專利名稱：使用多糖將治療劑傳遞到受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將治療劑靶向傳遞到特定細胞群，特別是肝細胞的方法。
背景技術(shù)：
使治療劑到達特定細胞的必要性治療劑是有效地改變患者某些生理功能給患者服用的制劑。這些試劑包括藥物，蛋白，激素，酶，核酶，肽，甾體，生長因子，酶活性調(diào)節(jié)因子，受體活性調(diào)節(jié)因子和維生素。本發(fā)明涉及使治療劑到達所選擇的細胞(也即靶細胞)，并因此增加治療劑在其中產(chǎn)生有益效果的細胞中的濃度，減少在其中產(chǎn)生毒性的細胞中的濃度。通過將治療劑傳遞到特定細胞，使之發(fā)揮藥效，而避免進行那些會對其產(chǎn)生藥物毒性的細胞，可增加治療劑的安全性和有效性。
與治療劑相比，診斷對比型試劑是根據(jù)使某些生理功能更明顯，而同時使其它生理功能不影響的目的給患者服用的制劑。這些診斷試劑包括用于閃爍照相法的放射性同位素，用于X-射線或計算機化X-射線照相術(shù)的電子密度標(biāo)記，和用于磁共振顯影的磁標(biāo)?；诰W(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)RES的靶向傳遞一種靶向傳遞治療劑的策略包括將這些試劑傳遞到吞噬細胞，也稱巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)它們在稱為網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的一系列器官中大量存在，RES的器官包括肝臟，脾臟和骨髓。吞噬作用是非特異性地將各種物質(zhì)包括膠體，粒子，脂質(zhì)體和微球體從血液中排除的過程。例如，右旋糖酐鐵，是葡萄糖被膠態(tài)氫氧化正鐵包覆用于治療貧血，它可被RES中具有吞噬活性的巨噬細胞慢慢從血液中清除。(Henderson et al.，34 Blood(1969)pp.357-375)。脂質(zhì)體包被的藥物也被用于治療這類疾病如利什曼原蟲病(Leishmania)Co′Mullane et al“BiopHarmaceutics ofMicroparticulate Drug Carriers”Ann.N.Y.Acad.Sci.(1987)507120-140)。微球體也被用于將治療劑傳遞到RES，用于刺激巨噬細胞的免疫功能(Kankte et al.“Interaction of Microspheres with blood constituents，II.Macrophage phagocytosis ofvarious type of polymeric drug carriers，”42 J.Parenternal Science and Technology(1988)pp.157-165)。但是，將治療劑傳遞到巨噬細胞很少應(yīng)用于不涉及巨噬細胞或巨噬細胞功能的疾病治療中?；赗ME的靶向傳遞另一種靶向傳遞治療劑的策略包括將治療劑結(jié)合到分子(也稱載體)上，通過受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞(RME)使其從血管腔隙中脫離。RME是分子在細胞外空間與特定的細胞表面受體結(jié)合，然后被吞入細胞的過程。通過RME吸收物質(zhì)是正常，健康的細胞的特征。RME轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可在正常巨噬細胞，肝細胞，纖維細胞和網(wǎng)狀細胞中找到。RME使細胞能從血漿中清除各種大分子，如低密度脂蛋白，鐵傳遞蛋白和胰島素。參見表1，Wilemanet et al.，232 Biochem.J.(1985)pp1-14，列出了進行RME的細胞，同時還包括RME的綜述。還可參見Menz，E.T.，PCT WO90/01295，1989年8月3日申請中的表I，這兩篇文獻這里引作參考。通過將治療劑結(jié)合到載體上進行RME，可將治療劑傳遞到無吞噬作用的細胞中，例如肝臟的肝細胞?；赗ME將治療劑靶向傳遞需要將治療劑結(jié)合到合適的受體分子上，以改變治療劑的生理分布。
診斷試劑也被結(jié)合到載體上進行通過RME的吸收，例如，載體與無唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受體相互作用，例如在動物研究中發(fā)現(xiàn)用放射性同位素制備的糖原白蛋白-99Tc對肝顯示出高特異性。(Vera et al，J.Nucl.Med.261157-1167，1985)。在另一個例子中，Groman et al，(U.S.5,284,646)，這里引作參考)將超導(dǎo)磁性金屬氧化物與糖蛋白結(jié)合在磁共振顯影時用作體內(nèi)對比試劑。用于RME靶向傳遞的載體一種類型的分子廣泛用作基于RME靶向傳遞治療劑的載體是糖蛋白。糖蛋白分子含有蛋白質(zhì)主鏈，并與多個低聚糖側(cè)鏈相連，它們通常含有2-20個單糖通過共價鍵與蛋白質(zhì)主鏈的N或O連接。(stryer L，Biochemistry，3d Ed.，NYW.N.Freeman Co.，pp.343-344(1988))。例如，已知一種受體為肝的無唾液酸糖蛋白受體可識別具有半乳糖殘基的糖蛋白并將它融入細胞。那些具有唾液酸連接到在低聚糖的半乳糖前末端基的糖蛋白缺乏與受體的親和性，但可通過除去末端的唾液酸使半乳糖暴露而轉(zhuǎn)化成可與受體結(jié)合的分子。例如，胎球蛋白可通過除去末端的唾液酸基轉(zhuǎn)化成無唾液酸胎球蛋白。被無唾液酸糖蛋白受體識別，并進行RME，是依賴于連接在低聚糖上的半乳糖基的數(shù)目和簇的排列。類似地，在巨噬細胞上的甘露糖受體識別具有甘露糖殘基的糖蛋白，并通過RME將它們?nèi)谌爰毎?。另一種可替換糖蛋白載體的是所稱的新糖蛋白，它是通過將多個單糖或二糖通過共價鍵連接到蛋白質(zhì)分子上合成的。新糖蛋白的一個例子是乳糖化的牛血清白蛋白，它可結(jié)合到肝無唾液酸糖蛋白受體上。
表1提供了幾個基于RME靶向傳遞的例子，它包括受體，細胞，治療劑和載體。要看進一步的綜述可參見Ranade，J.Clin.Pharmacol.，29685-694(1989)；和Bodmer et al.，Methods of Enzymology vol.112.，P.298，Academic Press(1985)。要看最近的綜述，可參見Meeier，Antiviral Research，18215-258(1992)；Meijer，Trends inDrug Research，vol 13，303-332；Meijer，Pharm.Res.6(2)105-118(1989)。
表1基于RME的靶向傳遞的受體，細胞，治療劑和載體受體/細胞 治療劑/載體 參考文獻半乳糖或無唾液酸 ara AMP/乳糖化 Fiumeet et al.，Lancet糖蛋白/肝細胞 的人血清白蛋白 213-15(1988)半乳糖或無唾液酸 乙酰半胱氨酸/ Wu and Wu，Hepatology糖蛋白/肝細胞 無唾液酸胎球蛋白5709-713(1985)半乳糖或無唾液酸 甲酰四氫葉酸/ Wu and Wu，Proc.Natl糖蛋白/肝細胞 無唾液酸胎球蛋白Acad.Sci.803078-3080(1983)半乳糖或無唾液酸 DNA/無唾液酸Wu and Wu，J.Biol.Chem.糖蛋白/肝細胞 α-酸性糖蛋白 26314621-14624(1988)甘露糖/T4淋AZT/甘露糖化Molema et al，Biochem巴細胞 白蛋白 Pharm.402603-2610(1990)甘露糖/巨噬細胞胞壁酰二肽/甘露糖 Roche et al.，Res.Virol，化白蛋白141，243-249RME的特征通過RME吸收顯示出配體-受體相互反應(yīng)的三個特性結(jié)構(gòu)特異性，飽和性和競爭性。
結(jié)構(gòu)特異性，受體可區(qū)分結(jié)構(gòu)極為近似的分子，只有分子結(jié)構(gòu)符合受體結(jié)合位點的結(jié)合需要的分子才能被融入細胞。通常RME中的受體是通過它們在融入細胞的能力或從環(huán)境中清除糖蛋白的能力被發(fā)現(xiàn)的。
飽和性，當(dāng)通過RME融入細胞的試劑的速率減少，伴隨著試劑濃度增加時可觀察到飽和性。這是因為，在高濃度時，受體接近于全部被占領(lǐng)或被配體飽和。
競爭性，當(dāng)一種分子在血液中的清除減少是由于出現(xiàn)了另一種結(jié)構(gòu)與第一種分子相似的物質(zhì)時，可觀察到競爭性。第二種分子競爭受體的結(jié)合位點并減少了第一種試劑融入細胞的比率而且當(dāng)高濃度的單一配體競爭有限數(shù)量的受體位點時，出現(xiàn)飽和性，競爭導(dǎo)致化學(xué)上不同的配體結(jié)合到有限數(shù)量的受體位點上。競爭可用于區(qū)分本發(fā)明的RME型的多糖與其它類型的多糖(參見表2)。糖蛋白和新糖蛋白作為治療劑載體存在的問題不管糖蛋白和新糖蛋白作為治療劑載體的應(yīng)用多少，這些載體會出現(xiàn)許多問題，其中某些在文獻中被討論過。
1.糖蛋白和新糖蛋白在進行RME時不是天然產(chǎn)物。使糖蛋白與無唾液酸糖蛋白受體相互作用需要對糖白蛋修飾，如除去末端的唾液酸使半乳糖殘基暴露。例如，胎球蛋白必須脫唾液酸化才能制成可與受體相互作用的載體。同樣的，新糖蛋白是通過將多個乳糖殘基接到的蛋白上合成的。
2.從牛源衍生來的糖蛋白可導(dǎo)致人的免疫反應(yīng)。有報道新糖蛋白對動物有致免疫作用。(Fium L.)Busi C.，Preti P.，Spinosa G.Cancer Drug Delivery，1987，4145-150)。
3.新糖蛋白和糖蛋白一般在結(jié)合合成中不允許有機溶劑的存在。本發(fā)明的實施例中用到了有機溶劑。
4.在合成新糖蛋白時，為了接上單糖或二糖，消耗了蛋白質(zhì)中帶正電荷的胺基(并中和)。其結(jié)果導(dǎo)致新糖蛋白有太多的負電荷。如此多的負電荷使得它更易被稱為凈化劑的受體吸收，而減少了治療劑通過RME傳遞到細胞的量(Kanke.M，Geissler RG，Powell D，Kaplan A，DeLuca P.J Parenteral Science and Technology，1988，42157-165)。
由于上述原因，需要尋找新方法定向傳遞治療劑到特定細胞，如果能找到改進的載體進行RME的靶向傳遞治療劑到特定細胞，問題也就解決了。這種載體對受體應(yīng)是高親和性的，并且在復(fù)合形成和與治療劑接合后保持親和力。另外，所期望的載體應(yīng)是天然的，易以純的形式得到，并且必須是無毒的。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種定向傳遞治療劑到特定細胞的方法，它通過使受治療者服用有效劑量的復(fù)合物，復(fù)合物含有結(jié)合在RME多糖上的治療劑，并且結(jié)合的RME多糖可與靶細胞上的RME受體結(jié)合，以使靶細胞可將治療劑融入靶細胞內(nèi)。
RME多糖可以是，例如阿拉伯半乳聚糖，阿拉伯膠或甘露聚糖。治療劑可以是，例如，抗病毒劑，激素，維生素，抗體，酶或基因。另一種情況是，一種RME多糖可以是另一種RME多糖的水解產(chǎn)物。
附圖簡述

圖1是RME多糖阿拉伯半乳聚糖的一般結(jié)構(gòu)。
圖2是RME多糖阿拉伯膠的一般結(jié)構(gòu)。
圖3是將治療劑通過RME多糖上的羧基連接到RME多糖上的詳細化學(xué)過程。
圖4是將治療劑通過RME多糖上的胺基連接到RME多糖上的詳細化學(xué)過程。
特別實施方案的詳述本發(fā)明涉及使用多糖載體將治療劑傳遞到特定細胞，而避開其它細胞，并通過這樣，提供通過受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞(RME)靶向傳遞治療劑到特定細胞的方法。靶向傳遞增加了治療劑在其中起有益作用或診斷功能的細胞中的濃度，減少了其在其中產(chǎn)生不希望的毒性的其它細胞中的濃度。許多治療劑產(chǎn)生毒性作用，但對于試劑在其中產(chǎn)生有益效果的細胞不產(chǎn)生毒性，而對不用于不需要有著作用的細胞產(chǎn)生毒性。
通過使用多糖載體定向傳遞治療劑到特定細胞，而避開其它細胞，本發(fā)明提供了增加已知治療劑的安全性和有效性的方法。例如，一種用于抑制肝炎病毒B在肝的肝細胞中復(fù)制的治療劑，可顯示出對骨髓細胞的毒性。由于骨髓的功能對于生命是必要的，對骨髓的毒性限性了可給患者施用的治療劑的用量。但是，依照本發(fā)明的實施方案，可將治療劑連接到載體上通過RME吸收，靶向傳遞到肝細胞，并減少了治療劑到達骨髓細胞的濃度。另外，治療劑的效能也增加了，因為以前分布到骨髓細胞的部分治療劑現(xiàn)在也到達了肝。涉及骨髓的副反應(yīng)可大大減少。本發(fā)明的RME多糖我們發(fā)現(xiàn)了一些多糖與RME中的受體相互作用，我們稱其為RME-多糖。RME多糖是從天然來源得到的天然多糖。例子包括可與肝細胞的無唾液酸糖蛋白受體相互作用的阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯膠，以及可與甘露糖受體(表1)相互作用的甘露聚糖。一般的多糖包括纖維素，淀粉，羥乙基淀粉，肝素，葡聚糖硫酸酯，羧甲基化的葡聚糖和羧甲基纖維素，它們不與RME的受體相互作用。RME多糖的特性RME多糖一般具有高度分支結(jié)構(gòu)。許多主鏈殘基具有至少3個分支點，且許多分支使得產(chǎn)生許多末端單糖殘基。最終，是這些末端單糖殘基的類型，數(shù)量和排列決定RME多糖與受體的相互作用強度。對于可用作載體的多糖，必須有許多單糖在合適的排列位置用于與受體的相互作用。在無唾液酸糖蛋白受體中，多個成簇的半乳糖殘基族與受體的結(jié)合是有用的。例如，RME多糖阿拉伯半乳聚糖是高度分支的，有許多末端半乳糖殘基相鄰近，并且顯示出與無唾液酸糖蛋白受體很強的相互作用，參見表2。相反，半乳聚糖，由許多半乳糖組成，與無唾液酸糖蛋白受體顯示出很少的相互作用。這是因為半乳聚糖是線性聚合物，很少有末端半乳糖。因為半乳聚糖很少被受體識別，RME多糖不能僅從組成數(shù)據(jù)上來鑒定。RME多糖的測定可根據(jù)多糖與和第二種物質(zhì)競爭結(jié)合的能力來將多糖劃分為RME多糖或非-RME多糖，已知所述的第二種物質(zhì)可與RME受體相結(jié)合。例如，多糖與無唾液酸糖蛋白受體相互作用的能力可通過競爭分析試驗來顯示，看它是否減緩了阿拉伯半乳聚糖包被的超順磁鐵氧化物膠體的清除，因為已知這種膠體是被上述受體清除的。由于這種膠體已知被無唾液酸糖蛋白受體清除(Josephson et al.，Mag.Res.，Imag.8637-646(1990))；Menz，E.T.PCT WO 90/01295，1988年8月3日申請，兩篇文獻均在這里引作參考)，多糖與受體相互作用，減緩了膠體的清除，即增加了血液半衰期。
為了測定血液半衰期，將Sprague Dawley大鼠(200-300g)麻醉，對其注射一定劑量的阻斷劑(如阿拉伯半乳聚糖或半乳聚糖)，然后再注射膠體，注射量為40μmoles Fe/kg。在不同的時間抽血，測定1/T1，旋轉(zhuǎn)點陣松馳率(the spin-latticerelaxation rate)，及1/T2，自旋松弛率(the spin-spin relaxation rate)。1/T1和1/T2值的增高與超順磁鐵氧化物的濃度有關(guān)。從1/T1和1/T2的變化，可測定出阿拉伯半乳聚糖包被的超順磁金屬氧化物在血中的半衰期。將單獨的阿拉伯半乳聚糖包被的超順磁鐵氧化物膠體的清除率作為參考點。和服用阻斷劑后膠體的半衰期的增長(清除減慢)顯示出阻斷劑與膠體與同一受體結(jié)合，因此阻礙了膠體的吸收。在無阻斷劑存在時，超順磁鐵氧化物膠體會很快被無唾液酸糖蛋白受體清除，其血中半衰期為2.8分鐘。結(jié)果列于表2。
表2多糖對于超順磁鐵氧化物膠體清除的影響阻斷劑 類型 阻斷劑用量(mg/kg) 膠體血液半衰期(分鐘)無 - 無2.8阿拉伯半乳聚糖 RME-多糖 150 33.2阿拉伯膠 RME-多糖 150 107.5無唾液酸胎球蛋白 糖蛋白100 56.6羥乙基乙基淀粉 非-RME多糖750 1.6半乳糖單糖 300 6.0RME-多糖(阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯膠)和糖蛋白載體無唾液酸胎球蛋白可增加超順磁鐵氧化物膠體的血中半衰期，顯示出膠體與試驗載體競爭相同的受體結(jié)合位點。作為對比，非-RME多糖羥乙基淀粉和單糖半乳糖對膠體的半衰期幾乎沒有影響。如表2的類似實驗方法，RME-多糖甘露聚糖阻礙了放射性糖蛋白RNA酶B的清除。Brown et al.，Arch，Brochem.Biophys，188418-428(1978)。這是因為RNA酶B的清除是被甘露糖受體識別的，且顯示出甘露聚糖是一種RME型多糖。
上述競爭性清除分析還可用于檢測RME-多糖-治療劑復(fù)合物是否合成了，如下述實施例中所述，是否保留與受體的相互作用。
RME-多糖還可進行部分水解消化，以產(chǎn)生低分子量的RME-多糖?？蓮腞ME-多糖開始，進行酸催化的，堿催化的或酶催化的水解產(chǎn)生低分子量的多糖。所得多糖進行例如表2的分析評估，測定它們與受體的相互作用能力。本發(fā)明的多糖，水解消化前或后，都具有大于約1,000道爾頓的分子量。RME多糖作為治療劑載體的優(yōu)點。
RME-多糖作為治療劑的載體具有許多優(yōu)點。
1.RME多糖以其自然形式被受體識別。而天然糖蛋白需要修飾(除去唾液酸)或新糖蛋白需要合成制備(將乳糖連接到白蛋白上)，只有這樣，這些分子才能作為治療劑的受體。
2.多糖具有高度的化學(xué)穩(wěn)定性。由于多糖的穩(wěn)定性，在治療劑和多糖間的共價鍵可在有機溶劑中獲得。這是個很重要的優(yōu)點，因為許多治療劑具有低水溶性。在非水介質(zhì)中進行，對水不穩(wěn)定的鍵(例如，酯)可在治療劑和多糖間產(chǎn)生。實施例6提供了這樣的化學(xué)例子。另外，多糖在高溫不變性，并且可在大pH值范圍內(nèi)或有機溶劑中存在。在實施例1中，多糖阿拉伯半乳聚糖用于包被鐵氧化物膠體。在此合成中，阿拉伯半乳聚糖首先暴露于pH約低于3的條件下，當(dāng)可溶性鐵鹽出現(xiàn)時，加入堿達到高pH，最后又用高溫。
3.RME多糖可以不從動物得到，而從自然來源得到(即，微生物或植物)。而來自人或動物的糖蛋白，需要花費昂貴的費用以確保它們不含病原體。
4.植物或微生物源可以可靠方式和合理的價格提供大規(guī)模生產(chǎn)粗品多糖。
RME多糖的例子1.阿拉伯半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖是一類可以從許多樹和植物的細胞壁獲得的多糖。阿拉伯半乳聚糖的一種常用的來源是在美國西部的落葉松(Larixoccidentalis)。從此來源得到的阿拉伯半乳聚糖曾被用作粘合劑，乳化劑或食物中的穩(wěn)定劑。
阿拉伯半乳聚糖含有半乳糖型主鏈和阿拉伯糖和半乳糖支鏈。一般地，半乳糖與阿拉伯糖的比例在5∶1到10∶1之間。分子量在10到100千道爾頓之間。(Glickman，ed.，“Food Hydrocolloids”，CRC Press(1982)pp.5，33)。阿拉伯半乳聚糖的糖基鍵分析表明它具有高度分支結(jié)構(gòu)，含有1，3連接的吡喃半乳糖主鏈與1，3糖苷鍵，包括3，4，6-，3，6-和3，4-及3-連接的殘基。在碳-13NMR譜中，阿拉伯半乳聚糖的主要共振位置是§-吡喃半乳糖，§-呋喃阿拉伯糖，和§-吡喃阿拉伯糖。圖1表示的是阿拉伯半乳聚糖的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明所述實施例的實施方案中，可商購得到的阿拉伯半乳聚糖(從Sigma化學(xué)公司購得)還要用超濾法進一步純化，以除去分子量大于100,000道爾頓和小于10,000道爾頓的雜質(zhì)。
2.阿拉伯膠。阿拉伯膠是從金合歡樹(Acacia Senegal(L)Willd)的滲出物中得到的高度分支的多糖。天然的阿拉伯膠分子具有1，3-連接的D-吡喃半乳糖單元。其中一些在6-位由1，6-連接的以葡萄糖醛酸或4-O-甲基葡萄糖醛酸殘基結(jié)尾的吡喃半乳糖單元的側(cè)鏈取代。在粗的樹膠中存在少量的多肽(約2％)，主要是絲氨酸和羥脯氨酸。(Dickinson et al.in“Food polymers，gels and colloids，Special publicationNo.82，Proceedings of an international symposium by the Food Chemistry Group of theRoyal Society of Chemistry，Dickinson，Ed.，Norwich England(1991))。不同的作者報導(dǎo)粗品阿拉伯樹膠的分子量從720,000道爾頓(帶有蛋白質(zhì))(Duvallet et al.PolymerBulletin 21517(1989))到約300,000道爾頓(參見上面的Dickinson)。使用鏈霉蛋白酶控制降解可使分子量減少至約180,000道爾頓(參見上面Duvallet)?？缮藤彽玫降牟牧暇哂性?50,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量。
在本發(fā)明的實施例中使用的阿拉伯膠是從Sigma Chemicals購得的，通過大小排阻層析得到的分子量約為150,000到300,000道爾頓?？缮藤彽陌⒗z主要含有阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和葡萄糖醛酸，且氮含量＜0.5％。用酸滴定每摩爾阿拉伯膠約有176個羧酸，用堿滴定約有250個羧酸。這些羧酸使它更易衍生。
本發(fā)明的實施方案還包括阿拉伯膠的衍生物，如阿拉伯膠的片段，二聚物，三聚物和聚合物。這些衍生物提供了附著于治療劑上的反應(yīng)物底物，治療劑可通過衍生物上的氨基，羧基，巰基，磷酰基或其它官能團與其相連。天然存在在阿拉伯膠末端糖苷上的羧基可通過碳化二亞胺或其它試劑與其它分子連接。胺衍生物可通過各種反應(yīng)與治療劑相連。另外，萄聚糖和聚-L-賴氨酸可連接到阿拉伯膠載體上，以增加治療劑的連接位點數(shù)目。衍生物可以任何方式制備只要能保留無唾液酸糖蛋白受體的識別性。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)阿拉伯膠可允許很大程度的修飾，仍保持與RME受體結(jié)合的親和性。這與我們上面報道的對阿拉伯半乳聚糖的發(fā)現(xiàn)一致。阿拉伯膠允許修飾且仍保留其生物活性的能力使得它可作為很多用于靶向傳遞的治療劑的載體。圖2表示的是阿拉伯膠的結(jié)構(gòu)。
2.甘露聚糖。甘露聚糖是一類可從酵母菌的細胞壁中得到的多糖。它主要是-D-吡喃甘露糖，帶有各種線狀和支鏈結(jié)構(gòu)(Gorin et al.，Vol.2“ThePolysaccharides”G.O.Aspinall，ed.，Academic Press(1983)pp.376-380)。
甘露聚糖可結(jié)合到在RES的巨噬細胞上發(fā)現(xiàn)的甘露糖受體上。結(jié)果連接到甘露聚糖上的治療劑靶向傳遞到巨噬細胞的RME受體上進行吸收，并通過RME吞入細胞?？捎肦ME多糖傳遞的治療劑使用本發(fā)明的方法，可將各種治療劑定向傳遞到特定細胞。下述實施例6和所列表3顯示了如何將RME多糖及其衍生物連接到治療劑上，制成各種可定向傳遞到特定細胞的分子。圖3和4描繪了將治療劑連接到載體上的兩種化學(xué)方法。本發(fā)明的可連到載體上的治療劑包括激素，甾體，維生素，核酸，酶，化學(xué)防護劑，防輻射劑，抗體和抗病毒劑。例如，連接到RME多糖上的抗病毒劑，如核苷酸和核苷類似物，可傳遞到含有RME受體且病毒在其中復(fù)制的細胞(肝細胞)。
Ara-AMP，一種核苷酸類似物，由于它在離靶位點較遠的位點而產(chǎn)生較大的副作用是一個抗病毒藥具有有限用途的例子。在Ara-AMP用于治療肝炎B的研究中顯示出嚴(yán)重的神經(jīng)學(xué)副作用。(Lok et al.，J.Antimicrob.Chemother.1493-9(1984)；Hoffnagel(et al.，J.Hepatol.3S73-80(1986))。通過形成Ara-AMP-RME多糖連接，可減小治療劑在非靶位點的不希望副作用，這是因為減少了藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的濃度并增加了藥物在病毒復(fù)制的靶器官的濃度。Ara-AMP與糖蛋白結(jié)合可被無唾液酸糖蛋白受體識別(美國專利No.4,794,170)，但這類載體存在上述局限性。其它的可連接到RME多糖上以增加安全性和有效性的抗病毒治療劑包括無糖環(huán)鳥苷，核苷類似物Ara-A和干擾素。
另一類抗病毒治療劑是抗體和抗體同系物，包括多克隆抗體，單克隆抗體，和抗體片段。在病毒感染后，在宿主動物血中產(chǎn)生循環(huán)抗體并伴有細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。但是，循環(huán)抗體一般對病毒感染無效，因為病毒在細胞內(nèi)復(fù)制。例如肝炎B病毒的情況，病毒在肝的肝細胞內(nèi)復(fù)制，而抗肝炎病毒抗原的抗體不能在此復(fù)制期直接連到病毒上。通過將肝炎B抗體連接到RME多糖上，并允許連接的抗體結(jié)合到無唾液酸糖蛋白受體上，受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞是有用的，抗體可進入細胞的細胞質(zhì)并與病毒抗原相結(jié)合，而變?yōu)橛行У闹委焺?br> RME多糖或RME衍生物還可用作輻射防護劑治療劑的載體。一種這類治療劑，WR2721，最近被用于臨床研究，確定它是否可用于保護癌癥患者在輻射治療(Kligerman et al.7th Internaitonal Conference on Chemical Moditiers of CancerTreatment，1991，Clearwater FL，pp.338-340)或化學(xué)治療(Schein，InternationalConference on Chemical Moditiers of Cancer Treatment，1991，Clearwater FL，pp341-342)時的正常細胞。但是，最近研究表明WR2721也保護癌細胞免受輻射，這就限制了它用作化學(xué)防護劑(The Pink Sheet，F(xiàn)eb.3，1992，54，#5)。例如，將阿拉伯膠與WR2721相連，使輻射防護劑定向傳遞到具有唾液酸糖蛋白受體的細胞，即非癌性肝細胞。除了WR2721，其它自由基清除劑也可連接到RME多糖，并靶向傳遞到含受體的細胞。例子包括硒，黑色素，巰基乙胺衍生物，酚功能團(如6-羥基-苯并二氫呋喃-2-羧酸(如Trolox)和生育酚(如維生素E)和酶(超氧物歧化酶)。
本發(fā)明的另一方面是包含RME多糖和聚-L-賴氨酸的組合物，其中強正電荷的聚-L-賴氨酸可與一些負電荷的核酸通過Coulombic效應(yīng)相吸附(Wu et al.，J.Biol.Chem.2624429-2232(1987)。例如，聚-L-賴氨酸-阿拉伯膠結(jié)合物可用作用于胃腸外給藥的基因或反義寡聚核苷酸的載體。(Degols et al.，Nucleic Acids Res.179341-50(1989))。將核酸靶向傳遞到細胞可用于治療遺傳缺陷病，如肝中肝酶的缺乏。在這種情況下，DNA可傳遞到肝用以逆轉(zhuǎn)遺傳缺陷。除了聚-L-賴氨酸，其它多聚分子，如糊精，葡聚糖，或白蛋白也可連接到RME多糖上。
在實施例1中，合成了阿拉伯半乳聚糖膠體作為鐵的載體，并經(jīng)RME受體將鐵定向傳遞到肝細胞。常用胃腸道外給藥以稱為右旋糖酐鐵的鐵氧化物葡聚糖復(fù)合物的形式提供鐵治療貧血。鐵氧化物葡聚糖在血中被RES慢慢清除。由于右旋糖酐鐵在體內(nèi)被細胞非特異性吸收，因此顯示出有產(chǎn)生不利反應(yīng)的傾向(Hamstra et al.，243JAMA(1980)pp.1726-1731)。與之對比，將鐵氧化物連接到載體阿拉伯半乳聚糖上(參見實施例1)，將它靶向傳遞到肝的肝細胞，并通過RME很快被吞入細胞(Menz et al，WO 90/1295)。
在本發(fā)明的另一方面，維生素被傳遞到特異的RME細胞。實施例3描述了甲酰四氫葉酸阿拉伯半乳聚糖結(jié)合物的制備，它可將維生素甲酰四氫葉酸通過RME傳遞到肝細胞。一個化學(xué)性質(zhì)與甲酰四氫葉酸相似的藥物的例子是氨甲蝶呤，與甲酰四氫葉酸相似，可按實施例3描述的方法進行少量修飾將氨甲蝶呤連接到阿拉伯半乳聚糖上。
實施例5和6描述了靶向傳遞兩個甾體激素-雌激素和氫化潑尼松到特定細胞的RME受體。也可依此方式進行有效地傳遞的其它甾體包括糖皮質(zhì)甾體激素。靶向傳遞甾體到特定細胞在各種疾病的治療中都有較大意義的應(yīng)用。(Martin，C.R.，“Text book of Endocrine Physiology”，Williams & Wilkins(1976)p.21)。依照本發(fā)明的實施方案，除了RME多糖-阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯膠，甘露聚糖也已用于將甾體靶向傳遞到靶細胞的RME受體。
表3治療劑， RME多糖和受體實施例治療劑/疾病 RME多糖 受體/靶細胞1 鐵氧化物/貧血阿拉伯半乳聚糖 無唾液酸糖蛋白/肝細胞2 鐵氧化物/貧血阿拉伯膠無唾液酸糖蛋白/肝細胞3 甲酰四氫葉酸/化學(xué)防護阿拉伯半乳聚糖 無唾液酸糖蛋白/肝細胞4 甲酰四氫葉酸/化學(xué)防護阿拉伯膠無唾液酸糖蛋白/肝細胞5 甾體/抗炎阿拉伯半乳聚糖 無唾液酸糖蛋白/肝細胞6 甾體/調(diào)節(jié)蛋白合成阿拉伯膠無唾液酸糖蛋白/肝細胞7 ara AMP/抗病毒 阿拉伯膠無唾液酸糖蛋白/肝細胞8 ara AMP/抗病毒 阿拉伯半乳聚糖衍生物無唾液酸糖蛋白/肝細胞9 N-乙酰-L-半胱氨酸/化學(xué)防護 阿拉伯膠無唾液酸糖蛋白/肝細胞& acetominophen中毒10甾體/抗炎甘露聚糖RME受體/巨噬細胞實施例實施例1阿拉伯半乳聚糖鐵氧化物膠體本實施例描述用阿拉伯半乳聚糖包被的鐵氧化物膠體的制備方法，以及靶向傳遞鐵到肝細胞，并用于治療缺鐵癥。按WO 90/01295的實施例6.10.1描述的方法制備阿拉伯半乳聚糖包被的超順磁(或順磁)鐵氧化物。將FeCl3水溶液(15.8g，58.5mole)和FeCl24H2O(6.24g，31.6mmole)通過0.22微米的濾器過濾除去大的碎屑。將等體積的鐵鹽和從落葉松木得到的阿拉伯半乳聚糖(60g，Sigma Chemical Co.)的溶液在蒸餾水中(120ml)于室溫下混合并充分?jǐn)嚢?。?0％氫氧化銨水溶液加入混合物，要緩慢滴加，直到pH達到約10。將混合物加熱至約90-100℃，保持15分鐘。將混合物冷卻，并通過以0.80，0.45和0.22遞減的多孔微米過濾器過濾。
過量的阿拉伯半乳聚糖用超濾法除去，使用2升的具有300千道爾頓切割量的中空纖維裝置(Amicon，Inc.，Danvers，MA)。前一步的過濾產(chǎn)物加入超過濾裝置中并加入25mM檸檬酸鈉(pH8.5)緩沖液洗滌。重復(fù)洗滌5次或直到觀察到澄清的洗脫液。然后將洗滌產(chǎn)物濃縮至開始的多糖加金屬溶液的體積。
發(fā)現(xiàn)阿拉伯半乳聚糖包被的鐵膠體被肝的無唾液酸糖蛋白受體清除，而且注入的鐵在肝內(nèi)，而不是在脾內(nèi)被識別。這證明鐵被成功地靶向傳遞到了肝細胞。對于連接到阿拉伯半乳聚糖上的鐵對比劑(診斷試劑)經(jīng)無唾液酸糖蛋白受體特異吸收的數(shù)據(jù)，可參見Menz et al.，PCT WO 90/01295的表V，這里引作參考。
使用59Fe合成包被的氧化物膠體來證明阿拉伯半乳聚糖包被的鐵氧化物用于治療缺鐵性貧血的治療潛力。經(jīng)過幾天，標(biāo)記的鐵進入正常形式的身體鐵源如含鐵的血紅蛋白。通過這種方式，阿拉伯半乳聚糖包被的鐵氧化物可用作治療劑用于治療缺鐵性貧血。實施例2阿拉伯膠鐵氧化物膠體此實施例描述由阿拉伯膠包被的鐵氧化物膠體的制備方法，它可用于將鐵靶向傳遞到肝細胞，并用于治療缺鐵癥。
下面例子中使用的阿拉伯膠購自Sigma Chemicals，且具有由供應(yīng)商確定的分子量約250,000道爾頓。將阿拉伯膠溶于水，并用#54 Whatman濾紙過濾，再用0.8μm過濾器過濾以除去微粒重雜質(zhì)。過濾后的材料用排阻分子量為100,00道爾頓的膜超濾5次，以除去低分子量雜質(zhì)。殘余物用0.2μm的過濾器過濾，以制得無菌溶液，然后冷凍干燥。
將1.5ml溶于0.1N HCl中的0.93M氯化鐵和1.5ml溶于0.1N HCl中的3.14M氯化亞鐵溶液加入到溶于去離子水的30ml 50％(W/V)阿拉伯膠溶液中。加入40ml30％(W/V)氫氧化銨溶液時，形成黑色沉淀。將沉淀的溶液置于沸水浴中30分鐘，冷卻至室溫，并使之通過標(biāo)準(zhǔn)的0.22μm濾器。濾液用0.1μm中空纖維濾器透析，除去未與阿拉伯膠包裹的磁性顆粒結(jié)合的物質(zhì)。磁性膠體含有以此方式形成的阿拉伯膠包被的磁性顆粒，它的磁感應(yīng)為45,400×106c.s.g.。實施例3甲酰四氫葉酸連接到阿拉伯半乳聚糖。
甲酰四氫葉酸是一種維生素，下面描述的是將它連接到RME-多糖阿拉伯半乳聚糖上。氨甲蝶呤是甲酰四氫葉酸的拮抗劑并是抗癌藥。通過修飾下面描述的甲酰四氫葉酸的化學(xué)性質(zhì)，將氨甲蝶呤接到RME-多糖上并用于藥物傳遞。
將甲酰四氫葉酸二水化物(6.0mg，13μmol)懸浮于H2O(1mL)中。加入NaOH(0.10N，7滴)直到白色固體甲氨四氫葉酸幾乎全部溶解。加入純化的阿拉伯半乳聚糖(20,000道爾頓，35.3mg)，然后再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(51.2mg，286μmol)。在室溫攪拌2.5小時后，反應(yīng)混合物用HPLP分析，使用Sephadex G-25柱(9.5×300mm)，洗脫液為0.05％NaN3(0.33mL/min)。使用UV檢測儀，在280nm(對于甲酰四氫葉酸，UVmax＝283nm)檢測游離的和結(jié)合的甲酰四氫葉酸。色譜顯示在保留時間為16.8min有一個峰，這是因為葉酸鹽連接到了阿拉伯半乳聚糖上。游離的甲酰四氫葉酸在35min出現(xiàn)。這個分配是從阿拉伯半乳聚糖和甲酰四氫葉酸的色譜分析得到的。純化的阿拉伯半乳聚糖需要折射率檢測儀，因為它在280nm無吸收。由UV檢測可知，37％的甲酰四氫葉酸連到了阿拉伯半乳聚糖上?；跓o損失的阿拉伯半乳聚糖和37％的葉酸鹽結(jié)合，得到葉酸鹽/阿拉伯半乳聚糖的比例是3∶1。實施例4，將氨甲四氫葉酸連接到阿拉伯膠衍生物上。
甲酰四氫葉酸是一種化學(xué)防護性治療劑，當(dāng)它靶向傳遞到需要進行化學(xué)防護的細胞時，其效能會增加。在此實施例中一種叫氨基阿拉伯膠的阿拉伯膠衍生物用作RME多糖。因此可說明用衍生物提供連接治療劑的位點。
制備氨基阿拉伯膠。將亞乙基二酰胺(5g)溶于10ml DI水中。阿拉伯膠(5g)溶于25ml DI水中。將兩溶液混合，并用6N HCl將pH調(diào)至6～6.5之間。加入3-乙基碳化二亞胺鹽酸化物(EDAC，7.5g)并攪拌直至溶解。向反應(yīng)液中加入四亞乙基二胺(25ml)并將pH調(diào)至6.5?；旌衔镌谑覝財嚢柽^夜。溶液用40升水透析，換水4次。用茚三酮分析衍化的程度。結(jié)果顯示300mole胺/mole阿拉伯膠，mole/mole。
連接到甲酰四氫葉酸上。將甲酰四氫葉酸(25mg)溶于1ml甲酰胺。向其中加入5μl的氯甲酸乙酯和7.5μl的TEA。反應(yīng)持續(xù)30分鐘。將氨基阿拉伯膠(200mg)溶于4ml 0.1M磷酸鹽緩沖液(pH9.0)中，并將此溶液渦旋。經(jīng)數(shù)分鐘將活化的甲酰四氫葉酸逐滴加入氨基阿拉伯腫中。反應(yīng)在室溫持續(xù)過夜。使任何沉淀重新懸浮，并將反應(yīng)混合物用PD-10柱(Pharmacia)分級分離，從未反應(yīng)的甲酰四氫葉酸中分離出結(jié)合產(chǎn)物。向每100μl的級分中加入磷酸鹽緩沖液。通過測定結(jié)合的甲酰四氫葉酸在330nm的吸收度來檢測其結(jié)合程度。結(jié)果表明衍生程度為62.5分子甲酰四氫葉酸/每分子氨基阿拉伯膠。實施例5將甾體連接到阿拉伯半乳聚糖-DPTA上。
甾體是一類可將其連接到RME多糖上并可被傳遞到細胞中的藥物。下面給出了使用化學(xué)方法將各種甾體連接到阿拉伯半乳聚糖的例子。步驟包括(i)與DTPA反應(yīng)制備具有羧基的多糖連接物，和(ii)將甾體通過羧基與DTPA-多糖相連接。
制備阿拉伯半乳聚糖-DTPA在60℃，將純化的阿拉伯半乳聚糖(23,000道爾頓，0.50g，21.7μmol)和二亞乙基-三胺五乙酸(DTPA)二酐(0.102g，285μmol)溶于DMSO(20mL)。1小時后，將澄清的溶液冷卻至室溫。加入H2O(10ml)，形成白色沉淀?；旌衔镉肁micon YM5超濾膜(5,000道爾頓排阻)過濾，并用H2O(4×30ml)洗滌。留在膜上的產(chǎn)物溶于H2O(10ml)中，冷凍干燥。得到白色粉末0.44g。名義上的DTPA/阿拉伯半乳聚糖比為13∶1，假定加入的所有的DTPA量全部連接(DTPA的名義分子量28,000道爾頓)。
將6-甲基潑尼松龍連接到阿拉伯半乳聚糖-DTPA上。在60℃將阿拉伯半乳聚糖-DTPA(107.5mg，3.8μmole)和6-甲基潑尼松龍(64.5mg，172μmol)溶于DMSO(15ml)中。加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(259mg，1.45mmol)并將反應(yīng)混合物在60℃攪拌1小時。HPLC分析(Sephadex G-10柱，9.5×300mm，洗脫劑為0.05％NaN3，0.50ml/min，280nm UV檢測)，反應(yīng)混合物在10.5分鐘保留時間處只有一個單峰，與阿拉伯半乳聚糖-DTPA結(jié)合物的動態(tài)相應(yīng)。在19.5分鐘時處未觀測到6-甲基潑尼松龍的峰，表明甾體全部連接(通過酯化)到阿拉伯半乳聚糖-DTPA結(jié)合物上。加入H2O(10ml)后，反應(yīng)混合物用Amicon YM3(3,000道爾頓排阻)超濾，用H2O(3×30ml)洗滌。濾液含有未反應(yīng)的甾體，碳化二亞胺，痕量的DTPA和其它低分子量物質(zhì)。HPLC分析濾液證明無游離的甾體。將H2O(10ml)加入截留物，并將產(chǎn)物冷凍干燥。得到灰白色粉末0.10g。實施例6將雌二醇連接到氨基阿拉伯膠上下面給出可將不同的甾體連接到阿拉伯膠的化學(xué)方法的例子。
將25mg§-雌二醇3-羧甲基醚(雌二醇3-CME)溶于DMF(1ml)。向其中加入氯甲酸乙酯(5μl)和TEA(7.5μl)。將氨基阿拉伯膠(參見實施例4，100mg)溶于甲酰胺(2ml)中，并稍微加熱。渦旋氨基阿拉伯膠，經(jīng)數(shù)分鐘逐滴加入活化的雌二醇3-CME。使用去離子水飽和的PD10-柱將結(jié)合的物質(zhì)與未反應(yīng)的雌二醇3-CME分離。向100μl的各餾分中加入去離子水(1ml)，確定在277nm的吸收與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比來檢測衍化的程度。結(jié)果顯示每分子氨基阿拉伯膠有18.2個雌二醇。實施例7將腺嘌呤單磷酸酯(AMP)連接到氨基阿拉伯膠上此實施例證明將核苷酸或核苷類似物連到阿拉伯膠上，用于靶向傳遞到肝。在下面的方法中，包括araAMP的任何核苷酸都可連接到阿拉伯膠上，araAMP用作抗病毒劑在治療肝炎中使用(參見上述表1)。
將氨基阿拉伯膠(100mg)(參見實施例4)溶于1ml去離子水中。向阿拉伯膠溶液中加入AMP(100mg)和四亞乙基二胺(500μl)。加入氫氧化鈉(2N)以使pH增加到6.5。加入EDAC(100mg)，并調(diào)節(jié)pH到6.5。將溶液在37℃反應(yīng)過夜。使用PD-10柱(Pharmacia)將結(jié)合物從未反應(yīng)的AMP中分離出來，而且100μl的各餾分用1ml磷酸鹽緩沖液稀釋。通過260nm的吸收值測定結(jié)合的AMP的量來測定衍化的程度。實施例8將AraAMP連接到阿拉伯半乳聚糖衍生物上本實施例證明將治療劑連接到阿拉伯半乳聚糖的水解產(chǎn)物上。阿拉伯半乳聚糖的這種修飾不影響該多糖與肝細胞上的RME無唾液酸糖蛋白受體之間的相互作用的能力。
制備阿拉伯半乳聚糖水解產(chǎn)物。將阿拉伯半乳聚糖(100g)溶于37℃水中制得20％溶液。在另一容器中，NaOH(200g)溶于37℃水(5L)中。將硼氫化鈉(20g)溶于該NaOH溶液中，然后將阿拉伯半乳聚糖溶液加入此溶液。再向反應(yīng)液中加入20g硼氫化鈉，反應(yīng)混合物在37℃攪拌15min，通過加入4℃的冷濃HCl將混合物調(diào)節(jié)至pH8.6。
1.溶液用排阻分子量3000道爾頓的透析管徹底透析。透析液用0.22微米過濾器過濾，并冷凍干燥得到阿拉伯半乳聚糖水解產(chǎn)物，為白色結(jié)晶固體。分子排阻層析法顯示具有單一組分，且平均分子量為8kDa。
制備羧甲基阿拉伯半乳聚糖(8kDa)的水解產(chǎn)物。將50g阿拉伯半乳聚糖(8kDa)水解產(chǎn)物溶于200ml水。向此溶液加入1mole NaOH，然后加入溴乙酸(70-275mmoles)。反應(yīng)在30℃進行90分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，加入6N HCl中和溶液。使用合適的濾器充分超濾進行產(chǎn)物純化，然后冷凍干燥。羧甲基的摻入是每克1毫克當(dāng)量。
連接治療劑。將araAMP連接到8kDa的羧甲基阿拉伯半乳聚糖水解產(chǎn)物上要分兩步進行。向亞乙基二胺(2.5ml)，腺苷-5-單磷酸酯(10g)，和1-羥基苯并三唑(HOBt，3.7g)的混合物中，在40℃分4次經(jīng)3.5小時加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC，15g)。真空除去水，產(chǎn)物用50ml 2∶1的(H3CN/MeHO研磨。固體用100ml乙腈洗滌，在50℃真空干燥。使固體通過2.5cm×25cm含有100ml濕體積的Amberlite IR-120(Na型)的離子交換樹脂柱。合并得到的產(chǎn)物亞乙基二胺-araAMP(en-araAMP，首先是250ml)部分，在真空除去水。產(chǎn)物再用2∶1的丙酮/MeOH研磨，用100ml丙酮洗滌。產(chǎn)物在50℃真空下干燥2小時，產(chǎn)量8.2g。
為將en-ARA-AMP連接到羰甲基阿拉伯半乳聚糖上，將10g(1mEq/gCOOH)的8kDa的羧甲基阿拉伯半乳聚糖水解產(chǎn)物加入到350ml廣口瓶中，瓶中含有20ml的四亞乙基二胺/HCl緩沖液(4.0g，0.5M，pH7.5)，再向其中加入HoBt1.37g和en-araAMP 8.2g。將混合物加熱至40℃然后于室溫攪拌過夜。當(dāng)所有固體都溶解后，分3次經(jīng)6小時加入EDC 7.6g。粗混合物用水稀釋10倍，并用3K的濾器超濾。重復(fù)用蒸餾水洗滌后，凍冷干燥產(chǎn)物得到白色固體。產(chǎn)量12g產(chǎn)物帶有0.50mmolaraAMP/g；阿拉伯半乳聚糖水解產(chǎn)物上的羧基位點約有63％的被衍化。實施例9將N-乙?；?L-半胱氨酸連接到氨基阿拉伯膠上本實施例描述將化學(xué)防護劑連接到阿拉伯膠衍生物上。N-乙?；?L-半胱氨酸是一種氨基酸，可用作化學(xué)防護劑和肝對乙酰氨基酚中毒的解毒劑。
將N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC，120mg)溶于1ml甲酰氨中。向其中加入12μl氯甲酸乙酯和20μ1三乙胺(TEA)，使反應(yīng)持續(xù)30分鐘。將氨基阿拉伯膠(200mg)(參見實施例4)溶于4ml(50mg/ml)0.1M磷酸鹽緩沖液中，pH9.0。將此溶液渦旋，并將活化的NAC經(jīng)數(shù)分鐘逐滴加入。反應(yīng)在室溫進行1小時。使溶液通過PD-10柱(Pharmacia)使結(jié)合的NAC從未反應(yīng)的NAC中分離出來。用5，5′-二硫代-雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)分析巰基來測定衍化程度。50微升的各餾分用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7)稀釋到1ml，并加入50μl的10mM的DTNB。DTNB與巰基殘基反應(yīng)產(chǎn)生的顏色，在430nm測定。結(jié)果顯示每分子氨基阿拉伯膠有100分子的半胱氨酸。實施例10將治療劑連接到甘露聚糖上用甘露聚糖代替阿拉伯半乳聚糖，按實施例5的方法將甘露聚糖與治療劑相連。
權(quán)利要求
1.一種定向傳遞治療劑到特定細胞的方法，包括(i)給患者服用有效劑量的復(fù)合物，其中復(fù)合物含有連接到受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞的(RME)多糖上的治療劑；和(ii)使復(fù)合物結(jié)合到靶細胞的RME受體上以使治療劑融入靶細胞。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中步驟(i)中RME多糖是天然存在的。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中RME多糖是被化學(xué)修飾的。
4.按照權(quán)利要求2的方法，其中RME多糖是阿拉伯膠。
5.按照權(quán)利要求2的方法，其中RME多糖是阿拉伯半乳聚糖。
6.按照權(quán)利要求2的方法，其中RME多糖是甘露聚糖。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑選自激素，甾體，核酸，抗體，維生素，抗病毒劑，酶，化學(xué)防護劑和輻射防護劑。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑是抗病毒劑。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中抗病毒劑是araAMP。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑是抗體。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中抗體選自單克隆抗體，多克隆抗體，抗體片段和抗體類似物。
12.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑是激素。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中激素選自6-甲基潑尼松龍，皮質(zhì)甾體和雌激素。
14.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑是維生素。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其中維生素是甲酰四氫葉酸。
16.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑是氨甲蝶呤。
17.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑是干擾素。
18.按照權(quán)利要求1的方法，其中治療劑是含鐵的化合物。
19.按照權(quán)利要求18的方法，其中含鐵化合物是鐵氧化物膠體。
20.按照權(quán)利要求1的方法，其中RME細胞受體是無唾液酸糖蛋白受體。
21.按照權(quán)利要求1的方法，其中RME細胞受體是甘露糖受體。
22.一種載體，含有阿拉伯半乳聚糖，在還原劑存在下用堿溶液處理，得到的水解產(chǎn)物可與RME受體結(jié)合，且當(dāng)與治療劑連接時可將治療劑傳遞到具有RME受體的靶細胞。
23.按照權(quán)利要求22的載體，其中堿溶液具有大于8.0的pH值。
24.按照權(quán)利要求23的載體，其中還原劑是硼氫化物鹽。
25.按照權(quán)利要求24的載體，其中水解的阿拉伯半乳聚糖產(chǎn)物具有約為8Kd的分子量。
26.一種載體，含有含有具有多個羧甲基官能團以結(jié)合治療劑的多糖，羧甲基化的多糖可將治療劑傳遞到具有RME受體的靶細胞。
27.按照權(quán)利要求26的載體，其中多糖是羧甲基化的阿拉伯半乳聚糖。
28.按照權(quán)利要求26的載體，其中多糖上的羧甲基官能團可與治療劑上的氨基磷酸酯基團連接。
29.按照權(quán)利要求28的載體，其中多糖是阿拉伯半乳聚糖。
30.一種載體，可連接治療劑用以將其傳遞到在靶組織上的RME細胞受體，含有一種多糖，該多糖在位點被官能殘基修飾以產(chǎn)生衍生物，使衍生物具有對細胞受體的有利的親和力，其中官能殘基選自磷?；?，巰基，氨基，鹵素，acyamidizole，羧基，葡聚糖，聚-L-賴氨酸，糊精和白蛋白，所述衍生物允許治療劑進一步連接到衍生物上的反應(yīng)。
31.一種藥物組合物，含有一種多糖載體，該多糖載體由官能殘基修飾產(chǎn)生衍生物，使其具有與RME細胞受體的親和力；和一種治療劑，它連接在載體上以便有效地傳遞到靶組織的細胞受體上。
32.按照權(quán)利要求31的藥物組合物，其中RME多糖選自甘露聚糖，巖藻多糖，和阿拉伯膠。
33.按照權(quán)利要求31的藥物組合物，其中官能殘基選自氨基，羧基，巰基，磷酰基，葡聚糖，聚-L-賴氨酸，糊精和白蛋白。
34.按照權(quán)利要求31的藥物組合物，其中治療劑共價連接到載體上。
35.按照權(quán)利要求31的藥物組合物，其中治療劑選自激素，甾體，維生素，核酸，輻射防護劑，抗體，和抗病毒劑。
36.按照權(quán)利要求35的藥物組合物，其中抗病毒劑是araAMP。
37.按照權(quán)利要求34的藥物組合物，其中載體具有多個羧甲基官能團，適于共價連接治療劑。
38.按照權(quán)利要求37的藥物組合物，其中載體通過氨基磷酸酯鍵與治療劑共價連接。
39.按照權(quán)利要求37的藥物組合物，其中載體通過亞乙基二胺鍵與治療劑共價連接。
40.按照權(quán)利要求38的藥物組合物，其中多糖是阿拉伯半乳聚糖。
41.按照權(quán)利要求39的組合物，其中治療劑是ara-AMP。
42.按照權(quán)利要求40的組合物，其中治療劑是ara-AMP。
43.一種制備用于靶向釋治療劑到特定細胞的載體的方法，包括(a)提供阿拉伯半乳聚糖；(b)水解阿拉伯半乳聚糖到預(yù)定的大??；和(c)基本純化水解的阿拉伯半乳聚糖。
44.按照權(quán)利要求43的方法，其中步驟(b)中進一步包含在還原劑存在下在堿溶液中水解阿拉伯半乳聚糖。
45.按照權(quán)利要求44的方法，其中還原劑是硼氫化物鹽。
46.按照權(quán)利要求44的方法，其中硼氫化物鹽選自硼氫化鈉和氰基硼氫化鈉。
47.按照權(quán)利要求46的方法，進一步包括(d)用化學(xué)試劑修飾水解的阿拉伯半乳聚糖形成衍生物，此衍生物具有與RME細胞受體的親和力。
48.按照權(quán)利要求47的方法，其中在步驟(d)中的化學(xué)試劑是溴代羧酸。
49.按照權(quán)利要求48的方法，其中溴代羧酸是溴乙酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及將治療劑靶向傳遞到特定細胞的方法，其中治療劑與融合細胞受體反應(yīng)的多糖相聯(lián)形成復(fù)合物，給患者服用復(fù)合物，使能治療劑能按已知的復(fù)合體介導(dǎo)進入細胞(RME)的方式進行特定細胞，多糖可以是，例如，阿拉伯半乳聚糖，阿拉伯膠，甘露聚糖或它們的水解產(chǎn)物，治療劑可以是，例如，抗病毒劑，核酸，激素，甾體，抗體，化學(xué)防護劑或輻射防護劑。細胞受體可以是，例如，無唾液酸糖蛋白受體或甘露糖受體。
文檔編號C08J9/14GK1150761SQ95193606
公開日1997年5月28日 申請日期1995年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月16日
發(fā)明者爾奈斯特·V·哥爾曼, 愛德華·T·門茲, 非利甫·M·恩爾奎茲, 吉爾姆·M·路易斯, 張超華, 李·約瑟夫森 申請人:先鋒磁力公司