zhí)?WO 99/60132。VII.藥物施用可以采用本文所提供的說明以及本領域所熟知的技術，制備并且給患者施用HCV 疫苗。例如，一般性藥物施用的指南披露于以下文獻中=Modern Vaccinology, Ed. Kurstak, Plenum Med. Co. 1994 ；Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences 18thEdition, Ed. Gennaro, Mack Publishing,1990 ；禾口 Modern Pharmaceutics 2 " d Edition, Eds. Banker和Rhodes，Marcel Dekker, Inc.，1990，其中的每一份文獻都被收作本文參考。HCV疫苗可以通過不同途徑施用，如靜脈內，腹膜內，皮下，肌內，真皮內，通過皮膚 的按壓或鼻內途徑。優(yōu)選的途徑是肌內途徑。肌內施用可以使用不同的技術進行，例如通過使用或不用一個或多個電脈沖注 射。電介導的轉移，可能有利于通過刺激體液和細胞免疫反應進行遺傳學免疫。疫苗注射可以用不同的技術進行，如通過采用針頭注射系統(tǒng)或無針頭注射系統(tǒng)。 無針頭注射系統(tǒng)的例子是噴射注射裝置(Donnelly等，國際公開號WO 99/52463)。A.電介導的轉移電介導的轉移或基因電-轉移(GET)，可以通過在核酸注射之后輸送合適的電脈 沖進行(參見Mathiesen，國際公開號WO 98/43702)。質粒注射和電穿孔可以用不銹鋼針頭 進行。針頭是成對的，三聯(lián)的或更復雜的形式的。在一種設計中，將所述針頭焊接在印刷電 路板上，所述電路板是機械支持物，并且通過合適的電纜將針頭與電場發(fā)生器連接在一起。以電脈沖形式提供電刺激。脈沖可以具有不同的形式(矩形，正弦，三角形，指數(shù) 衰減)和不同的極性(具有陽性或陰性極性的單極，雙極)。脈沖可以以穩(wěn)定的電壓或穩(wěn)定 的電流形式輸送?？梢岳貌煌问降碾娭委?，將包括HCV的核酸疫苗和其他核酸疫苗導入患者體內?？尚械碾娭委煼绞桨ㄒ韵路桨钢委? 每隔1秒鐘輸送10串1000個矩形雙極脈沖，脈沖長度為0. 2毫秒/相， 頻率為1000Hz，穩(wěn)定電壓模式，45伏/相，浮動電流。治療2 每隔1秒鐘輸送2串100個矩形雙極脈沖，脈沖長度為2毫秒/相，頻率 為IOOHz，穩(wěn)定電流模式，100毫安/相，浮動電壓。治療3 :2串雙極脈沖，脈沖長度為大約2毫秒/相，總長度為大約3秒鐘，其中，穿 過組織的實際電流固定在大約50毫安。
電脈沖是通過電場發(fā)生器輸送的。合適的發(fā)生器可以包括3個獨立的硬件部件， 它們組裝于一個共同的底盤，并且通過便攜式PC運行驅動程序驅動。所述軟件同時管理基 礎功能和輔助功能。該裝置的部件包括(1)通過微處理器驅動的信號發(fā)生器，(2)電放大 器和(3)數(shù)字示波器。所述信號發(fā)生器，在特定范圍內在軟件控制下輸送具有任意頻率和形狀的信號。 所述相同的軟件具有用于要輸送的波形的相互作用編輯器，所述發(fā)生器涉及一種數(shù)字控制 的電流限制裝置(控制最大電流輸出的安全裝置)。所述電力放大器可以將所產生的信號 放大到+/-150V。所述示波器是數(shù)字化的，并且能夠對由所述放大器輸送的電壓和電流進行 取樣。B.藥用載體可以藥用的載體有利于疫苗的保存和給對象施用。在本文中披露了可以藥用的載 體的例子。其他可以藥用的載體為本領域所熟知?？梢运幱玫妮d體可以包括不同的成分，如緩沖液，普通鹽水或磷酸緩沖的鹽水， 蔗糖，鹽和聚山梨酸酯。可以藥用的載體的例子如下2.5-10mM TRIS緩沖液，優(yōu)選大約 5mM TRIS緩沖液；25_100mM NaCl，優(yōu)選大約75mM NaCl ；2. 5-10%蔗糖，優(yōu)選大約5%蔗糖； 0. 01-2mMMgCl2 ；和0. 001 % -0. 01 %聚山梨醇酯80 (來自植物的)。PH優(yōu)選為大約7. 0-9. 0， 更優(yōu)選大約8.0。載體的一種具體例子包括5mM TRIS,75mM NaCl，5 %蔗糖，ImM MgCl2, 0. 005%聚山梨醇酯80，pH 8. 0。C.用藥方案可以根據(jù)特定疫苗效力和諸如患者年齡，體重，性別和醫(yī)學狀況等因素；施用途 徑；需要的效果；以及用藥次數(shù)，確定合適的用藥方案。特定疫苗的效力取決于不同因素， 如特定疫苗產生多肽的能力，所述多肽是在細胞中表達和加工的，并且以I類和II類MHC 復合物的形式出現(xiàn)。給患者施用的HCV編碼核酸可以是包括病毒載體在內的不同類型載體的一部 分，如腺病毒載體，和DNA質粒疫苗。在涉及施用DNA質粒的不同實施方案中，給患者施用 大約0. I-IOmg質粒，以及給患者施用大約l_5mg質粒。在涉及施用病毒載體，優(yōu)選腺病毒 載體的不同實施方案中，給患者施用大約IO5-IO11病毒顆粒，以及給患者施用大約IO7-IOki 病毒顆粒。病毒載體疫苗和DNA質粒疫苗可以單獨施用，或者可以作為激發(fā)和加強施用方案 的一部分。激發(fā)和加強接種的一種混合形式，包括用DNA激發(fā)和用病毒載體疫苗加強，或用 病毒載體疫苗激發(fā)和用DNA疫苗加強?？梢允褂枚啻渭ぐl(fā)，例如大約2-4次或更多次。激發(fā)和加強之間的時間長度，通常從大約4個月到1年，不過，可以采用其他時間方案。采用DNA疫苗的激發(fā)方案，可優(yōu)選用 于患有以前存在的腺病毒免疫反應的患者的場合。在本發(fā)明的一種實施方案中，將IX IO7-IX IO12腺病毒載體顆粒，優(yōu)選大約 IX IOltl-I X IO11腺病毒載體顆粒直接施用于肌肉組織中。在初次接種之后，用腺病毒載體 或DNA疫苗進行加強。在本發(fā)明的另一種實施方案中，初次的接是通過直接進入肌肉組織中的DNA疫苗 進行的。在初次免疫之后，用腺病毒載體或DNA疫苗進行加強?？梢酝瑫r施用諸如白介素-12，6厘義5 ，87-1，87-2，1 10，1^8-1的試劑，以便加強 免疫反應。所述試劑可以作為蛋白施用，或者通過使用核酸載體施用。 D.異源激發(fā)-加強異源激發(fā)_加強是一種混合形式，它包括使用一種類型的病毒載體進行激發(fā)，而 用另一種類型的病毒載體進行加強。所述異源激發(fā)_加強可包括相關的載體，如基于不同 腺病毒血清型的載體，以及關系更遠的病毒，如腺病毒和痘病毒。在以下文獻中披露了利用 痘病毒和腺病毒載體防止小鼠出現(xiàn)瘧疾Gilbert等，Vaccine 20 :1039_1045，2002。涉及激發(fā)和加強的不同實施方案，包括表達所需抗原的以下類型的載體，如 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B :Ad5 載體，隨后是Ad6 載體；Ad6 載體，隨后是Ad5 載體；Ad5 載體，隨后是痘病毒載體；痘病毒載體，隨后是Ad5載體；Ad6載體，隨后是痘病毒載體；和 痘病毒載體，隨后是Ad6載體。激發(fā)和加強之間的時間長度，通常為大約4個月到1年，不過，可以使用其他時間 方案。最低時間方案應當足夠允許免疫學休息。在一種實施方案中，這種休息是為期至少 6個月的時間。激發(fā)可能包括用一種類型的載體多次激發(fā)，如激發(fā)2-4次。存在于水痘病毒載體中的表達盒，應當包括一個激發(fā)子，該激發(fā)子是天然的，或 源于感興趣的痘病毒或其他痘病毒成員。構建和使用不同類型的痘病毒型載體的不同 方法，包括基于痘苗病毒，修飾過的痘苗病毒，禽痘病毒，浣熊痘病毒，修飾過的痘苗病 毒Ankara，金絲雀痘病毒(如ALVAC)，禽痘病毒，牛痘病毒，和NYVAC的載體是本領域所 熟知的(Moss, Current Topics in Microbiology andlmmunology 158 :25_38,1982 ； Earl 等，In Current Protocolsin Molecular Biology, Ausubel 等 eds. , New York GreenePublishing Associates&ffiley Interscience ； 1991 16. 16. 1-16. 16. 7, Child 等，Virology 174(2) :625_9，1990 ；Tartaglia 等，Virology 188 :217_232，1992 ；美國專 利號 4，603，112，4，722，848，4，769，330，5，110，587，5，174，993，5，185，146，5，266，313， 5，505，941，5，863，542，和 5，942，235)。E.佐劑HCV疫苗可以與佐劑一起配制。對于DNA質粒疫苗來說，佐劑是特別有用的。佐劑 的例子包括明礬，AlPO4, alhydrogel，脂質-A及其衍生物或變體，弗氏不完全佐劑，中性脂 質體，含有疫苗和細胞因子的脂質體，非離子型嵌段共聚物和趨化因子。含有聚環(huán)氧乙烷(POE)和聚環(huán)氧丙烷(POP)的非離子型嵌段聚合物，如 Ρ0Ε-Ρ0Ρ-Ρ0Ε 嵌段共聚物可以用作佐劑(Newman 等，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15 :89_142，1998)?？梢杂门c陰離子型表面活性劑組合的非離子型 嵌段共聚物增強核酸的免疫反應。
佐劑制劑的一種具體例子是含有CRL-1005 (CytRx ResearchLaboratories)，DNA， 和benzylalkonium chloride (BAK)的制劑。該制劑可以通過使用正位移移液管將純的聚合 物添加到溶解在PBS中的質粒DNA的冷卻(<5°C)溶液中而制備。然后對該溶液進行渦 旋攪拌，以便使所述聚合物溶解。在所述聚合物完全溶解之后，在低于所述聚合物的絮凝點 (大約6-7°C)的溫度下獲得了透明溶液。然后通過緩慢添加溶解在PBS中的BAK的稀釋溶 液，將大約4mM BAK添加到溶解在PBS中的DNA/CRL-1005溶液中。在添加聚合物和BAK之 前，最初DNA濃度為大約6mg/mL，而最終DNA濃度為大約5mg/mL。在添加BAK之后，對該制 劑進行充分渦旋攪拌，然后使它的溫度提高到高于絮凝點大約2V。冷卻和混合同時使它的 溫度提高到高于絮凝點大約2°C，重復進行若干次，直到該制劑的粒度為大約200-500nm， 該粒度是通過動態(tài)光學散射測定的。然后將該溶液保存在冰上一直到該溶液透明，然后放 在-70°C下保存。在使用之前，讓該溶液在室溫下解凍。F.疫苗保存可以利用不同類型的緩沖液保存腺病毒載體和DNA疫苗。例如，可以用下面的實 施例9中所披露的緩沖液A105保存載體。通過清除或螯合微量金屬離子，可以改善對DNA的保存。可以將琥珀酸或蘋果酸 的試劑和螯合劑用于改善DNA疫苗的穩(wěn)定性。螯合劑的例子包括多種磷酸配體和EDTA。添 加諸如乙醇或甘油的非還原性自由基清除劑還可以防止因為自由基的產生對DNA質粒的 破壞。另外，在所述制劑中可以控制緩沖液的類型，PH，鹽濃度，光照，以及消毒方法的類型， 以便優(yōu)化所述DNA疫苗的穩(wěn)定性。
實施例提供下面的實施例是為了進一步說明本發(fā)明的不同特征。這些實施例還說明了可 用于實施本發(fā)明的方法。這些實施例沒有限定要求保護的本發(fā)明。實施例1 :Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B 表達盒根據(jù)Ib亞型HCV BK菌株構建了編碼HCVNS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的不同的基 因表達盒。所編碼的序列具有下列任一種序列(1)活性NS5B序列(“NS" )，(2)失活的 NS5B序列(〃 NSmut" )，(3)具有失活的NS5B序列的密碼子優(yōu)化序列(“NSOPTmut")。 所述表達盒還包括CMV激發(fā)子/增強子和BGH聚腺苷酸化信號。NS核苷酸序歹Ij (SEQ. ID. NO. 5)與HCV BK菌株GenBank保藏號M58335相比，在 5952個核苷酸中有30個核苷酸不同。 NS氨基酸序列(SEQ. ID. NO. 6)與相應的Ib基因型 HCV BK菌株在1984個氨基酸中有7個氨基酸不同。為了能夠起始翻譯，在NS序列的5' 末端存在一個ATG密碼子。在NS序列的3 ‘末端存在一個TGA終止序列。NSmut核苷酸序列(SEQ. ID. NO. 2，圖2)與NS序列相似。NSmut和NS之間的差別 包括NSmut具有改變了的NS5B催化位點；在5 ‘末端具有一個最佳核糖體結合位點；以及 在3 ‘末端具有一個TAAA終止序列。NS5B上的改變包括5138-5146號堿基，這些堿基編碼 1711-1713號氨基酸。所述改變導致了氨基酸GlyAspAsp改變成AlaAlaGly，并且產生了失 活形式的NS5B RNA-依賴型RNA-聚合酶NS5B。NSOPTmut序列(SEQ. ID. NO. 3，圖3)是根據(jù)由NSmut編碼的氨基酸序列設計的。使 用 GCG(Wisconsin Package version 10, Genetics Computer Group, GCG, Madison, Wise)BACKTRANSLATE程序將NSmut氨基酸序列反向翻譯成核苷酸序列。為了制備NSOPTmut核苷 酸序列，其中的每一種氨基酸是由相應的最常見的人密碼子編碼的，該程序是這樣進行的 選擇最可能的氨基酸序列的產生作參數(shù)，并且規(guī)定在GCG軟件包內可獲得的高度表達的人 基因(human-high, cod)的密碼子頻率表作為翻譯方案。實施例2 制備具有NS，NSmut或NSOPTmut序列的pVlJns質粒含有NS，NSmut或NSOPTmut序列的pVlJns質粒是通過以下方法制備和表征的
具有NS序列的pVl Jns質粒將來自HCV BK型菌株的編碼區(qū)Met-NS3-NS4A-NS4B_NS5A和編碼區(qū)Met_NS3 -NS4A-NS4B-NS5A-NS5B (Tomei 等，J. Virol. 67 :4017_4026，1993)克隆到 pcDNA3 質粒 (Invitrogen)上，分別制備 pcD3_5a 和 pcD3_5b 載體。用 HindIII 消化 PcD3_5A，用 Klenow 填充片段補平末端，隨后用XbaI消化，以便產生相當于Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A的編碼區(qū) 的片段。將該片段克隆到pVlJns-poly上，用BglII消化，用Klenow填充片段補平末端，隨 后用Xba I消化，制備pVlJnsNS3-5A。pVlJns-poly 是 pVlJnsA 質粒的衍生物(Montgomery 等，DNA andCell Biol. 12 777-783，1993)，通過將含有XbaI, PmeI, PacI的識別位點的多接頭插入獨特的BglII和 NotI限制位點進行修飾。具有NS序列的pVlJns質粒(pVlJnsNS3-5B)是通過以下方法獲 得的同源重組到細菌菌株BJ5183中，用通過XbaI和NotI消化線性化的PV1JNS3_5A和含 有大約200bp的NS5A，NS5B編碼序列和大約60bp的BGH聚腺苷酸化信號共轉化。所得到 的質粒被稱為pVlJns-NS。pVlJns-NS可以歸納如下堿基pVlJnsA 的 1-1881 號堿基一個額外的 AGCTT隨后是 Met-NS3_NS5B 序列(SEQ. ID. NO. 5)然后是 wt TGA終止子一個額外的 TCTAGAGCGTTTAAACCCTTAATTAAGG(SEQ. ID. N0. 14)堿基pVlJnsA 的 1912-4909 號堿基具有NSmut序列的pVl Jns質粒通過添加完整Kozak序列修飾VlJnsNS3-5A質粒的5'末端的NS3編碼序列。 該質粒(VlJNS3-5AkoZak)是通過重組到細菌菌株BJ5183中，用通過A/HI消化線性化的 V1JNS3-5A和包括內含子A的近端部分，限制位點BglII，完整的Kozak翻譯起始序列和NS3 編碼序列的一部分的PCR片段共轉化獲得的。通過用Xba I消化使所得到的質粒(VlJNS3-5AkoZak)線性化，并且與包括大約 200bp的NS5A，NS5B突變序列，強翻譯終止序列TAAA和大約60bp的BGH聚腺苷酸化信號的 PCR片段一起共轉化到細菌菌株BJ5183中。所述PCR片段是通過組裝兩個22bp的重疊片段 獲得，其中，通過用于擴增它們的寡核苷酸引入了突變。所得到的質粒被稱pVlJns-NSmut。pVlJns-NSmut 可以歸納如下堿基pVlJnsA 的 1-1882 號堿基隨后是 kozak Met-NS3-NS5B (mut) TAAA 序列(SEQ. ID. NO. 2)一個額外的 TCTAGA
堿基 pVlJnsA 的 1925-4909 號堿基
具有NSOPTmut序列的pVI Jns質粒通過位于該基因5’和3’末端的BamHI和SalI限制位點消化人密碼子優(yōu)化的合 成基因(NSOPTmut)，它具有突變的NS5B，以便破壞酶促活性，完整的Kozak翻譯起始序列和 強翻譯終止序列。然后將該基因克隆到存在于VlJnsA質粒的多接頭上的BglII和SalI限 制位點上，以便產生VlJns-NSOPTmut。pVIJns-NSOPTmut 可以歸納如下堿基pVlJnsA 的 1-1881 號堿基一個額外的 C然后是kozak Met-NS3_NS5B (optmut) TAAA 序列(SEQ. ID. NO. 3)一個額外的 TTTAAATGTTTAAAC(SEQ. ID. NO. 15)堿基pVIJnsA 的 1905-4909 號堿基質粒表征通過轉染在補充了 L-谷氨酰胺(最終濃度4mM)的10 % FCS/DMEM中生長的 SEK293細胞，測試HCV NS蛋白的表達。在轉染之前24小時，將細胞鋪平板到直徑35毫米 的6個孔中，以便在轉染的當天到達90% -95%的鋪滿度。使用LIPOFECTAMINE 2000試劑， 用40納克質粒DNA (事先確定為非飽和DNA用量)和100納克含有Rous肉瘤病毒激發(fā)子 控制的熒光素酶報導基因的pRSV-Luc質粒共轉染。在37°C下，將細胞保持在CO2培養(yǎng)箱中 48小時。用Triton/TEN緩沖液制備細胞提取物。將所述提取物的熒光素酶活性標準 化，并且在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上對系列稀釋液進行電泳。將蛋白轉移到硝酸纖維素 上，并且用針對NS3，NS5A和NS5B的抗體分析，以便評估表達強度和正確的蛋白水解裂解。 用模擬轉染的細胞作為陰性對照。在圖12中示出了來自測試pVlJnsNS，pVlJnsNSmut和 pVIJnsNSOPTmut的典型實驗的結果。實施例3 用質粒DNA載體對小鼠進行免疫將DNA 質粒 pVlJns-NS，pVlJns-NSmut 和 pVlJnsNSOPTmut 注射到不同的小鼠株 中，以便評估它們誘導抗HCV免疫反應的潛力。兩個不同的株(Balb/C和C57Black6，N = 9-10)用25或50 μ g的DNA進行肌內注射，隨后進行電脈沖。每一只動物每隔3周接受2 個劑量。在兩次用藥之后，通過對細菌表達的NS3蛋白酶結構域進行ELISA，測定在 C57BIack6小鼠體內誘導的針對NS3蛋白的體液免疫反應。在用所有三種載體免疫的動 物體內檢測到對測試抗原特異的抗體，幾何平均效價(GMT)在94000-133000范圍內(表 1-3)。表1 :pVljns-NS
GMT 小鼠 i 1 2 Γ~34~~ 5G7~ΓΓ~9~
效價.1 105466 I 891980 78799 39496 543542 182139 32351 95028 67800 94553
表 2 :pVljns-NSmut
權利要求
一種編碼SEQ ID NO1的Met NS3 NS4A NS4B NS5A NS5B多肽或與SEQ ID NO1相差1 12個氨基酸的多肽的核苷酸序列，前提是所述多肽具有足夠的蛋白酶活性對它自身進行加工，以便產生NS5B蛋白，并且所述NS5B蛋白是無酶促活性的，其中所述多肽能夠產生抗HCV的細胞介導的免疫反應。
2.如權利要求1的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQIDNO 2的編碼序列。
3.如權利要求1的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列編碼SEQID NO 1的多肽。
4.如權利要求3的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQIDNO :3，SEQ ID NO=IO 或SEQ ID NO 11的編碼序列。
5.如權利要求3的核酸序列，其中，所述核苷酸序列是SEQIDNO :3的編碼序列。
6.一種表達載體，其包含權利要求1-5中任意一項的核苷酸序列，其中所述表達載體 能夠在人細胞中由所述核苷酸序列表達所述多肽。
7.—種核酸，包括能夠在人細胞中表達SEQ. ID. NO. 1的 Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽或與SEQ ID NO 1相差1_12個氨基酸的多肽的基因 表達盒，前提是所述多肽能夠對它自身進行加工，以便產生無酶促活性的NS5B蛋白，所述 基因表達盒包括a)與編碼所述多肽的核苷酸序列轉錄性偶聯(lián)的啟動子；b)與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的5'核糖體結合位點；c)與所述核苷酸序列的3'末端連接的終止子；和d)與所述核苷酸序列功能性偶聯(lián)的3'聚腺苷酸化信號；前提是所述多肽能夠產生抗HCV的細胞介導的免疫反應。
8.如權利要求7的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQID N0:2，SEQ ID NO :3,SEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO 11，或者與 SEQID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO 11相差1-50個核苷酸。
9.如權利要求8的核酸，其中，所述核酸是適合給人施用的質粒，并且還包括原核復制 起點和編碼選擇標記的基因。
10.如權利要求9的核酸，其中，所述核苷酸序列編碼SEQIDNO :1的多肽。
11.如權利要求10的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11的編碼序列。
12.如權利要求10的核酸，其中，所述核苷酸序列是SEQID NO 2或SEQ ID NO 3的 編碼序列。
13.如權利要求10的核酸，其中，所述啟動子是包含內含子A的人立即早期巨細胞病毒 啟動子，所述5’核糖體結合位點為SEQ IDNO :12，并且所述3’聚腺苷酸化是牛生長激素聚 腺苷酸化信號。
14.如權利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因組質粒，它的組成是選擇標記， 復制起點，和包括El缺失，E3缺失和所述表達盒的重組腺病毒載體基因組。
15.如權利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因組質粒，它的組成是選擇標記， 復制起點，和a)從Ad5或Ad6的堿基對1到堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的El平行或El反向平行取向的基因表達盒；c)與所述表達盒連接的從Ad5的堿基對3511到堿基對5548的第二腺病毒區(qū)或從Ad6 的堿基對3508到堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；d)與所述第二區(qū)連接的從Ad5的堿基對5549到堿基對28133或從Ad6的堿基對5542 到堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；e)與所述第三區(qū)連接的從Ad5的堿基對30818到堿基對33966或從Ad6的堿基對 30789到堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和f)與所述第四區(qū)連接的從Ad5的堿基對33967到堿基對35935或從Ad6的堿基對 33785到堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。
16.如權利要求15的核酸，其中，所述第一區(qū)是Ad5，所述第二區(qū)是Ad5，所述第三區(qū)是 Ad5，所述第四區(qū)是Ad5，并且所述第五區(qū)是Ad5。
17.如權利要求16的核酸，其中，所述啟動子是人立即早期巨細胞病毒啟動子，所述 5'核糖體結合位點為SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生長激素聚腺苷酸化信 號。
18.如權利要求17的核酸，其中，所述表達盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
19.如權利要求15的核酸，其中，所述第一區(qū)為Ad5或Ad6，所述第二區(qū)為Ad5或Ad6， 所述第三區(qū)為Ad6，所述第四區(qū)為Ad6，并且所述第五區(qū)為Ad5或Ad6。
20.如權利要求19的核酸，其中，所述啟動子是人立即早期巨細胞病毒啟動子，所述 5'核糖體結合位點為SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生長激素聚腺苷酸化信 號。
21.如權利要求20的核酸，其中，所述表達盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
22.如權利要求20的核酸，其中，所述表達盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3。
23.如權利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒基因組質粒，它包括復制起點，選擇 標記,和a)從Ad5或Ad6的堿基對1到堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的Ad5的堿基對3511到堿基對5548或從Ad6的堿基對3508到 堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；c)與所述第二區(qū)連接的從Ad5的堿基對5549到堿基對28133或從Ad6的堿基對5542 到堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；d)與所述第三區(qū)連接的E3平行或E3反向平行取向的基因表達盒；e)與所述基因表達盒連接的從Ad5的堿基對30818到堿基對33966或從Ad6的堿基對 30789到堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和f)與所述第四區(qū)連接的從Ad5的堿基對33967到堿基對35935或從Ad6的堿基對 33785到堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。
24.如權利要求23的核酸，其中，所述第一區(qū)是Ad5，所述第二區(qū)是Ad5，所述第三區(qū)是 Ad5，所述第四區(qū)是Ad5，所述第五區(qū)是Ad5。
25.如權利要求24的核酸，其中，所述啟動子是人立即早期巨細胞病毒啟動子，所述5'核糖體結合位點為SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生長激素聚腺苷酸化信號。
26.如權利要求23的核酸，其中，所述第一區(qū)是Ad5或Ad6，所述第二區(qū)是Ad5或Ad6， 所述第三區(qū)是Ad6，所述第四區(qū)是Ad6，所述第五區(qū)是Ad5或Ad6。
27.如權利要求26的核酸，其中，所述啟動子是人立即早期巨細胞病毒啟動子，所述 5'核糖體結合位點為SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生長激素聚腺苷酸化信號。
28.如權利要求8的核酸，其中，所述核酸是由包括El缺失，E3缺失，和所述表達盒的 腺病毒載體基因組組成的腺病毒載體。
29.如權利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒載體，它包括a)從Ad5或Ad6的堿基對1到堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的El平行或El反向平行取向的基因表達盒；c)與所述表達盒連接的從Ad5的堿基對3511到堿基對5548或從Ad6的堿基對3508 到堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；d)與所述第二區(qū)連接的從Ad5的堿基對5549到堿基對28133或從Ad6的堿基對5542 到堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；e)與所述第三區(qū)連接的從Ad5的堿基對30818到堿基對33966或從Ad6的堿基對 30789到堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和f)與所述第四區(qū)連接的從Ad5的堿基對33967到堿基對35935或從Ad6的堿基對 33785到堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。
30.如權利要求29的核酸，其中，所述第一區(qū)是Ad5，所述第二區(qū)是Ad5，所述第三區(qū)是 Ad5，所述第四區(qū)是Ad5，所述第五區(qū)是Ad5。
31.如權利要求30的核酸，其中，所述啟動子是人立即早期巨細胞病毒啟動子，所述 5'核糖體結合位點為SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生長激素聚腺苷酸化信 號。
32.如權利要求31的核酸，其中，所述表達盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
33.如權利要求29的核酸，其中，所述第一區(qū)是Ad5或Ad6，所述第二區(qū)是Ad5或Ad6， 所述第三區(qū)是Ad6，所述第四區(qū)是Ad6，所述第五區(qū)是Ad5或Ad6。
34.如權利要求33的核酸，其中，所述啟動子是人立即早期巨細胞病毒啟動子，所述 5'核糖體結合位點為SEQ ID N0:12，并且所述3'聚腺苷酸化是牛生長激素聚腺苷酸化信 號。
35.如權利要求34的核酸，其中，所述表達盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQID NO 10 或 SEQ ID NO :11。
36.如權利要求34的核酸，其中，所述表達盒是El反向平行取向的，并且所述核苷酸序 列是 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3。
37.如權利要求8的核酸，其中，所述核酸是腺病毒載體，它包括a)從Ad5或Ad6的堿基對1到堿基對450的第一腺病毒區(qū)；b)與所述第一區(qū)連接的從Ad5的堿基對3511到堿基對5548或從Ad6的堿基對3508到堿基對5541的第二腺病毒區(qū)；c)與所述第二區(qū)連接的從Ad5的堿基對5549到堿基對28133或從Ad6的堿基對5542 到堿基對28156的第三腺病毒區(qū)；d)與所述第三區(qū)連接的E3平行或E3反向平行取向的基因表達盒；e)與所述基因表達盒連接的從Ad5的堿基對30818到堿基對33966或從Ad6的堿基對 30789到堿基對33784的第四腺病毒區(qū)；和f)與所述第四區(qū)連接的從Ad5的堿基對33967到堿基對35935或從Ad6的堿基對 33785到堿基對35759的第五腺病毒區(qū)。
38.如權利要求37的核酸，其中，所述第一區(qū)是Ad5，所述第二區(qū)是Ad5，所述第三區(qū)是 Ad5，所述第四區(qū)是Ad5，所述第五區(qū)是Ad5。
39.如權利要求37的核酸，其中，所述第一區(qū)是Ad5或Ad6，所述第二區(qū)是Ad5或Ad6， 所述第三區(qū)是Ad6，所述第四區(qū)是Ad6，所述第五區(qū)是Ad5或Ad6。
40.一種由SEQ ID NO :4或它的衍生物的核酸序列組成的腺病毒載體，其中，所述衍生 物具有存在于SEQ ID NO :4中的HCV多蛋白編碼序列，該序列被SEQ ID NO :3,SEQ ID NO: 10或SEQ IDNO :11的HCV多蛋白編碼序列所取代。
41.一種培養(yǎng)的重組細胞，包括權利要求6的表達載體。
42.一種培養(yǎng)的重組細胞，包括權利要求9-27和28-40中任意一項的核酸。
43.一種藥物組合物，包括權利要求9-13，28-40中任意一項的核酸，以及可以藥用的 載體。
44.有效量的如權利要求9-13和28-40中任意一項的核酸在制備治療HCV感染的藥物 中的用途。
全文摘要
丙型肝炎病毒疫苗，本發(fā)明涉及Ad6載體和編碼含有失活的NS5B RNA-依賴型RNA聚合酶區(qū)的Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B多肽的核酸。所述核酸特別適合用作提供多種抗原的腺病毒載體或DNA質粒疫苗的成分它，用于產生針對HCV的HCV特異性細胞介導的免疫(CMI)反應。
文檔編號A61K39/00GK101988071SQ200910251298
公開日2011年3月23日 申請日期2002年10月10日 優(yōu)先權日2001年10月11日
發(fā)明者A·J·貝特, A·盧扎戈, A·尼科西亞, A·拉姆, D·C·卡斯羅, E·A·埃米尼, J·W·施弗, R·科爾特斯, S·科羅卡 申請人:默沙東公司;P.安杰萊蒂分子生物學研究所