專利名稱：蛋白多糖含有物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白多糖含有物。更具體來說，涉及從魚類的軟骨中得到的蛋白多糖含有物。
背景技術：
蛋白多糖是與膠原蛋白等一起形成結締組織的細胞外基質中的基質的主要生物體高分子。蛋白多糖以往是將哺乳動物(特別是牛)軟骨中所含的物質提取分離而得的， 然而由于報告過牛海綿狀腦癥(BSE)的發(fā)病，因此希望有取而代之的蛋白多糖供給源及制造方法。水產動物組織是有力的蛋白多糖供給源替代候選。嘗試過提取水產動物鯨、鯊魚的軟骨中所含的蛋白多糖。但是，在這些水產動物的捕獲量方面存在限制，很難制造大量的蛋白多糖。另外，提取分離操作也很煩雜，在提取中所用的溶劑等中存在有毒性不低的物質，如此等等。由此，形成如下的狀況，即，產品的用途受到限制，特別是難以用于食品或化妝品的制造中。此種狀況下，研究了各種各樣的蛋白多糖制造方法。例如，專利文獻1中，記載有如下的蛋白多糖的提純方法，其特征在于，用溶劑提取對鮭魚的鼻軟骨進行粉碎及脫脂處理而得的脫脂干燥粉末，進行從所得的提取液中分離提純粗蛋白多糖的后透析。但是，該方法中將氯仿、甲醇等毒性不低的有機溶劑作為提取溶劑使用，另外，還有在所得的蛋白多糖中殘存有腥臭等問題。另外，專利文獻2中記載有使用乙酸作為提取溶劑從鮭魚鼻軟骨中提純蛋白多糖的方法。專利文獻3中顯示，在利用專利文獻2記載的提純方法提純出的蛋白多糖中具有纖維芽細胞繁殖促進作用及玻尿酸合成促進作用。如此所述，對于蛋白多糖的制造方法、其用途及效果，現在也還在進行著研究。專利文獻專利文獻1日本特開2001-172^6號公報專利文獻2日本特開2002-069097號公報專利文獻3日本特開2008-247803號公報

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，使用毒性低的溶劑，從魚類軟骨中制造新型的含有蛋白多糖的組合物(蛋白多糖含有物)，以及找出該蛋白多糖含有物的新用途及優(yōu)異的效果。本發(fā)明人等發(fā)現，令人吃驚的是，從魚類的軟骨中利用特定的步驟提取而得的、含有酸性糖成分的提取物包含具有與以往已知的蛋白多糖相比更大的分子量的蛋白多糖。此外還發(fā)現，該提取物發(fā)揮出各種優(yōu)異的效果，反復加以改良而完成了本發(fā)明。予以說明，本說明書中，有時將酸性糖、以及具有酸性糖作為構成成分的化合物稱作酸性糖成分。蛋白多糖是具有將酸性糖與蛋白質結合而成的結構的物質，因此與該化合物相當。所以，蛋白多糖是酸性糖成分的1種。本發(fā)明的蛋白多糖含有物包含蛋白多糖及酸性糖作為酸性糖成分。所以，也可以將本發(fā)明的蛋白多糖含有物改稱為酸性糖成分含有物。本發(fā)明例如包含以下的項目中記載的蛋白多糖含有物、含有該含有物的組合物寸。項目1.一種蛋白多糖含有物，其是從魚類的軟骨中得到的、包含蛋白多糖及酸性糖作為酸性糖成分的蛋白多糖含有物，其中包含分子量為2000kDa以上的酸性糖成分。項目2.根據項目1中記載的蛋白多糖含有物，包含分子量為5000kDa以上的蛋白多糖。項目3.根據項目1或2中記載的蛋白多糖含有物，酸性糖成分的50質量％以上具有 2000kDa以上的分子量。項目 4.根據項目1 3中任一項記載的蛋白多糖含有物，蛋白多糖的20質量％以上具有 IOOOOkDa以上的分子量。項目5.根據項目1 4中任一項記載的蛋白多糖含有物，酸性糖成分的20質量％以上為蛋白多糖。項目 6.一種飲食品組合物，包含項目1 5中任一項記載的蛋白多糖含有物。項目7.一種口腔用組合物，包含項目1 5中任一項記載的蛋白多糖含有物。項目 8.一種化妝品組合物，包含項目1 5中任一項記載的蛋白多糖含有物。項目9.一種蛋白多糖，其是從魚類的軟骨中提取出的蛋白多糖，分子量為5000kDa以上。本發(fā)明的蛋白多糖含有物能夠起到出色的皮膚纖維芽細胞繁殖效果、皮膚屏蔽功能增強及改善效果、皮膚膠原蛋白產生能力增強及改善效果、真皮肥厚抑制效果等、對于皮膚的保濕及抗老化來說有利的效果。


圖1是表示在本發(fā)明中考慮表示蛋白多糖的峰面積時的步驟的示意圖。圖2是表示將來源于鮭魚鼻軟骨的粉末(左圖)及來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物(右圖)作為樣品，用凝膠過濾色譜(使用kphar0SeCL-2B填充柱)處理，每次 ImL地采取洗脫餾分，分別用咔唑硫酸法及UV吸收法對該各餾分中所含的酸性糖量及蛋白質量進行定量而得的結果。圖3是表示對市售的蛋白多糖(PG-K)及市售的粘多糖(PG-M ；作為軟骨素銷售)進行凝膠過濾色譜處理、并將各洗脫餾分中所含的酸性糖量定量而得的結果。將PG-M的結果表示于左圖中，將PG-K的結果表示于右圖中。圖4表示對葡聚糖分子量標示物進行凝膠過濾色譜、并利用苯酚·硫酸法將各洗脫餾分中所含的糖量(即葡聚糖量)定量而得的結果。圖5表示以由圖4得到的、各分子量標示物所洗脫的液體量為基準制成的標準線。圖6表示將圖1及圖2所示的酸性糖量測定結果匯總而得的曲線圖。圖7表示將來源于鮭魚鼻軟骨的粉末作為樣品用凝膠過濾色譜(使用S^hacryl S-1000SF填充柱)處理，每次ImL地采集洗脫餾分，用咔唑硫酸法對該各餾分中所含的酸性糖量進行定量而得的結果。圖8表示對來源于鮭魚鼻軟骨的粉末、以及來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物的、人皮膚纖維芽細胞繁殖能力研究而得的結果。圖9表示對來源于鮭魚鼻軟骨的粉末、以及來源于魚鼻軟骨的粉末的水提取物因經口攝取而對皮膚屏蔽功能(TEffL值)造成的影響研究而得的結果。圖10表示來源于鮭魚鼻軟骨的粉末、以及來源于魚鼻軟骨的粉末的水提取物因經口攝取而對皮膚彈性造成的影響研究而得的結果。圖11表示來源于鮭魚鼻軟骨的粉末、以及來源于魚鼻軟骨的粉末的水提取物因經口攝取而對皮膚的膠原蛋白產生能力造成的影響研究而得的結果。圖12表示為了研究來源于鮭魚鼻軟骨的粉末、以及來源于魚鼻軟骨的粉末的水提取物對真皮皮厚造成的影響而測定將它們經口投放后的小鼠的背部的真皮皮厚的結果。圖13表示對來源于鮭魚鼻軟骨的粉末、以及來源于魚鼻軟骨粉末的水提取物因經皮投放而對皮膚屏蔽功能(TEffL值)造成的影響研究而得的結果。圖14表示使用了離子交換色譜及凝膠過濾色譜的、來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物的分級的概要。圖15表示對來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物的分級級別研究細胞繁殖效果的結果。具體來說，表示從添加各樣品(50 μ g/ml)起7天后的細胞數。而且，所謂“PGNP 水提取物”表示來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物。圖16表示對來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物的分級級別研究細胞繁殖效果的結果。具體來說，表示從添加各樣品(10yg/ml)起7天后的細胞數。
具體實施例方式下面，對本發(fā)明進行更詳細的說明。而且，以下記載的酸性糖及蛋白多糖的分子量值及平均分子量值是在凝膠過濾色譜分析中將葡聚糖作為分子量標示物使用時算出的值。本發(fā)明的蛋白多糖含有物是從魚類的軟骨中制造的。作為魚類沒有特別限制，然而具體來說可以舉出鱒魚(細鱗鱒魚、櫻鱒魚、五月鱒等)、鮭魚(白鮭、紅鮭、銀鮭、大鱗大馬哈魚、鋼頭鱒等)、鯊魚、鱈魚等。優(yōu)選鮭魚科鮭魚屬的魚，特別優(yōu)選鮭魚或鱒魚。另外，作為軟骨，沒有特別限制，然而優(yōu)選頭部軟骨，尤其優(yōu)選鼻軟骨。另外，由于魚類被加工為食品產品等時頭部通常被廢棄，因此頭部軟骨的獲得成本很低，從而還具有可以大量地穩(wěn)定供給的優(yōu)點。本發(fā)明中，所謂酸性糖成分是指酸性糖及具有酸性糖作為構成成分的化合物。本發(fā)明的蛋白多糖含有物含有酸性糖成分(即酸性糖及具有酸性糖作為構成成分的化合物)。這里所說的酸性糖是含有糖醛酸的多糖類。本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖例如可以舉出玻尿酸、硫酸軟骨素等粘多糖。而且，玻尿酸以外的粘多糖通常以與蛋白質共價結合的形態(tài)(即作為蛋白多糖)存在。對于具有酸性糖作為構成成分的化合物，具體來說可以舉出蛋白多糖。蛋白多糖具有將粘多糖及蛋白質共價結合而成的結構。構成蛋白多糖的粘多糖是具有加成了硫酸基的2糖的重復結構的酸性糖，具體來說可以例示出硫酸軟骨素、硫酸皮質素、硫酸乙酰肝素等。也就是說，蛋白多糖是具有蛋白質與酸性糖結合而成的結構的化合物。在這些酸性糖成分所具有的2糖的重復結構中，該2糖當中通常一個是氨基糖，另一個是糖醛酸。所以，在酸性糖成分的檢測中，可以使用作為糖醛酸檢測法的常法之一的咔唑硫酸法。所謂咔唑硫酸法是如下的方法，即，將作為糖醛酸的葡萄糖醛酸(GlcA)及作為艾杜糖醛酸的顯色色素的咔唑溶液添加到測定檢體中，使用分光光度計測定吸光度。使用規(guī)定了濃度的葡萄糖醛酸標準溶液制成標準線，求出檢體中的葡萄糖醛酸含量。更具體來說， 例如可以如下所示地進行。將在IOOml的濃硫酸中溶解了硼酸鈉· 10水合物0. 95g的試劑取入試管中，進行冰浴冷卻。再在其中將受檢體0. 5ml (使之包含4 40 μ g的糖醛酸)靜置而實現多層化。 進行水冷并充分攪拌使溫度不達到室溫以上。用玻璃球蓋上蓋后，在沸騰熱水浴中加熱10 分鐘，水冷到室溫。向其中加入0. Iml的在無水甲醇IOOml中溶解了 125mg咔唑的試劑而混合，再在沸騰熱水浴中加熱15分鐘。其后，水冷到室溫，測定530nm的吸光度。空白樣使用的是0. 5ml蒸餾水。同時，使用葡萄糖醛酸制成標準線。本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分的平均分子量通常約為 2000kDa 40000kDa，優(yōu)選為 2500kDa 30000kDa，更優(yōu)選為 3000kDa 20000kDa，進一步優(yōu)選為 3000kDa IOOOOkDa,特別優(yōu)選為 4000kDa 8000kDa。本發(fā)明的蛋白多糖含有物中，含有分子量為2000kDa以上的酸性糖成分。優(yōu)選含有2500kDa以上、更優(yōu)選含有3000kDa以上、進一步優(yōu)選含有4000kDa以上、更進一步優(yōu)選含有5000kDa以上的酸性糖成分。另外，本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分優(yōu)選其50質量％以上、更優(yōu)選其陽質量％以上、進一步優(yōu)選其60質量％以上、更進一步優(yōu)選其65質量％以上具有 2000kDa以上的分子量。本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖與以往所制造的蛋白多糖相比，分子量(MW)明顯更大。具體來說，本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的分子量即使是小的也有大約5000kDa 6000kDa以上。即，在本發(fā)明的蛋白多糖含有物中，包含具有約5000kDa以上的分子量的蛋白多糖。在本發(fā)明的蛋白多糖含有物中，例如可以包含約 5000kDa 100000kDa、優(yōu)選 5000kDa 90000kDa、更優(yōu)選 5000kDa 80000kDa、進一步優(yōu)選5000kDa 70000kDa的蛋白多糖。此外，本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的平均分子量沒有特別限制，然而通常為約6000kDa 60000kDa，優(yōu)選為約7000kDa 50000kDa，更優(yōu)選為約 9000kDa 40000kDa。
另外，本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖優(yōu)選其20質量％以上、更優(yōu)選其30質量％以上具有6000kDa以上(更優(yōu)選為IOOOOkDa以上)的分子量。而且，本發(fā)明的蛋白多糖含有物以干燥質量換算，優(yōu)選包含15 70質量％、更優(yōu)選包含30 70質量％的酸性糖成分。另外，本發(fā)明的蛋白多糖含有物以干燥質量換算，優(yōu)選包含4 40質量％、更優(yōu)選包含10 40質量％、進一步優(yōu)選包含15 40質量％的蛋白多糖。本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分或蛋白多糖的分子量可以使用色譜等來測定。特別適合使用凝膠過濾色譜來測定。具體來說，例如只要作為色譜柱的載體使用瓊脂糖系(瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖等)的凝膠，作為緩沖液使用磷酸緩沖液(優(yōu)選含有氯化鈉的緩沖液)即可?？梢詫Φ鞍锥嗵呛形镞M行凝膠過濾，根據酸性糖成分或蛋白多糖被洗脫前的液量(洗脫液量)來決定該組合物中所含的酸性糖成分或蛋白多糖的分子量。予以說明，由于蛋白多糖具有將粘多糖(mucopolysuccharide)與蛋白質共價結合而成的結構，因此在進行色譜處理時，可以通過對酸性糖及蛋白質進行監(jiān)測，來檢出蛋白多糖的洗脫。也就是說，將對酸性糖進行監(jiān)測而得的色譜圖、和對蛋白質進行監(jiān)測而得的色譜圖重疊，如果在兩個色譜圖中在大致相同的洗脫液量范圍中有峰，則可知該峰是檢出蛋白多糖的峰。例如在酸性糖的監(jiān)測中可以使用咔唑硫酸法?？梢悦看畏秩∫欢康纳V的洗脫餾分，利用咔唑硫酸法將各分取餾分中所含的酸性糖量定量而決定。另外，例如，在蛋白質的監(jiān)測中可以使用UV吸收法(測定在^Onm附近具有吸收的色氨酸·酪氨酸·苯基丙氨酸的吸光度而將蛋白質定量的方法)、茚三酮反應、BCA法、Bradford法、Lowry法、雙縮脲法等。尤其是，利用UV吸收法來定量十分簡便。而且，在根據洗脫液量決定分子量時，只要對分子量標示物同樣的進行凝膠過濾色譜處理，測定該分子量標示物被洗脫的液量而制成標準線(洗脫液量ν s分子量)即可。 分子量標示物可以考慮上述的蛋白多糖含有物的分子量值、所用的凝膠的種類等，選擇、買入適當的材料使用。例如，可以使用由葡聚糖構成的分子量標示物。此種分子量標示物可以從SIGMA等買入。在本發(fā)明的蛋白多糖含有物中，還含有酸性糖成分以外的來源于魚類軟骨的成分。作為此種成分，例如可以舉出膠原蛋白等蛋白質、鹽類等。本發(fā)明中，所謂物質的平均分子量是指如下求出的分子量，即，在利用凝膠過濾色譜對該物質進行分析而得的色譜圖中，引出將該物質的峰的面積2等分的、垂直于橫軸(洗脫液量)的線O等分線)，根據相當于該2等分線位置的洗脫液量使用標準線求出。具體來說，是指利用實施例的“蛋白多糖含有物的分子量的研究”中記載的方法求出的分子量。例如，對于蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分的平均分子量，將蛋白多糖含有物用凝膠過濾色譜分離，在對其中所含的酸性糖成分進行監(jiān)測而得的色譜圖中，引出將該色譜圖的面積2等分的線，根據相當于該2等分線位置的洗脫液量使用標準線(即，將該洗脫液量帶入標準線的方程式)而求出分子量值，將該值作為平均分子量。對于酸性糖成分的監(jiān)測，如果更具體地進行說明，則是將蛋白多糖含有物加以凝膠過濾色譜分析，以一定速度進行洗脫，每次一定量地回收洗脫液，對所回收的各洗脫液(餾分)中含有何種程度的酸性糖進行定量，將結果作為色譜圖即可。另外，對于蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的平均分子量，在利用凝膠過濾色譜分析蛋白多糖含有物而得的色譜圖中，引出將表示蛋白多糖的峰的面積2等分的線，根據相當于該2等分線位置的洗脫液量使用標準線求出分子量值，將該值作為平均分子量。如前所述，將對酸性糖進行監(jiān)測而得的色譜圖、和對蛋白質進行監(jiān)測而得的色譜圖重疊，在兩個色譜圖中存在于大致一致的位置的峰是表示蛋白多糖的峰。在表示蛋白多糖的峰的上升沿或下降沿因與其他的酸性糖成分的峰重疊而無法確認的情況下，根據峰的形狀來推定上升沿及下降沿。此后，根據所推定的上升沿或下降沿來求出分子量或平均分子量。作為例子，圖1中表示出無法確認下降沿時的峰的輪廓的推定方法的概要。圖1中，引出峰的下降的延長線而決定峰的輪廓。在求酸性糖成分及蛋白多糖的任意一個的分子量或平均分子量時，也優(yōu)選分析對酸性糖進行監(jiān)測而得的色譜圖。另外，在進行凝膠過濾色譜時，也可以通過僅回收與表示蛋白多糖的峰相當的餾分，來提純本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖。另外，也可以通過包含表示蛋白多糖的峰地回收途中以前的餾分，來得到平均分子量更大的蛋白多糖含有物。本發(fā)明的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分通常其20質量％以上、優(yōu)選20 60質量％、更優(yōu)選25 55質量％、進一步優(yōu)選30 50質量％為蛋白多糖。在該酸性糖成分中所占的蛋白多糖的比例可以根據上述的為求出酸性糖成分或蛋白多糖的分子量而使用的色譜圖來求出。即，通過在對蛋白多糖含有物的酸性糖成分進行監(jiān)測而得的色譜圖面積中，求出表示蛋白多糖的峰的面積所占的比例，來求出在酸性糖成分中所占的蛋白多糖的比例。本發(fā)明的蛋白多糖含有物如上所述，由魚類軟骨中制造。具體來說，可以通過利用乙醇處理將魚類軟骨脫脂而制造。另外，可以從脫脂了的魚類軟骨中進行水提取而制造。例如可以利用以下的工序來制造。工序(1)水處理工序將魚類的含軟骨組織(例如魚類頭部)在常溫或低溫(約0 40°C )的水中浸漬幾分鐘 幾天左右。既可以靜置浸漬，也可以一邊攪拌一邊浸漬，還可以使用管路攪拌器等與水混合攪拌。水的量沒有特別限制，然而優(yōu)選為將該含軟骨組織整體浸泡的量。這樣，由于將該組織的腥臭去掉，并且向該組織中滲透水而膨脹，因此很容易除去軟骨以外的部分。 而且也可以在浸漬到水中之前，先將該含軟骨組織預先切片或粗粉碎，或者將軟骨以外的組織中可以除去的組織預先除去等。在浸漬到水中而將組織脫臭、適度地膨脹的階段，從魚類的含軟骨組織中提取脂肪等(即，將含軟骨組織脫脂)。該脂肪等溶解或懸浮在水等中，或者成為脂肪層而漂浮在水層上。通過除去該水層及脂肪層，而除去含軟骨組織中所含的脂肪。也可以利用離心分離將這些不需要物質分離除去。工序O):乙醇處理工序將除去脂肪層及水層后得到的殘渣(軟骨組織)回收，向該殘渣中加入乙醇，進一步提取脂肪而除去。通過除去脂肪，還會更加高度地加以脫臭。而且，也可以使用含水乙醇。 另外，優(yōu)選在加入有機溶劑前將殘渣(軟骨組織)粉碎。粉碎方法沒有特別限制，然而例如可以使用可以將軟質物質微粉碎的球磨機、振動式磨機、低溫粉碎機、冷凍粉碎機、滾動球磨機、粉碎混合機、混合磨等來進行。另外，粉碎粒度也沒有特別限制，然而優(yōu)選為10 500 μ m左右，更優(yōu)選為50 250 μ m左右。而且，該粒度可以利用激光衍射散射法來測定。具體來說，例如，向如上所述地得到的軟骨組織(優(yōu)選為粉碎軟骨組織)中，加入將該組織充分浸漬的容量的乙醇而靜置或攪拌，其后除去該溶劑即可。另外，優(yōu)選將該操作反復進行多次(例如2 5次)。或者，也可以使乙醇循環(huán)地進行脂肪除去處理。該情況下，例如可以優(yōu)選使用索氏提取器等。此種處理之后，回收固體成分。也可以將所回收的固體成分風干等，而將有機溶劑完全地除去?？梢詫⑷绱说玫降墓腆w成分作為蛋白多糖含有物使用。如果對上述工序⑵舉出更具體的一個例子，則例如可以利用包括下面的〔1〕 〔9〕中記載的工序的方法來進行該工序O)?！?〕將除去了皮、硬骨等附著物的鮭魚鼻軟骨用絞肉機粗粉碎?！?〕向粉碎了的鮭魚鼻軟骨中，加入鮭魚鼻軟骨的相同量 2倍量(體積)的 PH6 7. 5的自來水或凈化水，在40°C以下的溫度下充分地攪拌?！?〕攪拌后，進行離心分離機處理，采集固體成分。〔4〕將〔2〕及〔3〕的處理反復進行1或2次?！?〕將所得的固體成分使用公知的濕式粉碎機進一步微粉碎?！?〕加入微粉碎鮭魚微軟骨的約10倍量(體積)左右的95°以上的純度的乙醇， 在40°C以下的溫度下充分地攪拌?！?〕攪拌后，進行離心分離機處理，采集固體成分。〔8〕將〔6〕及〔7〕的處理反復進行1 3次。〔9〕根據需要進行干燥。而且，在上述〔5〕中，也可以將所得的固體物暫時冷凍干燥后進行微粉碎。工序(3)水提取處理工序更優(yōu)選將工序O)中得到的固體成分再提供給借助水的提取工序，將用水提取出的物質作為蛋白多糖含有物使用。例如，加入能夠將工序O)中得到的固體成分充分地浸漬的量的水，攪拌后，將除去不溶物而得的溶液或其干燥物作為蛋白多糖含有物使用。所用的水通常來說pH為5. 5 8. 0，優(yōu)選pH6. 0 7. 5，更優(yōu)選ρΗ6· 5 7. 5。具體來說，例如， 在水中浸漬30分鐘 6小時左右的同時攪拌，或者在利用管路混合器等與水混合攪拌等后，除去不溶物即可。除去不溶物后，也可以使用公知的方法將其干燥。另外，除去不溶物后，也可以加入以容量計為2 10倍量的乙醇，將所生成的固體成分回收。該情況下，也可以在加入乙醇前添加氯化鈉。如果對上述工序(3)舉出更具體的一個例子，則例如可以在進行上述〔1〕 〔9〕 后，如下面的〔10〕 〔12〕中記載的那樣進行該工序(3)。〔 10〕加入〔9〕中得到的干燥物的相同量 2倍量(體積)左右的ρΗ6 7. 5的凈化水，在40°C以下的溫度充分地攪拌30分鐘 48小時左右?！?1〕進行離心分離處理，除去固體成分。〔12〕根據需要進行干燥。而且，也可以在上述〔11〕之后，再添加乙醇而攪拌，將所生成的固體成分回收。如上所述，也可以說，本申請發(fā)明的蛋白多糖含有物是經過(A)提純魚類軟骨的工序；
(B)使用有機溶劑從魚類軟骨中除去脂肪的工序；(C)使用已經除去脂肪的魚類軟骨，再進行水提取，回收提取物的工序的(A) (B)或(A) (C)制造的。(A)、⑶、(C)工序分別相當于上述的(1)、⑵、⑶工序。本發(fā)明的蛋白多糖含有物可以理想地用于皮膚的抗老化。皮膚因各種要因而每天受到傷害。例如，在表皮層中，因外在要因(例如紫外線等光照射等)或內在要因(例如老齡化等)而使表皮屏蔽功能降低，經表皮透過散失水分量(trans印idermal water loss TEffL)升高。由此，肌膚變得干燥、或引起肌膚粗糙等。另外，基于相同的理由，在真皮中，也會引起膠原蛋白產生能力的降低、皮膚彈性的降低、真皮層的肥厚等，加劇皮膚的僵固化。 由此，會在皮膚中產生褶皺等。本發(fā)明的蛋白多糖含有物具有抑制及改善此種皮膚的癥狀的多種效果(皮膚纖維芽細胞繁殖效果、皮膚屏蔽功能增強及改善效果、皮膚膠原蛋白產生能力增強及改善效果、真皮肥厚抑制效果等對于皮膚的保濕及抗老化有利的效果)，特別是可以理想地用于對由光(尤其是紫外線)照射引起的上述的皮膚癥狀的預防及改善。本發(fā)明的蛋白多糖含有物的使用方式沒有特別限制，然而特別優(yōu)選用在口腔護理領域、化妝品領域及飲食品領域中。所以，在本發(fā)明中，包括含有本發(fā)明的蛋白多糖含有物的口腔用組合物、含有本發(fā)明的蛋白多糖含有物的化妝品組合物、以及含有本發(fā)明的蛋白多糖含有物的飲食品組合物。口腔護理領域中所用的含有蛋白多糖含有物的口腔用組合物(以下有時記作“本發(fā)明的口腔用組合物”)可以通過將本發(fā)明的蛋白多糖含有物與口腔用組合物中所用的其他成分(例如研磨劑、發(fā)泡劑、清洗劑、表面活性劑、濕潤劑、PH調節(jié)劑、增稠劑、香味劑等) 適當地配合來制造。例如，可以利用常法以糊劑、軟膏劑、凝膠劑、涂布劑、噴霧劑、填補劑、 液體劑、漱口劑、軟膏劑、口香糖、糖錠劑、片劑等形態(tài)來制造。此種本發(fā)明的口腔用組合物特別是通過向口腔內涂布、噴霧或者漱口等，會特別地使口腔內的纖維芽細胞繁殖，增強、改善皮膚屏蔽功能，增強、改善皮膚膠原蛋白產生能力，因此適用于口腔組織的再生、防老化。本發(fā)明的口腔用組合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量并沒有特別限制，然而相對于組合物整體來說，通常為0. 002 13質量％，優(yōu)選為0. 01 5質量％，更優(yōu)選為0. 02 3質量％。另外，該口腔用組合物的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的量沒有特別限制，然而相對于組合物整體來說，通常為0. 001 5質量％，優(yōu)選為0. 005 2質量％，更優(yōu)選為0.01 1質量％?；瘖y品領域中使用的、含有本發(fā)明的蛋白多糖含有物的化妝品組合物(以下有時記作“本發(fā)明的化妝品組合物”)可以通過將本發(fā)明的蛋白多糖含有物與容許用于化妝品用途的介質、基劑、載體、添加劑、或其他容許用于化妝品用途的成分、材料適當地配合，依照常法來制造。具體來說，可以舉出包含本發(fā)明的蛋白多糖含有物地制造的乳液、化妝水、霜、 美容液、粉底、剝撕式面膜、防曬霜等。此種本發(fā)明的化妝品組合物可以作為防曬用、曬后修復用、保濕用及抗皮膚老化用(例如干燥皮膚、皮膚粗糙、皮膚的褶皺、松弛等的預防或改善用)使用。本發(fā)明的化妝品組合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量，沒有特別限制，相對于組合物整體來說，通常為0. 002 5質量％，優(yōu)選為0. 02 2質量％，更優(yōu)選為0. 1 2質量％。此外，該化妝品組合物的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的量相對于組合物整體來說，通常為0. 001 2質量％，優(yōu)選為0.01 1質量％，更優(yōu)選為0. 05 1質量％。飲食品(飲料及食品)領域中使用的、含有本發(fā)明的蛋白多糖含有物的飲食品組合物(以下有時記作“本發(fā)明的飲食品組合物”)是將本發(fā)明的蛋白多糖含有物、食品衛(wèi)生學上容許的基劑、載體、添加劑、或其他可以作為食品利用的成分、材料等適當地配合而得的物質。例如，可以例示出含有本發(fā)明的蛋白多糖含有物的、保濕用及抗皮膚老化用(例如干燥皮膚、皮膚粗糙、皮膚的褶皺、松弛等的預防或改善用)的加工食品、飲料、健康食品 (營養(yǎng)功能食品、特定保健用食品等)、保健品、美容食品、病人用食品等。此外，此種包含本發(fā)明的飲食品組合物的保濕劑、抗皮膚老化劑也包含于本發(fā)明中。該保濕劑、抗皮膚老化劑可以以美容用或抗皮膚老化用(例如干燥皮膚、皮膚粗糙、皮膚的褶皺、松弛等的預防或改善用)的飲用劑、錠劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、膠凍劑、糖錠劑等形態(tài)提供。對于本發(fā)明的飲食品組合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量，沒有特別限制，在食品組合物或包含食品組合物的劑的情況下，相對于組合物或劑整體來說，通常為 0.01 50質量％，優(yōu)選為0.02 25質量％，更優(yōu)選為0. 1 8質量％。另外，在飲料組合物或包含飲料組合物的制劑的情況下，本發(fā)明的飲食品組合物的蛋白多糖含有物中所含的酸性糖成分量，沒有特別限制，相對于組合物或劑整體來說，通常為0. 002 13質量％， 優(yōu)選為0.01 8質量％，更優(yōu)選為0. 1 2質量％。此外，對于該飲食品組合物的蛋白多糖含有物中所含的蛋白多糖的量，在食品組合物或包含食品組合物的制劑的情況下，相對于組合物或劑整體來說，通常為0. 005 20質量％，優(yōu)選為0. 01 10質量％，更優(yōu)選為 0. 05 3質量％。在飲料組合物或包含飲料組合物的制劑的情況下，相對于組合物或劑整體來說，通常為0. 001 5質量％，優(yōu)選為0. 005 3質量％，更優(yōu)選為0. 01 1質量％。此外，如果將本發(fā)明的蛋白多糖含有物與玻尿酸或膠原蛋白一起使用，則會提高本發(fā)明的蛋白多糖含有物的效果，因此優(yōu)選。所以，在上述的本發(fā)明的口腔用組合物、化妝品組合物、飲食品組合物中，也優(yōu)選還配合玻尿酸和/或膠原蛋白(優(yōu)選膠原蛋白水解物)。 特別是，通過將本發(fā)明的蛋白多糖含有物與玻尿酸一起經口攝取，會進一步提高皮膚的保濕效果及抗老化效果，因此優(yōu)選。雖然沒有特別限制，然而在將本發(fā)明的蛋白多糖含有物設為1質量份時，可以并用0.01 1質量份、優(yōu)選0. 02 0.5質量份、更優(yōu)選0. 05 0.2質量份的玻尿酸。而且，該本發(fā)明的口腔用組合物、化妝品組合物、及飲食品組合物中所含的酸性糖成分的量例如可以利用咔唑硫酸法求出。另外，可以根據將這些組合物用凝膠過濾色譜分析而得的、酸性糖檢測色譜圖來求出。另外，對于這些組合物中所含的蛋白多糖的量，例如可以將這些組合物用凝膠過濾色譜分析，將酸性糖檢測色譜圖及蛋白質檢測色譜圖重疊， 通過將重復的峰作為蛋白多糖的形式檢出、定量來決定。另外，本發(fā)明還包括通過將本發(fā)明的蛋白多糖含有物向皮膚或口腔內涂布而獲得使纖維芽細胞繁殖、或者使皮膚屏蔽功能增強、改善等本說明書中記載的效果的方法。該方法中，也可以原樣不變地使用本發(fā)明的蛋白多糖含有物。另外，可以優(yōu)選使用上述的本發(fā)明的口腔用組合物、化妝品組合物。適用該方法的對象沒有特別限制，然而優(yōu)選特別是因老化或日曬而使皮膚屏蔽功能降低的人。另外，也可以出于美容目的來使用。使用量也沒有特別限制，可以適當地設定必需量。此外，本發(fā)明還包括通過將本發(fā)明的蛋白多糖含有物經口攝取而獲得使纖維芽細胞繁殖、使皮膚屏蔽功能增強、改善、使皮膚彈性改善、抑制真皮皮厚、或使皮膚膠原蛋白產生能力增強、改善等本說明書中記載的效果的方法。該方法中，也可以原樣不變地使用本發(fā)明的蛋白多糖含有物。另外，可以優(yōu)選使用上述的本發(fā)明的飲食品組合物。適用該方法的對象沒有特別限制，然而優(yōu)選特別是因老化或日曬而使皮膚屏蔽功能降低的人、皮膚彈性降低的人等。另外，也可以出于美容目的來使用。使用量也沒有特別限制，可以適當地設定必需量。實施例以下，具體地說明本發(fā)明，然而本發(fā)明并不限定于下述的例子。蛋白多糖含有物的制造將鮭魚頭部浸漬在水中靜置1天，使之膨脹。然后，從鮭魚頭部除去鼻軟骨以外的組織而得到鮭魚鼻軟骨。將該鮭魚鼻軟骨粗粉碎，制成鮭魚鼻軟骨粉末。向該粉末IOOg 中加入水IOOmL,溫和地攪拌后，在室溫下靜置10分鐘，進行脫脂。其后，進行離心分離 (SOOOrpm, 30分鐘，室溫)，回收所得的殘渣(鮭魚鼻軟骨脫脂粉末)，冷凍干燥。將冷凍干燥了的鮭魚鼻軟骨脫脂粉末9. 02g用超離心粉碎機制成粒徑約100 200 μ m(利用激光衍射散射法測定)的細粉末。此后，使用20mL的乙醇將該細粉末清洗3次后風干，得到含有酸性糖成分的細粉末7. 69g。以下有時將該細粉末稱作“來源于鮭魚鼻軟骨的粉末”。而且， 這里所說的使用乙醇的“清洗”是將細粉末分散于乙醇中后離心回收沉淀的操作(乙醇沉淀)。繼而，向來源于鮭魚鼻軟骨的粉末20g中加入IOOOmL的常溫的凈化水(pH6.5)，攪拌30分鐘后，在室溫下靜置10分鐘。其后，進行離心分離(SOOOrpm，30分，室溫)，回收上清液而濃縮干固，得到含有酸性糖成分的粉末約7g。以下有時將如此得到的水提取物稱作 “來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物”。在該來源于鮭魚鼻軟骨的粉末中，含有約20質量％的酸性糖成分、約9質量％的蛋白多糖(也就是說，含有約11質量％的粘多糖等酸性糖)。另外，在該來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物中，含有約35質量％的酸性糖成分、約15質量％的蛋白多糖(也就是說，含有約20質量％的粘多糖等酸性糖)。而且，該數字是在利用咔唑硫酸法將糖醛酸(葡萄糖醛酸)定量、繼而在該定量法中使用廣為人知的下式求出硫酸軟骨素量(質量)、并將其作為酸性糖成分量時的數字。[式1]軟骨素硫酸量=葡萄糖醛酸量X 2. 593而且，以下只要沒有特別指出，利用咔唑硫酸法求出的酸性糖成分量就表示與上述相同地求出的硫酸軟骨素量。另外，蛋白多糖的含有量可以如下算出，S卩，如下所示地在對酸性糖成分量利用糖醛酸定量進行監(jiān)測的同時，進行凝膠過濾色譜分析而得到色譜圖，根據該色譜圖中的表示蛋白多糖的峰在整個色譜圖中所占的面積比算出。也就是說，可以通過將該面積比乘以酸性糖成分量而算出。蛋白多糖含有物的分子量的研究
對所得的蛋白多糖含有物的分子量，利用凝膠過濾色譜進行了研究。具體來說，首先，將來源于鮭魚鼻軟骨的粉末及來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物作為樣品用下述條件的凝膠過濾色譜進行處理，每次ImL地采集洗脫餾分，將該各餾分中所含的酸性糖量及蛋白質量分別用咔唑硫酸法及UV吸收法定量。將作為該凝膠過濾色譜分析的結果得到的色譜圖表示于圖2中。其中，分析酸性糖量的色譜圖表示出利用咔唑硫酸法定量的葡萄糖醛酸量(不是將該葡萄糖醛酸量乘以 2. 593倍而作為硫酸軟骨素的量)。而且，對于來源于鮭魚鼻軟骨的粉末，為了提高純度而用4M鹽酸胍(4M GuCl)進行提取處理，將所得的提取物作為樣品使用。該提取處理具體來說是如下所示地進行的。向來源于鮭魚鼻軟骨的粉末Ig中加入4M GuCl，在4°C攪拌1天后離心分離，向上清液中加入3倍量的食鹽飽和乙醇而放置1晚后，離心分離而回收沉淀。 將該沉淀作為凝膠過濾色譜用樣品。將來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物直接作為樣品使用?！材z過濾色譜條件〕色譜柱kpharose CL-2B填充柱(以kpharose CL-2B作為載體而填充到φ IcmX 48cm的柱子中。kpharose CL-2B的葡聚糖的分級范圍是100 20000kDa，可以從GE Healthcare公司等處買到。Sepharose CL-2B是2 %交聯(lián)瓊脂糖，粒子粒徑60 200 μ m (基于激光衍射散射法得到)，CAS注冊編號65099-79-8。)緩沖液0. IM磷酸緩沖液(pH 7. 1，含有0. 2M NaCl)應用樣品量％ig(溶解于Iml緩沖液中使用)流速0. 15mL/min溜分量lmL/tube另外，對于市售的蛋白多糖(以下也稱作“PG-K”)及市售的粘多糖(軟骨素)(以下也稱作“PG-M”)，也在相同的條件下進行凝膠過濾色譜處理，將各洗脫餾分中所含的酸性
糖量定量。將結果表示于圖3中。如圖2所示，在洗脫液量約為15 23mL的范圍中，得到糖及蛋白質雙方的峰。所以可知，該峰表示蛋白多糖。然后，對于下述的各種葡聚糖分子量標示物，也分別在與上述相同的條件下(但是樣品量為Img)進行凝膠過濾色譜處理，利用苯酚·硫酸法將各洗脫餾分中所含的糖量(即葡聚糖量)定量。具體來說，依照Hodge, J. Ε. and Hofreiter，B. Τ.，Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)中記載的方法，如下所示地定量?！?1〕向105X 15_的試管中加入500 μ 1的試樣水溶液或標準單糖(甘露糖)水溶液?！?〕加入500 μ 1的苯酚試劑(5V/V%苯酚水溶液)，攪拌?！?〕加入2. 5ml的濃硫酸，立即劇烈攪拌10秒鐘?！?〕在室溫下放置20分鐘以上?！?〕用分光光度計測定490nm的吸收。<葡聚糖分子量標示物>Dextran from Leuconostoc mesenteroides (葡聚糖來自腸膜樣明串珠菌)(mol wt 5，000，000-40，000，000)(SIGMA)
· · 空隙體積測定用、IOOOOkDaDextran Mandard (葡聚糖標準)1,400, 000 (SIGMA) · · .HOOkDaDextran Standard 670, OOO(SIGMA) · · ‘ 670kDaDextran Standard 410, OOO(SIGMA) · · · 4IOkDaDextran Standard 270，000(SIGMA) · · · 270kDa而且，對于標示物 Dextran from Leuconostoc mesenteroides,是為了測定 kphar0SeCL-2B填充柱(分級上限20，OOOkDa)的空隙體積而使用的。為了更為準確地測定空隙體積，進行了將該標示物中所含的低分子的葡聚糖除去的前處理。前處理是通過利用上述的〔凝膠過濾色譜條件〕使Dextran from Leuconostoc mesenteroides洗脫，回收分子量20，OOOkDa以上的分子并冷凍干燥而進行的。具體來說，將與最先出現的峰相當的洗脫液量15 19mL的分級物回收，將其冷凍干燥(可以認為，由此可以將分子量20，OOOkDa 以上的分子回收、冷凍干燥)。此后，將該冷凍干燥物用于色譜柱中而進行測定。將結果得到的色譜圖表示于圖如 e中。而且，圖如是測定經過上述的前處理的冷凍干燥物的圖。對于圖如的來源于Leuconostoc mesenteroides的葡聚糖前處理物， 由于分子量超過所用的kphar0SeCL-2B填充柱的分級范圍(IOOkDa 20000kDa)，因此將與峰頂點位置對應的洗脫液量作為該色譜柱的排斥極限20000kDa的分子被洗脫的洗脫液量。而且，將該洗脫液量解釋為表示色譜柱的空隙體積(Void Volume)。對于圖4b e， 將與色譜圖的峰面積的2等分線的位置相當的洗脫液量作為各自的標示物分子量的分子被洗脫的時間點的洗脫液量。圖4b e分別是測定Dextran Standard 1400000,670000, 410000,270000的結果。將這些洗脫液量及分子量的關系加以曲線圖化，制成標準線，其結果是形成直線(y = -4. 1355Ln(x)+59. 47 ；R2 = 0. 9869)(圖5)，由此可以確認，利用該葡聚糖分子量標示物得到的分子量與洗脫液量的關系具有高度的相關性。此外，根據分析結果可知，在到達空隙體積前的洗脫液中含有蛋白多糖(即，存在超過分級極限的20000kDa的蛋白多糖)的可能性很高。該凝膠過濾色譜中所用的色譜柱由于分級范圍是IOOkDa 20000kDa，因此很有可能無法將20000kDa以上的分子準確地分級。所以，與上述相同，將來源于鮭魚鼻軟骨的粉末作為樣品進行了借助下述條件的凝膠過濾色譜進行分析及各餾分的酸性糖量的定量。〔凝膠過濾色譜條件〕色譜柱S印hacryl S-1000SF填充柱(將kphacryl S-1000SF作為載體填充到φ lcmX48cm的柱子中的材料。S^hacryl S-1000SF的葡聚糖的分級范圍是5X IO5 lXl(fDa，可以從GE Healthcare公司等處買到。)緩沖液0. IM磷酸緩沖液(ρΗ7· 1，含有0. 2Μ NaCl)應用樣品量Mmg流速0. 3mL/min溜分量lmL/tube此外，將以下的分子量標示物在相同的條件下進行凝膠過濾色譜處理，利用苯酚·硫酸法將各洗脫餾分中所含的糖量(即葡聚糖量)定量而制成標準線。<葡聚糖分子量標示物>Dextran from Leuconostoc mesenteroides(mo1 wt 5000000-40000000)(SIGMA)
· · · IOOOOkDaDextran Standard 1400000(SIGMA) · · · 1400kDaDextran Standard 670000(SIGMA) · · ‘ 670kDa所得的標準線是y = -3. 8743Ln (χ) +59. 887 (R2 = 0. 9961)將圖2及圖3中所示的酸性糖量測定結果曲線圖匯總在1個曲線圖中，再將記載有如上所述地得到的分子量與洗脫液量的關系的圖表示于圖6中。如上所述，對于來源于鮭魚鼻軟骨的粉末及來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物，在凝膠過濾色譜分析的洗脫量約15 23mL的范圍顯示出峰，而作為蛋白多糖的市售品的PG-M在約觀 49mL的范圍內， 同樣的作為市售品的PG-K在約18 47mL的范圍中顯示出峰。該結果表明，來源于鮭魚鼻軟骨的粉末及來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物(即，本發(fā)明的蛋白多糖含有物)含有與以往所知的蛋白多糖不同的非常高分子的蛋白多糖。另外，根據圖5中所示的標準線，可以算出洗脫量23mL相當于分子量約6700kDa。 根據該結果可知，來源于鮭魚鼻軟骨的粉末及來源于鮭魚鼻軟骨的粉末的水提取物含有分子量約6000kDa以上的蛋白多糖。此外，將使用kphacryl S-1000SF填充柱分析來源于鮭魚鼻軟骨的粉末得到的結果表示于圖7中。圖7中，色譜圖的最先顯示的表示蛋白多糖的峰的上升沿從洗脫液量 15 16mL的范圍開始。如果使用上述的標準線(y = -3. 8743Ln(χ)+59. 887)算出與該洗脫液量范圍相當的分子量，則大約為90000kDa。由此可知，來源于鮭魚鼻軟骨的粉末含有 90000kDa左右的蛋白多糖。根據以上的結果可以確認，來源于鮭魚鼻軟骨的粉末含有6000kDa 90000kDa左
右的蛋白多糖。此外，使用圖5中所示的標準線，根據圖6的各曲線圖的峰位置的洗脫液量算出各試樣中的蛋白多糖的平均分子量。通常來說，平均分子量是根據峰面積的2等分線位置的洗脫液量算出，然而圖6中所示的各色譜圖的蛋白多糖峰基本上是左右對稱的，因此將峰位置設為2等分線位置而進行算出。具體來說，將實驗誤差及批次差也考慮在內，將峰位置的洗脫液量士ImL的范圍的洗脫液量值設為標準線的y值，將所得的χ值的范圍設為各試樣中的蛋白多糖的平均分子量。但是，對于利用該分析得到的蛋白多糖的平均分子量的上限值而言，由于所用的色譜柱(kpharose CL-2B填充柱)的分級量上限是20000kDa，因此有可能無法準確地算出，所以還根據使用kphacryl S-1000SF填充柱時的結果，同樣地求出蛋白多糖的平均分子量。將結果表示于表1中。[表1]
權利要求
1.一種蛋白多糖含有物，其是從魚類的軟骨中得到的、包含蛋白多糖及酸性糖作為酸性糖成分的蛋白多糖含有物，其中，包含分子量為2000kDa以上的酸性糖成分。
2.根據權利要求1所述的蛋白多糖含有物，其中， 包含分子量為5000kDa以上的蛋白多糖。
3.根據權利要求1或2所述的蛋白多糖含有物，其中， 酸性糖成分的50質量％以上具有2000kDa以上的分子量。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的蛋白多糖含有物，其中， 蛋白多糖的20質量％以上具有IOOOOkDa以上的分子量。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的蛋白多糖含有物，其中， 酸性糖成分的20質量％以上為蛋白多糖。
6.一種飲食品組合物，其包含權利要求1 5中任一項所述的蛋白多糖含有物。
7.一種口腔用組合物，其包含權利要求1 5中任一項所述的蛋白多糖含有物。
8.一種化妝品組合物，其包含權利要求1 5中任一項所述的蛋白多糖含有物。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于，制造一種新型的蛋白多糖含有物，以及找出該蛋白多糖含有物的新用途和/或優(yōu)異的效果。本發(fā)明提供一種蛋白多糖含有物，其是從魚類的軟骨中得到的，包含分子量為2000kDa以上的酸性糖成分。該蛋白多糖含有物起到優(yōu)異的皮膚纖維芽細胞繁殖效果、皮膚屏蔽功能增強及改善效果、皮膚膠原蛋白產生能增強及改善效果、真皮肥厚抑制效果等對于皮膚的保濕及抗老化來說有利的效果。
文檔編號A61P17/16GK102573873SQ20108004045
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權日2009年7月16日
發(fā)明者伊藤圣子, 加藤陽治, 后藤昌史, 山本和司, 片方陽太郎 申請人:國立大學法人弘前大學, 太陽星光齒磨公司