專利名稱：生物樣品中多個靶的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于檢測生物樣品中多個靶的方法、試劑盒和裝置。背景
分析生物樣品以辨別其特性，并得到關(guān)于各種生物靶的信息為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)兩者所需?？墒褂枚喾N方法用于分析生物樣品以尤其檢測生物靶的存在情況、不存在情況、濃度和/或空間分布。例如，對組織切片或細(xì)胞學(xué)制備物中蛋白質(zhì)的檢測可用組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)(IHC)或免疫熒光來進(jìn)行。然而，許多現(xiàn)有用于檢測生物樣品中靶的技術(shù)在靈敏度、精確度和/或多重能力方面具有局限性。特別地，對單個生物樣品中多個靶的檢測常受限于一次只能檢測幾種靶(約4-5種靶)。例如，在免疫熒光測定期間，在單個組織樣品中可精確檢測靶數(shù)目受限于 基于熒光的檢測系統(tǒng)分辨重疊信號的靈敏度。因此，可常常需要來自源頭的另外生物樣品，已得到關(guān)于所有相關(guān)靶的信息。對多個生物樣品的分析限制了精確測定生物樣品中多種不同靶的相對特性(例如存在情況、不存在情況、濃度和/或空間分布)的能力。此外，在某些情況下，有限量的樣品可能僅可用于分析。因此，需要能夠分析單個生物樣品以檢測生物樣品中多種不同靶的方法、試劑和裝置。簡述
用于檢測生物樣品中多個靶的方法通常包括以下步驟使生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，使所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接，和觀察來自第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號。所述方法還包括以下步驟修改觀察到的信號，接著自第二組的許多靶結(jié)合探針生成第二組信號，和觀察所述第
二組信號。用于檢測生物樣品中多個靶的方法的另外實例通常包括以下步驟使生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，使所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接，自第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針生成第一組信號，和觀察所述第一組信號。所述方法還包括以下步驟修改觀察到的信號，自第二組的許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號，和觀察所述第二組信號。用于檢測生物樣品中多個靶的方法的其它實例包括以下步驟使生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，使所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接，使所述已結(jié)合靶的探針與第一組信號產(chǎn)生探針接觸，所述信號產(chǎn)生探針能夠結(jié)合第一組的所述已結(jié)合靶的探針并能夠生成第一組信號，和通過觀察所述第一組信號來檢測所述第一組的多個靶。所述方法還包括修改所述觀察到的第一組信號的步驟。所述接觸步驟、所述檢測步驟以及所述修改步驟可用后續(xù)組的信號產(chǎn)生探針以檢測后續(xù)組的多個靶來重復(fù)多次，其中所述后續(xù)組的信號產(chǎn)生探針能夠結(jié)合后續(xù)組的所述許多已結(jié)合靶的探針并能夠生成后續(xù)組信號。用于檢測生物樣品中多個靶的試劑盒通常包括許多靶結(jié)合探針，其中每一種靶結(jié)合探針能夠生成信號，和至少一種化學(xué)試劑，其能夠修改由至少一種靶結(jié)合探針生成的信號。所述許多靶結(jié)合探針中至少之一還能夠與靶或與位于靶附近的分子交聯(lián)。用于檢測生物樣品中多個靶的裝置通常包括樣品處理系統(tǒng)、試劑分配系統(tǒng)、探針交聯(lián)系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)。附圖

當(dāng)參考附圖閱讀以下詳述時，本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點將變得更好理解，在整個附圖中，相同的符號代表相同的部分，其中
圖I為說明本發(fā)明一個實施方案的流程圖。圖2為說明本發(fā)明一個實施方案的流程圖。圖3顯示花菁染料標(biāo)記的DNA寡聚物(Cy3-T20-SFAD或Cy3_T20_SDAD)與鏈霉抗生物素-包被的板的交聯(lián)。 圖4顯示花菁染料標(biāo)記的DNA寡聚物(Cy3-T20-NH2或Cy3_T20_SANPAH)與細(xì)胞的相互作用。圖5示出了圖像，其顯示通過同時加入探針，隨后序貫檢測已結(jié)合靶的探針對組織樣品中聚(A) mRNA和U6 snRNA探針的多重檢測。圖6顯示通過同時加入探針，隨后交聯(lián)和序貫檢測已結(jié)合靶的探針對組織樣品中b-肌動蛋白和U6探針的多重檢測。圖7是框圖，圖示說明了本發(fā)明一個實施方案的示例性裝置。圖8是框圖，圖示說明了本發(fā)明一個實施方案的示例性組織病理學(xué)系統(tǒng)。詳述
為更清楚和簡明地闡述并指出所要求保護(hù)發(fā)明的主題，給下文描述和所附權(quán)利要求書中使用的特定術(shù)語提供以下定義。在整個說明書中，應(yīng)將特定術(shù)語的示例視為非限制性實例。單數(shù)形式“一”、“該”和“所述”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文明確另外指出。在整個說明書和權(quán)利要求書中使用的近似語言可應(yīng)用于修飾任何定量表示，其在不導(dǎo)致與其相關(guān)的基本作用變化的情況下可允許變化。因此，由術(shù)語例如“約”修飾的值不限于特定的精確值。在一些情況下，近似語言可對應(yīng)于用于測量值的儀器的精確性。類似地，“無(free)”可與術(shù)語聯(lián)合使用，并可包括非真實數(shù)字或痕量，但還認(rèn)為不含所修飾的術(shù)語。必要時，已提供范圍，并且那些范圍包括在其間的全部子范圍。本文使用的術(shù)語“生物樣品”是指生物來源的樣品，或來源于生物來源樣品的樣品。生物樣品可為體內(nèi)樣品或體外樣品。生物樣品可為原核來源或真核來源的。例如，生物樣品可來源于生物對象例如細(xì)菌、真菌、原生動物、昆蟲、魚、鳥、爬行動物、哺乳動物(例如小鼠、大鼠、奶牛、狗、驢、豚鼠或兔)或靈長類動物(例如黑猩猩或人)。生物樣品可通過多種方法獲自或來源于生物對象。例如，生物樣品可包括分離自哺乳動物(例如人)的組織或細(xì)胞，生物樣品的切片(例如器官或組織的切片部分)、或來自生物樣品(例如從體液提取的抗原，所述體液例如血液、血漿、血清或尿)的提取物。所述生物樣品的非限制性實例包括細(xì)胞、細(xì)胞碎片、組織、組織切片、器官或體液。所述生物樣品可被固定在固體載體上例如在印記或陣列中。例如，所述生物樣品可被固定在膜、紙、載玻片、微孔滴定板或ELISA板上。
術(shù)語“核酸”意欲包括任何脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)(例如染色體核酸、線粒體核酸、病毒核酸或細(xì)菌核酸)或其類似物。術(shù)語“核酸”包括雙鏈核酸分子的任一鏈或雙鏈。所述核酸可為天然核酸或合成核酸。本文使用的術(shù)語“靶”通常是指當(dāng)存在于生物樣品中時可被檢測或分析的生物樣品組分(例如生物分子例如蛋白質(zhì)或核酸，生物分子的一部分例如表位、生物結(jié)構(gòu))或生物樣品。所述靶可為其中有天然存在的靶結(jié)合部分的任何物質(zhì)(例如抗體與靶抗原)，或其中靶結(jié)合部分可經(jīng)制備的任何物質(zhì)(例如合成的小分子結(jié)合物例如針對靶受體的配體)。合適靶的非限制性實例包括肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酸(例如DNA或RNA)、多糖類(例如凝集素或糖類)、脂質(zhì)、配體、受體、抗體、親和體(affibody)、抗原、適體、半抗原、激素類、酶、酶底物或其組合。本文使用的術(shù)語“多個靶”或“多種不同靶”是指兩種或更多種不同的靶。例如，生物樣品中的多個靶可指生物樣品中的多種抗原，其中所述多種抗原包括至少兩種不同類型的抗原(例如抗原A和抗原B的混合物)。通常，所述多個靶包括至少兩組不同的靶；每 組不同的靶包括至少一種靶。所述兩組不同的靶可包括相同類型的生物標(biāo)志物(例如兩組不同的抗原；第一組抗原A和第二組抗原B)或其可包括不同類型的生物標(biāo)志物(例如第一組RNA和第二組DNA)。每組不同的靶常?？砂ǘ嘤谝环N靶。本文使用的術(shù)語“靶結(jié)合探針”指能夠特異性結(jié)合靶的部分。當(dāng)靶存在于生物樣品中時，所述靶結(jié)合探針可用于檢測或分析所述靶。所述靶結(jié)合探針包括至少一種靶結(jié)合部分。所述靶結(jié)合部分可為靶的天然存在特異性結(jié)合物、來源于天然存在特異性結(jié)合物的部分或特異性結(jié)合所述靶的合成部分。例如，用于檢測靶抗原的靶結(jié)合探針可來源于特異性針對靶抗原的抗體。所述靶結(jié)合探針還可包括信號產(chǎn)生部分、掩蔽的信號產(chǎn)生部分、交聯(lián)部分或獨立地與靶結(jié)合部分締合(共價或非共價地)的可檢測部分。通常，所述靶結(jié)合探針經(jīng)由分子識別所述靶或靶的結(jié)構(gòu)組分的分立化學(xué)部分來結(jié)合所述靶(例如經(jīng)由分子識別蛋白質(zhì)的特異性三維結(jié)構(gòu))。靶結(jié)合探針的合適實例包括但不限于DNA、RNA、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、修飾的寡核苷酸(例如具有修飾的堿基、修飾的糖部分或修飾的磷酸部分的寡核苷酸)、抗體、抗體片段、肽、親和體、半抗原、配體或適體。本文使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”指兩種不同分子(配偶體分子)中的一種對另一種的特異性識別，相比之下，所述其中的一種對其它非-配偶體的識別顯著更少。通常，結(jié)合事件的特異性是配偶體分子中特異性分子識別位點導(dǎo)致的結(jié)果。所述分子可在其表面上或其腔內(nèi)具有識別位點，其引起兩種配偶體分子之間的特異性識別。分子識別可經(jīng)由靜電相互作用、氫鍵、疏水相互作用或其相互作用的組合而產(chǎn)生。特異性結(jié)合相互作用的實例包括但不限于抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、互補(bǔ)核酸序列雜交、配體-受體相互作用等。靶結(jié)合探針以這樣的方式來選擇，使得它們特異性結(jié)合其相應(yīng)的靶。本文使用的所述術(shù)語“信號產(chǎn)生物(signal generator) ”或“信號產(chǎn)生部分”指提供或產(chǎn)生可檢測信號的分子。所述信號產(chǎn)生物可固有地提供可檢測信號，而無需任何在先的化學(xué)或結(jié)構(gòu)修飾以產(chǎn)生所述可檢測信號(例如來自熒光團(tuán)的熒光信號)，或可經(jīng)由與其它合適部分的相互作用來產(chǎn)生可檢測信號(例如通過酶經(jīng)由酶-底物反應(yīng)的信號產(chǎn)生)。所述可檢測信號可包括光信號、電信號、聲信號或放射性信號。所述可檢測信號可用一種或多種檢測技術(shù)例如光譜測定法、光譜術(shù)或目視檢查來觀察。合適的信號產(chǎn)生物的實例包括但不限于生色團(tuán)、熒光團(tuán)、拉曼-活性標(biāo)簽、放射性標(biāo)記、酶或其組合。本文使用的術(shù)語“掩蔽的信號產(chǎn)生部分”指前體信號產(chǎn)生物(前-信號產(chǎn)生物)，其中所述信號產(chǎn)生物的可檢測信號被掩蔽。所述掩蔽可改變至少一個信號特性。掩蔽可導(dǎo)致信號的完全/部分去除、信號峰的移位、信號強(qiáng)度下降或信號頻率改變。在解掩蔽時所述掩蔽的信號產(chǎn)生部分可轉(zhuǎn)變?yōu)樾盘柈a(chǎn)生物。例如，具有掩蔽的信號產(chǎn)生部分的靶結(jié)合探針可包括與猝滅熒光團(tuán)(掩蔽的信號產(chǎn)生部分)偶聯(lián)的抗體(靶結(jié)合部分)。供體-受體熒光團(tuán)對(例如熒光團(tuán)-猝滅劑對)可用作所述掩蔽的信號產(chǎn)生部分(掩蔽的熒光團(tuán))，其中所述供體的熒光經(jīng)由共振能量轉(zhuǎn)移給受體而被猝滅。改變供體和受體之間的距離或除去受體可用于解掩蔽所述供體熒光團(tuán)，并且隨后可觀察來自供體的熒光。 本文使用的術(shù)語“獨立地可檢測部分”指可通過直接測定或間接測定來檢測的部 分。為了通過直接測定來檢測，所述獨立地可檢測部分應(yīng)包括信號產(chǎn)生物信號產(chǎn)生物(即其應(yīng)提供/產(chǎn)生可檢測信號)。當(dāng)獨立地可檢測部分自身不產(chǎn)生可檢測信號時或者當(dāng)其含有掩蔽的信號產(chǎn)生部分時，需要間接測定用于檢測所述獨立地可檢測部分。例如，所述獨立地可檢測部分隨后可通過使其與信號產(chǎn)生部分締合或通過解掩蔽所述信號產(chǎn)生部分來檢測。本文使用的術(shù)語“相關(guān)”指用任何方法比較或分析性能和/或結(jié)果以在相關(guān)的事件之間建立相互關(guān)系或互反關(guān)系。術(shù)語“原位”是指存在于原始或天然位置的事件。例如，原位可指存在于完整器官或組織或存在于器官或組織的代表性片段中的事件。靶的原位分析常常提供位置相關(guān)的信息(contextual information),當(dāng)將祀從其來源部位移出時可丟失該信息。祀的原位分析可在來自各種來源的細(xì)胞、組織或組織切片上進(jìn)行，所述各種來源包括生物體、器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物。因此，細(xì)胞或組織中靶的原位分析描述了對位于整個細(xì)胞或組織樣品中的已結(jié)合靶的探針的分析，其中已結(jié)合靶的探針保持在細(xì)胞內(nèi)。在進(jìn)行原位分析時，細(xì)胞膜可為完全完整的或部分完整的。此外，所述方法可用于原位分析固定、未固定或冷凍的細(xì)胞或組織樣品中的靶。術(shù)語“觀察信號”是指檢測、表征或監(jiān)測信號。來自信號產(chǎn)生物的信號可用檢測系統(tǒng)或成像系統(tǒng)來觀察。例如，觀察來自生物樣品的信號可通過捕獲生物樣品的圖像來進(jìn)行。所用的檢測系統(tǒng)或成像系統(tǒng)的性質(zhì)依信號產(chǎn)生物生成的信號的性質(zhì)而定。可用于觀察信號的檢測/成像系統(tǒng)的非限制性實例包括電子自旋共振(ESR)系統(tǒng)、電荷耦合器件(CCD)系統(tǒng)(例如用于放射性同位素)、光學(xué)系統(tǒng)(例如光學(xué)成像、熒光成像、共焦成像)、電系統(tǒng)、攝影膠片系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)、酶檢測系統(tǒng)、原子力顯微鏡(AFM)系統(tǒng)、掃描隧道顯微鏡(STM)檢測系統(tǒng)、近紅外場系統(tǒng)或全內(nèi)反射(TIR)系統(tǒng)。觀察信號還包括目視觀察信號。一種或多種方法可用于分析、診斷或預(yù)后應(yīng)用例如但不限于分析物檢測、疾病檢測、疾病監(jiān)測、治療監(jiān)測、疾病預(yù)測、組織化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、免疫化學(xué)、免疫組織化學(xué)或免疫熒光。例如，所述方法可特別用于組織化學(xué)、免疫組化或免疫熒光領(lǐng)域。所述方法可用于檢測單個生物樣品中的多個靶。對多個靶的檢測可包括確定多個靶的存在情況、不存在情況、位置和/或量。所述方法可使用用于檢測多個靶的單個檢測通道。在一些實施方案中，所述方法可用于生物樣品的體外分析。在一些實施方案中，所述方法可用于生物樣品的體內(nèi)分析。
所述方法使得能夠檢測同一生物樣品中的多個靶。檢測同一生物樣品中的靶還可用于確定關(guān)于生物樣品中靶的空間信息。所述方法可用于以下的分析應(yīng)用其中可得到有限量的生物樣品用于分析或者其中必須對同一樣品進(jìn)行處理用于多種分析。同一檢測通道可使用多次，以檢測同一樣品中的不同靶，使得對于多個靶分析的化學(xué)需求更少。所述方法還可用于以下情況中其中由于分辨重疊信號的限制，常規(guī)檢測方法可能僅能夠檢測有限數(shù)量的靶。例如，在基于常規(guī)熒光檢測測定中，可同時檢測的靶數(shù)目可能僅限于約4種，因為基于它們的激發(fā)和發(fā)射波長性質(zhì)，超過4種的熒光信號可能不可分辨。本發(fā)明方法可幫助克服該限制，并且使得能夠檢測多個靶(例如大于4種靶)。所述方法可用于檢測多個靶，其可有助于比較不同類型的細(xì)胞或組織、比較不同發(fā)育階段、檢測疾病或異常的存在情況或測定疾病或異常的類型。所述方法還提供通過以下來增加對靶檢測的多重性的方法使用具有可活化標(biāo)記(例如信號產(chǎn)生物)且可被活化的靶結(jié)合探針，用于與具有業(yè)已可成像標(biāo)記的靶結(jié)合探針一起成像。這允許同時使用兩種或更多個靶結(jié)合/檢測試劑，其中之一為可直接檢測的而其它的試劑只能在活化后來檢測，這允許再次使用用于檢測的同一檢測通道。所述方法描述了在對已活化標(biāo)記進(jìn)行成像后一起使用可活化標(biāo)記與活化標(biāo)記。亦可能的是，若在不同 檢測通道中檢測標(biāo)記，則使用每個可在相同條件下活化的多個可活化標(biāo)記，或者若同一檢測通道用于檢測，則使用每個可在不同條件下活化的多個可活化標(biāo)記。業(yè)已可成像標(biāo)記可用合適接頭和保護(hù)基團(tuán)化學(xué)在可活化標(biāo)記被活化前裂解，或在可活化標(biāo)記被活化的同時裂解。本發(fā)明還描述了放大信號以檢測可能以不同濃度存在的多種特定分子的方法?？赏瑫r使用多種放大方式以達(dá)到不同水平的放大。本發(fā)明的另一特征是用多重標(biāo)記的寡核苷酸或聚合物和/或原位聚合以多重方式的信號放大。所述生物樣品包括但不限于血液、血漿、血清、唾液、腦脊液、胸膜液、奶、淋巴、痰、精液、尿、糞、淚、唾液、針吸出物、皮膚的外部切片、呼吸道、腸道或泌尿生殖道、腫瘤、器官、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞培養(yǎng)組分、組織樣品、組織切片、全細(xì)胞、細(xì)胞組分、細(xì)胞離心涂片或細(xì)胞涂片。所述生物樣品可能以固體或流體形式存在，并且可包括冷凍、固定、染色或預(yù)處理的樣品。所述生物樣品還可包括化合物例如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng)物、抗生素等等，其以其天然形式可能不與樣品天然混合。所述生物樣品可按原樣分析，即不收集和/或分離目的靶，或者在分析前可對所述生物樣品進(jìn)行靶的收集和/或分離。所述生物樣品可包括全細(xì)胞。所述細(xì)胞可為初級細(xì)胞、經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。所述生物樣品可包括干細(xì)胞(例如成體干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞)、去分化的體細(xì)胞、重編程的細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能細(xì)胞。所述干細(xì)胞可為全能的、多潛能的或多能的。所述生物樣品可包括組織樣品。所述組織樣品包括獲自生物受試者且可具有相似功能的相似細(xì)胞(不一定相同細(xì)胞，但來自相同來源的細(xì)胞)的集合。例如，人組織包括但不限于上皮組織(例如皮膚、氣道、生殖道的表面或消化道的內(nèi)襯)、結(jié)締組織(例如血管、骨或軟骨)、肌肉組織(內(nèi)臟肌或平滑肌、骨骼肌或心肌)或神經(jīng)組織(例如腦、腦神經(jīng)或脊髓)。所述組織樣品可在生物受試者的妊娠期(出生前)或發(fā)育的任何時間獲得，可獲自新鮮或保存的(例如固定或冷凍的)器官、活組織檢查、吸出物、血液、血液組分或體液(例如腦脊液、羊膜液、腹膜液或間隙液)。所述組織樣品可為組織或其部分(組織切片)的薄載玻片，其來源于正常組織(例如結(jié)腸、乳房或前列腺的組織切片)或病變組織(例如結(jié)腸腺癌)。所述組織切片厚度范圍可為約I微米(y m)至約100 Ii m或約I iim至約50 y m或約2 ii m至約25微米或約3 Pm至約5微米。可取組織樣品的同一切片并對其進(jìn)行分析以在形態(tài)學(xué)水平或分子水平檢測至少兩組不同的靶。在一些實施方案中，可分析組織樣品的多個切片的以檢測多個靶。所述組織樣品可能以組織微陣列(例如乳房組織微陣列)的形式提供。在一些實施方案中，檢測生物樣品中多個靶的方法包括序貫檢測所述生物樣品中的多個靶。首先，將許多靶結(jié)合探針同時加入生物樣品中以形成許多已結(jié)合靶的探針。隨后已結(jié)合靶的探針中的至少之一與所述生物樣品共價連接。隨后通過檢測所述已結(jié)合靶的探針來序貫檢測所述多個靶。一種或多種所述方法包括以下步驟使樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，所述已結(jié)合靶的探針的至少之一與所述生物樣品共價連接，觀察來自第一組的許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號，修改所觀察到的信號，自第二組的許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號，和觀察所述第二組信號。所述方法通常包括以下步驟將多種多組靶結(jié)合探針施加到生物樣品中，已結(jié)合靶的探針中的至少之一與生物樣品共價連接，通過觀察來自第一組多個靶的第一組信號來檢測所述生物樣品中第一組的多個靶，修改所觀察到的第一組信號，和檢測所述生物樣品 中第二組的多個靶(經(jīng)由生成來自第二組多個靶的第二組信號和觀察所述第二組信號)。所述方法還可包括重復(fù)以下步驟修改所觀察到的來自第二組多個靶的信號(即第二組信號)，隨后檢測所述生物樣品中第三組的多個靶。上述方法步驟可重復(fù)多次(以檢測第4、5和第n組的多個靶)以檢測生物樣品中多個靶的大多數(shù)或全部。在一些實施方案中，所述步驟重復(fù)約100次以檢測約100個不同組(即n=100)的靶。所述第一組信號和后續(xù)組信號可全部為同一類型(例如熒光信號)或者它們可為不同類型(例如第一組可為熒光信號而第二組可為吸收信號)。所述第一組信號和后續(xù)組信號可使用單個檢測通道或可采用多個檢測通道。在一些實施方案中，所述生物樣品中的多個靶包括至少兩組不同的靶；每組不同的靶包括至少一種靶。所述兩組不同的靶可包括相同類型的生物標(biāo)志物(例如兩組不同的抗原，第一組抗原A及第二組抗原B)或其可包括不同類型的生物標(biāo)志物(例如第一組抗原A及第二組DNA)。在一些實施方案中，所述多個靶可包括多組不同的靶。所述靶可存在于生物樣品的表面上(例如在組織切片、DNA微陣列、蛋白質(zhì)微陣列、懸浮細(xì)胞、細(xì)胞學(xué)涂片或固體載體(例如凝膠、印跡、載玻片、珠或ELISA板)的表面上)或可埋在里邊(例如用于原位檢測的細(xì)胞中的RNA或DNA靶)。所述靶可能是特定細(xì)胞類型(例如分化干細(xì)胞對比未分化干細(xì)胞)或特定疾病或醫(yī)學(xué)病癥所特有的。合適的靶包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酸(例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))、多糖(例如外源凝集素類或糖類)、脂質(zhì)、配體、受體、抗體、親和體、抗原、適體、半抗原、脂質(zhì)、激素、酶、酶底物或其組合。所述方法可用于檢測多個不同的靶，包括但不限于預(yù)后靶、激素、激素受體靶、淋巴樣靶、腫瘤組織靶、細(xì)胞周期相關(guān)靶、腦組織靶或分化群(CD)靶或其組合。靶的非限制性實例包括著絲粒蛋白-F (CENP-F)、巨蛋白、內(nèi)披蛋白、核纖層蛋白A和C (XB 10)、LAP_70、粘蛋白、核孔復(fù)合體蛋白、P180片層體蛋白、ran、組織蛋白酶D、Ps2蛋白、Her2_neu、P53、S100、上皮靶抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA 或 Ki67。腫瘤組織靶的非限制性實例可包括生物標(biāo)志物例如乳腺癌生物標(biāo)志物(例如ER、PR、Her2、CA 15-3, CA 27. 29、CEA、uPA、PAI_l 或 Ki_67)、結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物(例如 CEA、CA19-9、胸苷酸合酶或CA125)、肺癌生物標(biāo)志物(例如NSE、CEA、CYFRA 21-1, MP3、TPA、proGRP、TTF、D2-40、Podoplanin、細(xì)胞角蛋白_20、嗜鉻粒蛋白A或血清淀粉樣蛋白A)、前列腺癌生物標(biāo)志物Hf^nPSA、PCA3、uPM3、hk2*PSMA)或肝癌生物標(biāo)志物(例如AFP)。預(yù)后靶的合適實例可包括但不限于，酶靶例如半乳糖轉(zhuǎn)移酶II、神經(jīng)元特異烯醇酶、質(zhì)子ATP酶-2或酸性磷酸酶。激素、激素-調(diào)節(jié)或激素-受體靶可包括但不限于，人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促腎上腺皮質(zhì)激素、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)、雌激素受體、孕酮受體、雄激素受體、gClq-R/p33補(bǔ)體受體、IL-2受體、p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體、PTH受體、甲狀腺激素受體或胰島素受體。淋巴樣靶的合適實例可包括但不限于，a-I-抗胰凝乳蛋白酶、a-I-抗胰蛋白酶、B細(xì)胞靶、bcl-2、bcl-6、B淋巴細(xì)胞抗原36 kD、BMl (骨髓樣靶)、BM2 (骨髓樣靶)、半乳凝素-3、粒酶B、HLA I類抗原、HLA II類(DP)抗原、HLA II類(DQ)抗原、HLA II類(DR)抗原、人嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、K輕鏈、K輕鏈、A輕鏈、淋巴細(xì)胞/組織細(xì)胞抗原、巨噬細(xì)胞靶、胞壁質(zhì)酶(溶菌酶)、 P80間變性淋巴瘤激酶、漿細(xì)胞靶、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑、T細(xì)胞抗原受體(J0VI I)、T細(xì)胞抗原受體(J0VI 3)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶或未成簇的B細(xì)胞靶。所述腫瘤組織靶可包括但不限于甲胎蛋白、載脂蛋白D、BAG-I (RAP46蛋白)、CA 19-9 (sialyl lewisa)、CA50 (癌相關(guān)粘蛋白抗原)、CA125 (卵巢癌抗原)、CA242 (腫瘤相關(guān)粘蛋白抗原)、嗜鉻粒蛋白A、簇集蛋白(載脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相關(guān)抗原、上皮特異性抗原、巨囊性病的液狀蛋白-15 (gross cystic disease fluid protein-15)、肝細(xì)胞特異性抗原、調(diào)蛋白、人胃粘蛋白、人乳汁脂肪球、MAGE-1、基質(zhì)金屬蛋白酶、melan A、黑色素瘤祀(HMB45)、間皮素(mesothelin)、金屬硫蛋白、小眼轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、Muc_l核心糖蛋白、Muc-I糖蛋白、Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc_6糖蛋白、髓過氧化物酶、Myf_3(橫紋肌肉瘤祀)、Myf-4 (橫紋肌肉瘤祀)、MyoDl (橫紋肌肉瘤祀)、肌紅蛋白、nm23蛋白、胎盤堿性磷酸酶、前白蛋白、前列腺特異性抗原、前列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制素肽、PTEN、腎細(xì)胞癌靶、小腸粘蛋白抗原、四連接素、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-I、基質(zhì)金屬蛋白酶I的組織抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶2的組織抑制劑、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白、絨毛蛋白或vonWillebrand 因子。細(xì)胞周期相關(guān)靶的非限制性實例包括凋亡蛋白酶活化因子-l、bcl-W、bcl-X、溴脫氧尿苷、cdk-活化激酶(CAK)、細(xì)胞凋亡易感蛋白(CAS)、胱冬酶2、胱冬酶8、CPP32 (胱冬酶-3)、CPP32 (胱冬酶-3)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、細(xì)胞周期蛋白A、細(xì)胞周期蛋白BI、細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白D2、細(xì)胞周期蛋白D3、細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白G、DNA片段化因子(N-末端)、Fas (CD95)、Fas-相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白、Fas配體、Fen-1、IP0-38、Mcl-1、微型染色體維持蛋白、錯配修復(fù)蛋白(MSH2)、多(ADP-核糖)聚合酶、增殖細(xì)胞核抗原、P16蛋白、p27蛋白、p34cdc2、p57蛋白(Kip2)、pl05蛋白、Stat I a、拓?fù)洚悩?gòu)酶I、拓?fù)洚悩?gòu)酶II a、拓?fù)洚悩?gòu)酶III a或拓?fù)洚悩?gòu)酶II運。所述神經(jīng)組織靶可包括但不限于、a B晶體蛋白、a-絲連蛋白、a突觸核蛋白、淀粉樣前體蛋白、3淀粉樣蛋白、鈣結(jié)合蛋白、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶、興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運子I、GAP43、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)、谷氨酸鹽受體2、髓磷脂堿蛋白、神經(jīng)生長因子受體(gp75)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤靶、神經(jīng)絲68 kD、神經(jīng)絲160 kD、神經(jīng)絲200 kD、神經(jīng)元特異性烯醇酶、煙堿乙酰膽堿受體a 4、受體煙堿乙酰膽堿受體P 2、外周蛋白、蛋白基因產(chǎn)物9、S-100蛋白、血清素、SNAP-25、突觸蛋白I、突觸囊泡蛋白、tau、色氨酸羥化酶或泛素。群分化靶的合適實例包括但不限于⑶la、⑶lb、⑶lc、⑶IcU⑶le、⑶2、⑶3 8、⑶3e 、CD3 Y、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8 a 、CD8 P 、CD9、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、CDwl2、CD13、
CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDwl7、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CDlOU CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw 108, CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDwll9、CD120a、CD 120b, CD121a、 CDwl21b、CD122、CD123、CD124、CDwl25、CD126、CD127、CDw128a, CDw128b, CD130、CDwl31、CD132、CD134、CD135、CDwl36、CDwl37、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145, CD146、CD147、CD148、CDw149, CDw150, CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD 158b, CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD 166 或 TCR- ^。生物樣品中的多個靶通過使用能夠經(jīng)由靶結(jié)合部分而結(jié)合靶的多種探針(靶結(jié)合探針)來檢測。所述許多祀結(jié)合探針包括多組探針，其中每組探針可在結(jié)構(gòu)上或功能上不同于其他組。所述靶結(jié)合探針通過以下而與靶結(jié)合使靶結(jié)合探針與生物樣品接觸并隨后對其進(jìn)行孵育?？赡苄枰獙ι飿悠愤M(jìn)行在先處理(例如抗原修復(fù))以使靶便于與靶結(jié)合探針結(jié)合。當(dāng)所述靶結(jié)合探針與靶結(jié)合時，可通過檢測已結(jié)合靶的探針實現(xiàn)對靶的檢測。所述靶結(jié)合探針可能包含或可能不包含信號產(chǎn)生物。當(dāng)所述靶結(jié)合探針包含信號產(chǎn)生物時，可通過觀察來自信號產(chǎn)生物的信號實現(xiàn)對靶的檢測。當(dāng)靶結(jié)合探針不包含信號產(chǎn)生物時，與所述已結(jié)合靶的探針特異性結(jié)合的信號產(chǎn)生部分可與所述已結(jié)合靶的探針締合以實現(xiàn)對靶的檢測。在一些實施方案中，所述靶結(jié)合探針包括來源于靶結(jié)合部分和獨立地可檢測部分的單元(unit)。所述獨立地可檢測部分可為信號產(chǎn)生物例如熒光團(tuán)、生色團(tuán)、拉曼標(biāo)簽、表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)標(biāo)簽、表面增強(qiáng)拉曼共振光譜(SERRS)標(biāo)簽或放射性同位素。在一些實施方案中，所述獨立地可檢測部分包括可用間接測定來檢測的部分。例如，所述獨立地可檢測部分可為獨特的核酸序列、半抗原、酶或其組合。在一些實施方案中，所述獨立地可檢測部分包括掩蔽的信號產(chǎn)生部分。掩蔽的信號產(chǎn)生部分的實例包括但不限于掩蔽的熒光團(tuán)、掩蔽的生色團(tuán)、掩蔽的拉曼標(biāo)簽、掩蔽的SERS標(biāo)簽、掩蔽的SERRS標(biāo)簽或其組合。掩蔽的熒光團(tuán)可包括供體-受體熒光團(tuán)對(例如熒光素-羅丹明對)、猝滅的熒光團(tuán)(例如由金屬或由有機(jī)部分猝滅的)或極性-敏感熒光團(tuán)(例如Prodan ;6_丙?；鵢2_ 二甲基氨基萘，Paldan ;6_掠桐酸基_2_ 二甲基氛基蔡或Laurdan ;6_十二燒酸基-2— 二甲基氛基蔡)。獨立地可檢測部分可經(jīng)由共價結(jié)合(通過無接頭部分的直接連接或通過接頭部分連接)或非共價相互作用(例如靜電相互作用、范德瓦爾斯相互作用、偶極-偶極相互作用、氫鍵或其組合)與靶結(jié)合部分連接。在一些實施方案中，所述獨立地可檢測部分經(jīng)由可裂解接頭與所述靶結(jié)合部分連接。可裂解接頭可包括可被裂解的(例如通過氧化、親核取代、還原或pH改變)可裂解共價鍵(例如S-S鍵)或包括結(jié)合對(例如互補(bǔ)核酸或脫硫抗生物素蛋白(dethioavidin)-生物素對)，其在適當(dāng)條件下可被解離。在一些實施方案中，所述靶結(jié)合探針包含靶結(jié)合部分、交聯(lián)部分和獨立地可檢測部分。例如，針對RNA靶的靶結(jié)合探針可包含3個區(qū)域，含有與靶RNA互補(bǔ)的寡核苷酸的第一區(qū)域(即所述靶結(jié)合部分)，含有與經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針互補(bǔ)的寡核苷酸(即所述獨立地可檢測部分，zip密碼)的第二區(qū)域(即信號產(chǎn)生物)，和含有具交聯(lián)部分的寡核苷酸的第三區(qū)域，所述交聯(lián)部分能夠交聯(lián)所述靶結(jié)合探針與位于靶RNA鄰近的分子。所述交聯(lián)部分可經(jīng)由接頭部分與所述第三區(qū)域中的寡核苷酸連接。所述靶結(jié)合探針的交聯(lián)可通過將靶結(jié)合探針暴露于合適的引發(fā)劑(例如光或化學(xué)試劑)來引發(fā)。所述靶結(jié)合部分、交聯(lián)部分和獨立地可檢測部分可能以任何順序放置在所述靶結(jié)合探針中。例如在一些實施方案中，所述靶結(jié)合部分可直接與所述交聯(lián)部分和獨立地可檢測部分兩者連接。在其它實例中，所述靶結(jié)合部分可與所述交聯(lián)部分直接連接，而所述交聯(lián)部分可繼而與所述獨立地可檢測部分直接連接。在另一實例中，所述靶結(jié)合部分可與所述獨立地可檢測部分直接連接，而所述獨立地可檢測部分可繼而與所述交聯(lián)部分直接連接。 所述已結(jié)合靶的探針可直接或間接檢測，這依所述獨立地可檢測部分的性質(zhì)而定。例如，當(dāng)所述獨立地可檢測部分自身提供可檢測信號(例如光學(xué)信號或放射性信號)時，可采用直接檢測方法。當(dāng)所述獨立地可檢測部分自身不提供可檢測信號時，可能需要在先信號生成步驟以檢測所述已結(jié)合靶的探針(間接檢測)。例如，當(dāng)所述獨立地可檢測部分為核酸序列時，其可與標(biāo)記的、互補(bǔ)核酸序列雜交，而隨后雜交復(fù)合物可通過觀察來自所述標(biāo)記的信號來檢測。在一些實施方案中，所述生物樣品中的多個靶通過以下來檢測同時施加靶結(jié)合探針，隨后對已結(jié)合靶的探針進(jìn)行序貫檢測。所述多個靶包括至少兩組不同的靶，其中每組不同的靶包含至少一種靶。所述許多已結(jié)合靶的探針包括至少兩組不同的已結(jié)合靶的探針；每組不同的已結(jié)合靶的探針包含至少一種已結(jié)合靶的探針。在一個實例中，所述方法包括使生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針的步驟。隨后所述已結(jié)合靶的探針中至少一種與所述生物樣品共價連接。隨后多種不同組的已結(jié)合靶的探針以序貫方式檢測。通常，不同組的已結(jié)合靶的探針經(jīng)序貫檢測，一次一組。首先，第一組信號可從第一組的許多已結(jié)合靶的探針觀察到。該第一組信號可包括彼此不能區(qū)分的信號或它們可包括基于譜差或信號類型而彼此可區(qū)分的信號。隨后修改所述觀察到的信號。所述信號可通過用任一信號修改程序來修改，例如漂白(例如光漂白或化學(xué)漂白)。隨后第二組信號可從第二組的許多已結(jié)合靶的探針生成，接著觀察所述第二組信號。所述方法還可包括以下步驟修改所述觀察到的信號(即所述第二組信號)，從許多已結(jié)合靶的探針生成第三組信號，接著觀察所述第三組信號?！靶薷乃鲇^察到的信號”和“生成接著觀察”后續(xù)組信號的步驟可重復(fù)多次，且第4、5和n組的許多已結(jié)合靶的探針用來觀察第4、5和n組信號?？赡艿?zé)o限數(shù)目的靶(即，此處整數(shù)值n可在n=6至n=⑴的范圍)可通過采用該方法來序貫檢。在修改觀察到的信號期間，可能不必要修改所有觀察到的信號。可保存一種或多種觀察到的信號而無需修改。隨后所述一種或多種保存的信號可用于共對準(zhǔn)或比較分析。所述方法還可包括使所述觀察到的信號與與所述生物樣品中多個靶的檢測相關(guān)。若多個組的已結(jié)合靶的探針產(chǎn)生互相可區(qū)分，且彼此可分辨(例如基于譜差或信號類型)的信號，則所述方法可經(jīng)修改以序貫檢測數(shù)批的多個組的已結(jié)合靶的探針。例如，若來自4組不同的已結(jié)合靶的探針中每一組的熒光彼此可分辨，則生成熒光信號的已結(jié)合靶的探針的序貫檢測可通過一次檢測第一批的4組不同的已結(jié)合靶的探針(例如通過使用4-通道檢測)來實施。一旦觀察到來自第一批的4組不同的已結(jié)合靶的探針的信號，則修改所觀察到的信號。此后，第二批4組不同的已結(jié)合靶的探針可通過從第二批生成信號并觀察所生成的信號來檢測。通常，在每批中每次可檢測的不同的已結(jié)合靶的探針的組數(shù)依裝置容量而定，所述裝置用于觀察信號，分辨每組之間的信號。所述信號可為相互可分辨的，這是由于光譜的非重疊特性、信號類型(例如熒光信號和放射性信號)或是由于生物樣品中的不同定位(例如來自胞質(zhì)的信號與來自核的信號)。可重復(fù)所述步驟直至所有不同的已結(jié)合靶的探針被序貫檢測。
在一些實施方案中，在使靶結(jié)合探針與生物樣品接觸后，可將所述生物樣品孵育足夠長的一段時間，用于所述靶結(jié)合探針與靶的特異性結(jié)合。所述孵育可在室溫下進(jìn)行約5分鐘至約16小時或在4°C進(jìn)行約16小時的時間跨度。所述孵育溫度和孵育時間跨度主要取決于所用靶結(jié)合探針的功能和/或結(jié)構(gòu)特性(例如寡核苷酸探針的熔化溫度CU)。所述靶結(jié)合部分可經(jīng)由非共價相互作用與靶結(jié)合，所述非共價相互作用包括但不限于靜電相互作用、范德瓦爾斯相互作用、偶極-偶極相互作用、氫鍵。所述方法可任選包括更多步驟，用于除去可能未與靶結(jié)合的任何靶結(jié)合探針。未結(jié)合探針的去除可通過用合適緩沖液洗滌所述生物樣品來實現(xiàn)。所述許多靶結(jié)合探針可包括能夠共價結(jié)合生物樣品的一種或多個靶結(jié)合探針。在一些實例中，所有的許多靶結(jié)合探針可能能夠共價結(jié)合生物樣品。所述靶結(jié)合探針與生物樣品的共價連接可經(jīng)由靶本身或經(jīng)由位于靶臨近的分子。通常，所述許多靶結(jié)合探針與生物樣品接觸并孵育。通常所述許多靶結(jié)合探針首先經(jīng)由物理相互作用(即非共價相互作用例如氫鍵、范德瓦爾斯相互作用等)與靶結(jié)合以生成許多已結(jié)合靶的探針。隨后在合適條件下，所述許多已結(jié)合靶的探針的一種或多種可與靶自身或與位于靶臨近的分子共價偶聯(lián)。在一些情況下，所有的許多已結(jié)合靶的探針可與生物樣品共價偶聯(lián)/交聯(lián)。所述靶結(jié)合探針與靶或與位于靶臨近的分子的共價連接可通過直接偶聯(lián)(例如蛋白或核酸的交聯(lián))或經(jīng)由接頭部分(例如經(jīng)由雙功能的接頭部分)來實現(xiàn)。當(dāng)所述共價連接經(jīng)由接頭部分來實施時，選擇接頭長度以使得它們與生物細(xì)胞的大小相比時是可忽略的(例如約5A至約50A)。因此，即使所述靶結(jié)合探針與位于靶臨近的分子交聯(lián)，已結(jié)合的探針的位置幾乎可與靶的位置相同。所述共價偶聯(lián)可包括不可逆的共價連接(例如C-C鍵)、可逆的鍵(例如形成S-S鍵)或可裂解的鍵(例如經(jīng)由可裂解接頭的偶聯(lián))。所述共價偶聯(lián)可通過光交聯(lián)或通過經(jīng)由酯、酰胺或硫醚鍵形成的化學(xué)交聯(lián)來實現(xiàn)。所述靶結(jié)合探針與靶的共價偶聯(lián)可有助于保持靶的標(biāo)志性特征(signature)而同時實施后續(xù)用于檢測多個靶的方法步驟。術(shù)語標(biāo)志性特征意指盡管靶可能在后續(xù)操作中破壞，但其在樣品中的存在情況可通過已結(jié)合靶的探針的存在情況來推斷，所述已結(jié)合靶的探針最初與靶選擇性的結(jié)合并且在合適的位置與之交聯(lián)。當(dāng)靶對各種用于信號生成和信號修改的試劑易感時，靶結(jié)合探針與靶的共價連接特別重要。例如，RNA靶可能對可用于修改觀察到的信號的化學(xué)試劑易感。因此，當(dāng)通過觀察來自多種已結(jié)合RNA的探針的信號來檢測多個不同的RNA靶時，從第一和/或第二組RNA靶生成信號或修改觀察到的信號的同時有可能破壞后續(xù)組的RNA靶。然而，若RNA結(jié)合探針與靶RNA或與靶RNA臨近的分子交聯(lián)，即使RNA靶在后續(xù)操作中破壞，其在樣品中的存在情況也可通過已結(jié)合的探針(與靶RNA結(jié)合或與生物樣品結(jié)合)來推斷，所述已結(jié)合的探針最初與RNA靶選擇性的結(jié)合并且在合適的位置與之交聯(lián)。事實上，在一些實例中，可能有益的是，一旦已結(jié)合靶的探針與生物樣品交聯(lián)，則通過用RNA酶處理生物樣品來破壞所有細(xì)胞RNA。此外，若靶結(jié)合探針與生物樣品交聯(lián)，則更嚴(yán)格的洗滌條件可用于除去任何未結(jié)合的靶結(jié)合探針。該程序在檢測生物樣品中多個RNA靶的同時增加信噪比。來自第一組的許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號可直接或間接地觀察。當(dāng)使用直接測定時，第一組的許多靶結(jié)合探針(即，與第一組的多個靶結(jié)合以形成第一組的已結(jié)合靶的探針的探針組)包含來源于靶結(jié)合部分和獨立地可檢測部分的單元，其中所述獨立地可檢測部分自身能夠產(chǎn)生可觀察到的信號(即，所述獨立地可檢測部分包含信號產(chǎn)生物)。
在一些實施方案中，所述第一組的靶結(jié)合探針可包含用信號產(chǎn)生物(例如熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素、酶或拉曼活性部分)標(biāo)記的靶結(jié)合部分(例如抗體、核酸、適體、親和體或半抗原)。所述信號產(chǎn)生物產(chǎn)生可觀察到的信號，其可被檢測或直接目視。例如，當(dāng)所述第一組的靶結(jié)合探針包括具有與靶結(jié)合部分連接的熒光團(tuán)的探針時，在與靶結(jié)合時，已結(jié)合靶的探針可通過觀察來自熒光團(tuán)的熒光信號來檢測。所述信號產(chǎn)生物可固有地(例如生熒光的信號產(chǎn)生物)或通過與合適底物的相互作用(例如對于酶促信號產(chǎn)生物的酶-底物反應(yīng))而產(chǎn)生可觀察到的信號。當(dāng)?shù)谝唤M靶結(jié)合探針自身不提供可觀察到的信號時，對第一組已結(jié)合靶的探針使用間接檢測。在一些實施方案中，這可通過使信號產(chǎn)生部分與第一組已結(jié)合靶的探針締合來實現(xiàn)。例如，所述第一組靶結(jié)合探針可包括未標(biāo)記的一級探針(例如一級抗體)，其可用于結(jié)合生物樣品中的第一組靶(例如抗原)。隨后標(biāo)記的二級探針(例如標(biāo)記的二級抗體)可用于給已結(jié)合靶的一級探針加標(biāo)簽。隨后加標(biāo)簽的已結(jié)合靶的一級探針可通過觀察來自標(biāo)記的二級探針(其與一級探針結(jié)合)的信號來檢測。隨后加標(biāo)簽的一級探針的檢測可與生物樣品中第一組靶的存在情況相關(guān)。因為一級探針可用若干二級探針來加標(biāo)簽，所以可有效地使用間接測定來增加檢測靈敏度，從而提高信噪比。在直接地或間接地觀察來自第一組已結(jié)合靶的探針的第一組信號后，修改所觀察到的信號。信號修改可包括至少一個信號特性的變化。例如，所述信號修改可包括但不限于，信號強(qiáng)度降低、信號峰移位、共振頻率變化或去除信號(信號破壞)。對觀察到的信號進(jìn)行修改有助于在對后續(xù)組的已結(jié)合靶的探針進(jìn)行檢測期間避免信號重疊(業(yè)已觀察到的信號對比待觀察的信號)。任何信號修改方法可用于修改觀察到的信號，例如漂白(例如光漂白或化學(xué)漂白)、猝滅(例如用于猝滅熒光的金屬離子)或螯合(例如通過使用螯合劑)可。在一些實施方案中，施加化學(xué)試劑來修改觀察到的信號?？捎糜谛薷挠^察到的信號的合適化學(xué)試劑包括但不限于，修改PH的試劑(例如酸或堿)、親核試劑、親電試劑、氧化劑、還原劑或其組合。例如，堿性pH的含3% H2O2的200 mM NaHCO3可用于修改花菁(例如Cy3或Cy5)染料的突光。在觀察并隨后修改來自第一組已結(jié)合靶的探針的第一組信號后，可觀察來自第二組和后續(xù)組已結(jié)合靶的探針的信號。第二組和后續(xù)組已結(jié)合靶的探針經(jīng)由間接測定來檢測，因為所述第二組和后續(xù)組的靶結(jié)合探針經(jīng)選擇，以使它們不固有地產(chǎn)生可觀察到的信號。因此，在先信號生成步驟對于從第二組和后續(xù)組已結(jié)合靶的探針生成信號是必需的。這可通過以下來實現(xiàn)使信號產(chǎn)生部分與第二組或后續(xù)組已結(jié)合靶的探針締合，并觀察來自信號產(chǎn)生部分的信號。在一些實施方案中，所述第二組和后續(xù)組靶結(jié)合探針包含來源于靶結(jié)合部分和獨立地可檢測部分的單元，其中所述獨立地可檢測部分自身不產(chǎn)生可觀察到的信號。例如，所述獨立地可檢測部分可包含獨特的核酸序列、半抗原、酶或其組合。所述已結(jié)合靶的探針可通過使信號產(chǎn)生部分(例如標(biāo)記)與獨立地可檢測部分締合來間接測定。例如，具有半抗原作為獨立地可檢測部分的已結(jié)合靶的探針可通過以下來檢測經(jīng)標(biāo)記的抗-半抗原與已結(jié)合靶的探針(經(jīng)由半抗原-抗-半抗原相互作用)結(jié)合，隨后觀察來自所述標(biāo)記的信號。在一些實施方案中，同時施加隨后是序貫檢測靶結(jié)合探針可用于檢測兩組靶。然而，所述方法可迭代使用以檢測同一生物樣品(例如同一組織切片)中超過兩組的靶?？蓹z測的靶數(shù)目(即不同的靶的組數(shù))的上限通常依所用生物樣品類型、用于信號生成和信 號修改的化學(xué)而定。一旦方法步驟重復(fù)數(shù)次，則更嚴(yán)格方法可影響生物樣品的完整性。然而，通過選擇合適的溫和(較不嚴(yán)格的)條件，所述方法步驟可有效地檢測大量的靶(例如10至100組靶)，而不損害生物樣品的完整性。所觀察到的信號可與多個靶的檢測相關(guān)。在一些實施方案中，至少一個所述觀察或相關(guān)性步驟可用計算機(jī)輔助手段實施。相關(guān)性可人工(例如目視相關(guān))、半自動(例如用具有一些用戶介入的相關(guān)性算法)或可全自動(例如用經(jīng)由計算機(jī)/機(jī)器人而無任何用戶介入在計算機(jī)可讀介質(zhì)中的相關(guān)性算法)進(jìn)行。在其中觀察信號并以數(shù)字圖像形式存儲的實施方案中，可實施圖像的計算機(jī)輔助分析。圖像(例如來自靶結(jié)合探針和形態(tài)學(xué)染色的信號)可用計算機(jī)輔助疊加來重疊以得到生物樣品的完整信息(例如拓?fù)鋵W(xué)和/或相關(guān)性信息)。所觀察到的信號(例如第一組、第二組或后續(xù)組信號和/或其組合)可經(jīng)分析以得到關(guān)于生物樣品的各種信息。例如，第一組信號的存在情況或不存在情況可表明生物樣品中第一組靶(能夠結(jié)合第一組靶結(jié)合探針)的存在情況或不存在情況。類似地，第二組信號的存在情況或不存在情況可表明生物樣品中第二組靶(能夠結(jié)合第二組靶結(jié)合探針)的存在情況或不存在情況。對于其中多個靶可用許多靶結(jié)合探針來分析的使用，特定組靶結(jié)合探針的特定信號的存在情況或不存在情況可表明生物樣品中相應(yīng)靶的存在情況或不存在情況。在一些實施方案中，可觀察、測量信號的強(qiáng)度值(例如熒光強(qiáng)度)，并且可將其與生物樣品中靶的量相關(guān)。靶的量與信號強(qiáng)度的相關(guān)性可用標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)來測定。在一些實施方案中，可測量第一和第二信號的強(qiáng)度值并將其與相應(yīng)的靶量相關(guān)。通過比較兩信號強(qiáng)度，亦可確定第一靶和第二靶的相對量(相對于彼此或相對于對照)。類似地，在多個靶用許多靶結(jié)合探針來分析的情況下，生物樣品中不同靶的相對量可通過測量來自許多靶結(jié)合探針中每一種的信號強(qiáng)度并使其相關(guān)來測定。在一些實施方案中，可使用一個或多個對照樣品，并且通過觀察生物樣品相對對照樣品(即目的生物樣品對比對照)的信號存在情況或不存在情況，可得到關(guān)于所述生物樣品的具體信息。例如，通過比較病變組織樣品對比正常組織樣品，可得到關(guān)于僅存在于/不存在于病變組織樣品中的靶的信息。類似地，通過比較目的樣品與至少一個對照的信號強(qiáng)度，可得到關(guān)于目的樣品中靶差異表達(dá)的信息。在一些實施方案中，可觀察生物樣品中信號的位置或兩種或更多種信號的相對位置，例如，用形態(tài)學(xué)染色或區(qū)室染色來觀察。信號的位置可與生物樣品中靶的位置相關(guān)，提供關(guān)于生物樣品中多種不同靶的定位信息。可使信號的強(qiáng)度值和信號的位置相關(guān)以得到關(guān)于生物樣品中不同靶的定位和濃度信息。例如，某些靶在胞質(zhì)中比在核中表達(dá)更多，或反之亦然。關(guān)于靶的相對定位和量的信息可通過比較兩種或更多種信號的位置和強(qiáng)度值來得到。在一些實施方案中，可觀察生物樣品(例如成像)，然后使樣品與許多靶結(jié)合探針接觸已得到關(guān)于背景信號標(biāo)志性特征的信息?？蓪⒈尘靶盘枏囊呀Y(jié)合靶的探針(例如第一、第二和/或第n種已結(jié)合靶的探針)中觀察到的信號減去，然后將所觀察到的信號與靶的檢測相關(guān)。所述方法還可包括以下步驟在至少一個信號修改步驟后觀察生物樣品以得到關(guān)于任何殘余信號標(biāo)志性特征的信息?？稍诿恳恍盘栃薷牟襟E后觀察生物樣品。所述殘 余信號標(biāo)志性特征可用于表征信號修改效率(例如漂白效率)，微調(diào)信號修改步驟例如信號修改試劑的選擇、孵育時間和/或孵育溫度。所述殘余信號標(biāo)志性特征亦可用于標(biāo)準(zhǔn)化從后續(xù)已結(jié)合靶的探針中觀察到的信號。所述殘余信號標(biāo)志性特征可從后續(xù)已結(jié)合靶的探針中觀察到的信號中減去，然后將所觀察到的信號與靶的檢測相關(guān)。在一些實施方案中，生物樣品中的多個靶可通過用許多靶結(jié)合探針來檢測，其中全部所述許多靶結(jié)合探針可通過間接測定來檢測。在一個實例中，所述方法包括以下步驟使樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，自第一組的許多已結(jié)合靶的探針生成第一組信號，觀察所述第一組號，修改所觀察到的信號，自第二組的許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號，觀察所述第二組信號，和將所觀察到的信號與多個靶的檢測相關(guān)。所述方法還可包括以下步驟修改所觀察到的信號并用第3、第4和第n組的許多已結(jié)合靶的探針來多次生成新一組的信號，和觀察所生成的第3、第4和第n組信號。上述方法中的靶 結(jié)合探針自身不能產(chǎn)生信號。因此，一旦所述靶結(jié)合探針與靶結(jié)合，則需要在先信號生成步驟，然后觀察來自已結(jié)合靶的探針的信號。在一些實施方案中，通過對生物樣品成像來觀察信號。可對生物樣品成像，隨后使所述樣品與許多靶結(jié)合探針接觸，或者隨后自第一組的許多已結(jié)合靶的探針的生成第一組信號以得到背景信號標(biāo)志性特征。在一些實施方案中，所述方法可包括信號處理步驟。例如，背景信號標(biāo)志性特征可從后續(xù)信號觀察步驟所觀察到的信號中減去。所述信號處理步驟可在將所觀察到的信號與多個靶的檢測相關(guān)之前進(jìn)行，或在其期間進(jìn)行。在一些實施方案中，多種核酸靶可在生物樣品中檢測。所述多種核酸靶可至少包括兩組(第一組和第二組)不同的靶。所述多個靶可包括兩組DNA靶、兩組RNA靶或一組DNA靶和一組RNA靶。在一些實施方案中，靶組可包括至少兩種不同靶的混合物(例如兩類型DNA的混合物、兩類型RNA的混合物或DNA靶和RNA靶的混合物)。當(dāng)與許多靶結(jié)合探針接觸時，第一組靶結(jié)合第一組探針，其中所述第一組探針能夠在第一組的條件下生成第一組信號。例如，生物樣品中的RNA靶可與含有第一組RNA-結(jié)合探針(其結(jié)合第一組RNA靶)的多種探針接觸，以生成第一組的已結(jié)合RNA靶的探針。該整個第一組已結(jié)合RNA的探針可能能夠在在第一組的條件下生成第一組信號。所述方法還可包括以下步驟除去不與靶結(jié)合的任何靶結(jié)合探針，隨后自已結(jié)合靶的探針生成信號。在一些實施方案中，一種或多種所述已結(jié)合靶的探針可經(jīng)由與靶自身或與位于靶臨近的分子或結(jié)構(gòu)的共價偶聯(lián)而與生物樣品共價連接。在此情況下，未與靶結(jié)合的任何靶結(jié)合探針的去除可在已結(jié)合靶的探針與生物樣品共價連接之前實施。第一組的RNA-結(jié)合探針可為核酸(例如DNA、RNA、LNA或PNA)探針，其包含靶結(jié)合部分和獨立地可檢測部分。例如，所述靶結(jié)合探針可為DNA探針，其包含與靶RNA序列至少一部分(第一組靶中)互補(bǔ)的序列和可在間接測定中被獨立地檢測的獨特序列。所述DNA探針可在適合的雜交條件下與生物樣品孵育足夠長的一段時間，用于DNA探針序列與互補(bǔ)靶RNA序列的選擇性雜交。所述方法還可包括以下步驟使雜交的DNA探針與靶RNA序列或與位于靶RNA序列臨近的分子/結(jié)構(gòu)交聯(lián)。已結(jié)合靶的探針可通過分析獨特序列來檢測。例如，具有與獨特序列充分互補(bǔ)的序列的標(biāo)記核酸序列(例如DNA、RNA、PNA或LNA)可用于給已結(jié)合靶的探針加標(biāo)簽。所述加標(biāo)簽可通過在雜交條件下將生物樣品與標(biāo)記的、互補(bǔ)核酸序列孵育一段時間，該時間足以用于序列雜交。所述標(biāo)記可包括但不限于生色團(tuán)、熒光團(tuán)、納米顆粒、拉曼活性部分、SERS活性部分或SERRS活性部分等。隨后已結(jié)合靶的探針可通過觀察(例如成像)來自所述標(biāo)記的信號來檢測。所述獨特核酸序列亦可通過包括信號放大程序的間接測定來分析(例如 與包含大量可獨立地檢測部分(例如核酸序列)的納米顆粒雜交、自所述可獨立地檢測部分的每一個生成信號)。用于檢測生物樣品中多個靶的方法的另一實例包括以下步驟使樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，將至少一種所述已結(jié)合靶的探針與所述生物樣品共價連接，使所述已結(jié)合靶的探針與能夠結(jié)合第一組的許多已結(jié)合靶的探針并能夠生成第一組信號的第一組信號產(chǎn)生探針接觸，經(jīng)由觀察第一組信號來檢測第一組的多個靶，修改所觀察到的第一組信號，和用后續(xù)組的信號產(chǎn)生探針來多次重復(fù)生成信號和修改所觀察到的信號的步驟，以檢測后續(xù)組的多個靶?；瘜W(xué)試劑可用于修改所觀察到的信號。所述后續(xù)組的信號產(chǎn)生探針能夠結(jié)合后續(xù)組的許多已結(jié)合靶的探針，并能夠生成后續(xù)組的信號。在一些實施方案中，所述步驟可重復(fù)10次、25次、50次或100次以檢測10組靶、25組靶、50組靶或100組靶。所述多個靶可包括DNA、RNA、蛋白或其組合。在一些實施方案中，所述多個靶包括多個不同的RNA?？杀粰z測的靶RNA的非限制性實例包括核糖體RNA (rRNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運 RNA (tRNA)、小干擾 RNA (siRNA)、轉(zhuǎn)運信使 RNA (tm RNA)、piwi-相互作用RNA (piRNA)、非編碼 RNA、調(diào)節(jié) RNA、CRISPR RNAvjjSRNA (snRNA)、小核仁 RNA (snoRNA)、RNAse-P-RNA, PUT RNA、核酶或micro RNA (miRNA)。在一些實施方案中，原位檢測所述多個靶。所述方法可用于，例如通過對新生RNA轉(zhuǎn)錄物原位成像來檢測轉(zhuǎn)錄起始位點或差異基因調(diào)控。 上述用于檢測生物樣品中多個靶的方法可用于檢測多批的多個靶,其中所述多個靶的每一批包括多組的多個靶。例如，生物樣品中的多種核酸(多組不同的核酸)和多種蛋白(多組不同的蛋白)可構(gòu)成兩批的多個靶。首先，所述生物樣品中的多種核酸(例如兩組不同的核酸例如第一組DNA和第二組RNA)可通過以下檢測同時施加靶結(jié)合探針，隨后序貫檢測已結(jié)合靶的探針。隨后可進(jìn)行對多種蛋白的檢測(例如對第一組蛋白A和第二組蛋白B的檢測)。例如，可將多種核酸-結(jié)合探針(即DNA-結(jié)合探針和RNA-結(jié)合探針)施加到生物樣品中以形成許多已結(jié)合靶核酸的探針(第一組已結(jié)合DNA的探針和第二組已結(jié)合RNA的探針)。隨后檢測可來自第一組已結(jié)合DNA的探針的信號(通過直接測定或間接測定，這取決于已結(jié)合DNA的探針自身是否生成信號)。隨后可修改所觀察到的信號，然后自多種已結(jié)合RNA的探針生成第二組信號(該信號需要自第二組已結(jié)合靶的探針生成，因為與第二組核酸雜交的靶結(jié)合探針經(jīng)選擇，使得它們自身不產(chǎn)生可檢測信號)。隨后可觀察自已結(jié)合RNA的探針?biāo)傻男盘?。一旦對多種的多組核酸靶進(jìn)行檢測，則所述方法可用于檢測多種的多組蛋白?？墒┯媚軌蚪Y(jié)合靶蛋白A和B的靶結(jié)合探針(例如抗體A和抗體B)。與蛋白A結(jié)合的抗體A隨后可通過觀察來自抗體A的信號經(jīng)由直接或間接測定來檢測(第一組蛋白)。隨后可修改觀察到的信號。隨后生成來自與蛋白B結(jié)合的抗體B的信號，然后觀察所生成的信號。隨后可將所觀察到的信號與蛋白A組和蛋白B組的檢測相關(guān)。所述方法步驟的一個或多個可人工進(jìn)行，或者可用自動系統(tǒng)自動進(jìn)行。在一些實施方案中，全部所述方法步驟可用自動系統(tǒng)進(jìn)行。在一些實施方案中，提供了使用本發(fā)明方法用于檢測生物樣品中多個靶的裝置。 所述裝置包括樣品處理系統(tǒng)、試劑分配系統(tǒng)、探針交聯(lián)系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)。用包括以下步驟的方法所述裝置可用于檢測生物樣品中的多個靶使生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，任選將所述許多靶結(jié)合探針中至少一種經(jīng)由共價鍵與生物樣品連接，觀察來自第一組的許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號，修改所觀察到的信號，自第二組許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號，和觀察所述第二組信號。所述樣品處理系統(tǒng)可包括用于托住樣品的平臺(例如用于托住組織切片載玻片的顯微鏡載物臺)，和用于將一種或多種試劑輸入和輸出到樣品的端口。所述樣品處理系統(tǒng)還可包括可用于控制孵育參數(shù)(例如溫度、壓力)的孵育系統(tǒng)。所述樣品處理系統(tǒng)可配置為流動池，其具有整合的樣品托住平臺、用于試劑流入和流出的整合端口和/或整合的孵育系統(tǒng)。所述試劑分配系統(tǒng)可包括能夠容納一種或多種試劑的一個或多個貯池(reservoir)，和將試劑分配到位于樣品處理系統(tǒng)的樣品的設(shè)備(means)。所述試劑可經(jīng)由以下來分配到樣品中經(jīng)由移液器吸取到載玻片托架上的端口或經(jīng)由穿過連接載玻片托架和試劑分配系統(tǒng)的管而泵送。所述信號檢測系統(tǒng)可包括光源(例如顯微鏡光源)和信號捕獲系統(tǒng)。例如，所述信號檢測系統(tǒng)可為顯微鏡，其具有光源和用于數(shù)字捕獲生物樣品圖像的照相機(jī)(例如CCD照相機(jī))。所述探針交聯(lián)系統(tǒng)可包括光源，其可經(jīng)控制以在特定時間段內(nèi)發(fā)射特定波長的光。當(dāng)信號檢測系統(tǒng)包括光源，所述探針交聯(lián)系統(tǒng)可經(jīng)配置以使用相同的光源。在一些實施方案中，所述探針交聯(lián)系統(tǒng)可配置到信號檢測系統(tǒng)的一部分。所述裝置可為全自動的(即無任何操作員干預(yù))或半自動的，其中所述樣品處理系統(tǒng)、探針交聯(lián)系統(tǒng)、試劑分配系統(tǒng)或信號檢測系統(tǒng)中的至少之一為可在無操作員干預(yù)下操作。所述裝置可包括中央處理單元、存儲器、控制器單元和/或顯示裝置。所述顯示裝置可用于顯示所觀察到的信號(例如生物樣品的圖像)。所述控制器單元可能夠與所述中央處理單元、樣品處理系統(tǒng)、試劑分配系統(tǒng)、探針交聯(lián)系統(tǒng)或信號檢測系統(tǒng)中至少之一通信。所述通信可為單向通信或雙向通信。用預(yù)設(shè)的指令組(經(jīng)由算法)，所述控制器單元可為可操作的。當(dāng)使用雙向通信時，根據(jù)來自所述中央處理單元、樣品處理系統(tǒng)、試劑分配系統(tǒng)、探針交聯(lián)系統(tǒng)或信號檢測系統(tǒng)中任一個的反饋，可調(diào)節(jié)預(yù)設(shè)的指令組。
所述樣品處理系統(tǒng)可包括用于容納生物樣品的平臺。所述平臺可為靜止的或其可從一個位置移動到另一位置用于運輸生物樣品。所述試劑分配系統(tǒng)可用于分配至少一種含有至少一種靶結(jié)合探針的試劑溶液到生物樣品。例如，所述試劑分配系統(tǒng)可用于分配含有許多靶結(jié)合探針的試劑溶液到生物樣品上，用于使生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸。在一些實施方案中，所述試劑分配系統(tǒng)可用于分配多種試劑溶液(同時或序貫)，各溶液含有至少一種靶結(jié)合探針。所述試劑分配系統(tǒng)亦可用于分配洗滌溶液(可用于除去任何未結(jié)合靶的靶結(jié)合探針)、封閉溶液(用于封閉生物樣品防止非-特異性結(jié)合)或?qū)τ谔结樈宦?lián)、洗滌和/或信號檢測所必需的其它試劑。在一些實施方案中，所述試劑分配系統(tǒng)可用于分配試劑溶液，其含有用于修改針對靶組所觀察到的信號的化學(xué)劑。在一些實施方案中，提供了用于檢測生物樣品中多組多個靶的試劑盒。所述試劑盒可包括實施上述方法可需要的包裝在一起的一種或多種試劑。例如，所述試劑盒可包括許多靶結(jié)合探針和用于洗滌未結(jié)合的靶結(jié)合探針的緩沖液。所述試劑盒可包括靶結(jié)合探針(其能夠生成信號并能夠與位于靶附近的靶或分子交聯(lián))和能夠修改生成的信號的化學(xué)齊U。在一個實例中，所述試劑盒包括能夠與生物樣品交聯(lián)的經(jīng)熒光標(biāo)記的靶結(jié)合探針(例如熒光標(biāo)記的抗體)和能夠毀滅來自熒光標(biāo)記的熒光的化學(xué)劑。所述試劑盒亦可包含交聯(lián) 反應(yīng)可需要的試劑。所述試劑盒還可包括詳述試劑盒中存在的組分的說明書、和/或用所述試劑盒中存在的組分實施必要方法步驟的實驗方案。在一個實例中，用于檢測生物樣品中多個靶的多種的試劑盒包括許多靶結(jié)合探針，其中各靶結(jié)合探針能夠生成信號，并且所述靶結(jié)合探針中至少之一能夠與其靶或與位于靶附近的分子交聯(lián)；和至少一種化學(xué)劑，其能夠修改自至少一種靶結(jié)合探針?biāo)傻男盘?。所述許多靶結(jié)合探針可包括至少兩組不同的靶結(jié)合探針，其能夠結(jié)合兩種不同的靶。例如，所述試劑盒可包括特異性結(jié)合區(qū)室生物標(biāo)志物(例如胞核中存在的生物標(biāo)志物)的第一組靶結(jié)合探針和特異性結(jié)合疾病標(biāo)志物(例如癌癥生物標(biāo)志物)的第二組靶結(jié)合探針。在一些實施方案中，一種單獨的化學(xué)劑可用于修改自所有靶結(jié)合探針?biāo)傻男盘?。然而，亦可能的是，所述試劑盒包括用于修改自試劑盒中每一靶結(jié)合探針?biāo)尚盘柕亩喾N化學(xué)劑。所述方法有助于對來自同一生物樣品的多種(例如可能無限的數(shù))靶(例如疾病標(biāo)志物)進(jìn)行精確且可靠的分析。所述對多個靶的檢測可應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)的分析、診斷、治療或預(yù)后應(yīng)用中、例如，用于分析患者細(xì)胞或組織樣品的方法可在診斷上(例如用于鑒定具有特定疾病，已暴露于特定毒素或?qū)μ囟ㄖ委熁蚱鞴僖浦卜磻?yīng)良好的患者)和預(yù)后上(例如用于鑒定可能出現(xiàn)特定疾病、對特定治療反應(yīng)良好或接受特定器官移植的患者)采用。
實施例除非另外明確說明，實施例中描述的成分均可從常見化學(xué)供應(yīng)商市購。實施例部分所用的一些縮寫闡述如下“mg” 毫克；“ng” 納克；“pg” 皮克；“fg” 飛克；“ag” 阿克渺克(zeptograms) u L”:微升毫升;“mg/mL”毫克 / 毫升毫摩爾濃度；“ PM”:微摩爾濃度；“pM”:皮摩爾濃度;“nmol”:納摩爾毫摩爾;“pmol”:皮摩爾；“ms”毫秒；“min.，，:分鐘;“h. ” 小時，和“。C ”攝氏度。
圖I是流程圖，其圖示說明了本發(fā)明一個實施方案的方法步驟。該圖說明了通過以下來檢測兩組不同的靶同時施加兩組靶結(jié)合探針，隨后序貫檢測已結(jié)合靶的探針中的每一組。所述方法包括施加多個不同的靶結(jié)合探針到生物樣品(12)中的步驟。所述許多靶結(jié)合探針包括可被序貫檢測的多組靶結(jié)合探針(例如兩組靶結(jié)合探針)。在接觸及隨后的孵育后，所述許多靶結(jié)合探針與多個不同的靶結(jié)合。所述靶結(jié)合探針隨后與生物樣品
(14)交聯(lián)(共價連接)。所述已結(jié)合靶的探針與生物樣品的共價連接可通過位于靶附近的靶(即，探針與靶交聯(lián))或分子(例如探針與鄰近蛋白的交聯(lián))。一旦所述許多靶結(jié)合探針與多個不同的靶(例如兩組靶)結(jié)合，則所述多個靶可通過序貫檢測許多已結(jié)合靶的探針來序貫檢測。若第一組的許多已結(jié)合靶的探針包括信號產(chǎn)生物，則來自信號產(chǎn)生物的信號可在不需要任何另外的信號生成步驟情況下來觀察(20)。然而，若第一組的許多已結(jié)合靶的探針自身不發(fā)射信號，則可需要另外的信號生成步驟。在一個實施方案中，這通過將信號產(chǎn)生物與第一組的許多已結(jié)合靶的探針締合來實現(xiàn)(18)。隨后可觀察來自第一組的許多已結(jié)合靶的探針的信號(20)。一旦觀察到來自第一組的已結(jié)合靶的探針的信號(例如通過成像)，則修改所觀察到的信號(例如除去)(22)。所觀察到的信號可通過將生物樣品與化學(xué)劑孵育來修改。一旦所觀察到的來自第一組的已結(jié)合靶的探針的信號經(jīng)過修改，則自第二 組的許多已結(jié)合靶的探針生成信號(24)。隨后可觀察所生成的信號以檢測第二組的已結(jié)合靶的探針(26)。圖2圖示說明了用于檢測多種(例如第I組、第2組和第n組，整數(shù)值“n”可為1-100的范圍)不同的靶的本發(fā)明一個實施方案的方法步驟。所述方法包括將多個不同的靶結(jié)合探針施加到生物樣品的步驟(32)。所述許多靶結(jié)合探針包括可被序貫檢測的多組靶結(jié)合探針(例如第I組、第2組和第n組，整數(shù)值“n”可為1-100的范圍)。一旦所述許多靶結(jié)合探針與多個不同的靶結(jié)合，則所述多個不同的靶可通過序貫檢測許多已結(jié)合靶的探針來貫檢檢測。在接觸生物樣品及隨后的孵育后，所述許多靶結(jié)合探針與多個不同的靶結(jié)合。所述靶結(jié)合探針隨后可與生物樣品(34)交聯(lián)(例如共價偶聯(lián))。任何共價偶聯(lián)方法可用于使靶結(jié)合探針與生物樣品共價連接。例如，靶結(jié)合探針可經(jīng)由酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵、碳碳鍵等與生物樣品共價偶聯(lián)。若第一組的許多已結(jié)合靶的探針包括信號產(chǎn)生物，則來自信號產(chǎn)生物的信號可在不需要任何另外的信號生成步驟情況下來觀察(40)。然而，若第一組的許多已結(jié)合靶的探針自身不發(fā)射信號，則可需要另外的信號生成步驟。在一個實施方案中，這通過將信號產(chǎn)生物與第一組的許多已結(jié)合靶的探針締合來實現(xiàn)(38)。隨后通過對生物樣品成像可觀察來自第一組的許多已結(jié)合靶的探針的信號(40)。一旦通過成像觀察到來自第一組的已結(jié)合靶的探針的信號，則修改所觀察到的信號(42)。隨后可自第二組的許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號(44)。該第二組信號與第一組信號可相同或可不相同。隨后通過對生物樣品成像來觀察第二組信號(46)。一旦觀察到，則修改該第二組信號(例如通過施加化學(xué)劑或光漂白來毀滅)(47)。所述信號生成、修改和觀察的方法步驟可重復(fù)多次以自后續(xù)組已結(jié)合靶的探針生成信號，并對后續(xù)組已結(jié)合靶的探針進(jìn)行成像(48)。隨后可將所觀察到的信號與生物樣品中多個靶的檢測相關(guān)(49)。該相關(guān)性步驟可在觀察來自每組已結(jié)合靶的探針的每組信號后隨即進(jìn)行，或者其可在觀察來自全部已結(jié)合靶的探針的全部信號后進(jìn)行。實施例I交聯(lián)劑改性的、花菁染料標(biāo)記的DNA寡聚物Cy3-T20-SFAD合成如下。將IOXPBS (磷酸緩沖鹽水)中的10 UL (31. 9納摩爾)Cy3-T20-NH2 (含有20個胸苷單元的胸苷寡聚物，其在3’ -端用氨基修飾的接頭標(biāo)記而在5’ -端用Cy3 染料標(biāo)記,購自IntegratedDNA technologies, USA)溶液用 80 u L 水和 10 u L IM NaHC03/Na2C03 緩沖液(pH 8. 4)稀釋。向其加入磺基琥珀酰亞胺基-[五氟疊氮基苯甲酰氨基]乙基-1，3-二硫代丙酸酯(橫基 _SFAD,購自 ThermoFisher Scientific Inc. , IL, USA.)的 10 mM DMSO 溶液(20當(dāng)量)。將混合的溶液在室溫下攪拌約1-2小時。用柱供應(yīng)商提供的實驗方案，將粗制混合物在 NAP-10 柱(GE Healthcare, USA)上純化。磺基-SFAD是雜雙官能交聯(lián)劑，其含有胺反應(yīng)性磺基-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯和在具有14. 6 A長度的二硫化物間隔臂對面端的光活化四氟苯基疊氮化物。NHS酯與伯氨基在pH 7-9緩沖液中有效反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。當(dāng)暴露于紫外光(300-370 nm)時，全氟苯基疊氮化物形成極度反應(yīng)性的氮賓基團(tuán)，其可插入活性碳-氫鍵(C-H)或加入未飽和的碳鏈。全氟芳基氮賓快速反應(yīng)并且非特異性地插入C-H鍵，其效率高于非氟化的芳基疊氮化物。
實施例2
交聯(lián)劑改性的、花菁染料標(biāo)記的DNA寡聚物Cy3-T20-SDAD合成如下。將10XPBS (磷酸緩沖鹽水)中的10 UL (31. 9納摩爾)Cy3-T20-NH2 (含有20個胸苷單元的胸苷寡聚物，其在3’-端用氨基修飾的接頭標(biāo)記而在5’-端用Cy3 染料標(biāo)記,購自Integrated DNAtechnologies, USA)溶液用 80 y L 水和 10 u L IM NaHC03/Na2C03 緩沖液(pH 8. 4)稀釋。向其加入磺基琥拍酰亞胺基2-([4，4’-疊氮戍酰胺基(azipentanamido)]乙基)-1，3’_ 二硫代丙酸酯(橫基-SDAD,購自 ThermoFisher Scientific Inc. , IL, USA.)的 10 mM 水溶液(20當(dāng)量)。將混合的溶液在室溫下攪拌1-2小時。用柱供應(yīng)商提供的實驗方案，將粗制混合物在NAP-10柱(GE Healthcare, USA)上純化。磺基-SDAD是雜雙官能交聯(lián)劑，其含有胺反應(yīng)性磺基-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯和在具有13. 5 A長度的二硫化物間隔臂對面端的光活化二吖丙因(diazirine)部分。NHS酯與伯氨基在pH 7-9緩沖液中有效反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。用長波紫外光(330-370nm)對二吖丙因進(jìn)行光活化，產(chǎn)生反應(yīng)性卡賓中間體。所述中間體可通過以對應(yīng)于間隔臂長度的距離與任何氨基酸側(cè)鏈或肽主鏈的加成反應(yīng)而形成共價鍵。實施例3
交聯(lián)劑改性的、花菁染料標(biāo)記的DNA寡聚物Cy3-T20-SANPAH合成如下。將10XPBS(磷酸緩沖鹽水)中的10 UL (31. 9納摩爾)Cy3-T20-NH2 (含有20個胸苷單元的胸苷寡聚物，其在3’-端用氨基修飾的接頭標(biāo)記而在5’-端用Cy3 染料標(biāo)記,購自IntegratedDNA technologies, USA)溶液用 80 u L 水和 10 u L IM NaHC03/Na2C03 緩沖液(pH 8. 4)稀釋。向其加入N-磺基琥珀酰亞胺基_6-(4’ -疊氮基-2’ -硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-SANPAH,購自 ThermoFisher Scientific Inc. , IL, USA.)的 20 mM 水溶液(50 當(dāng)量)。將混合的溶液在室溫下攪拌1-2小時。用柱供應(yīng)商提供的實驗方案，將粗制混合物在NAP-10 柱(GE Healthcare, USA)上純化?；腔?SANPAH是水溶性的雜雙官能交聯(lián)劑，且間隔臂長度為18. 2 A0磺基-SANPAH交聯(lián)劑含有與伯胺反應(yīng)的NHS酯及在320-350 nm具有光反應(yīng)性的硝基苯基疊氮化物基團(tuán)。
實施例4
DNA探針與蛋白的交聯(lián)通過將花菁染料標(biāo)記的具有交聯(lián)官能團(tuán)的DNA寡聚物(Cy3-T20-SFAD或Cy3-T20_SDAD)與鏈霉抗生物素接觸來研究。Cy3-T20_SFAD和Cy3-T20-SDAD的彼此差異僅在于其交聯(lián)官能團(tuán)。花菁染料標(biāo)記的無交聯(lián)官能團(tuán)的DNA寡聚物Cy3-T20-NH2作為對照。按一式三份進(jìn)行反應(yīng)，每一寡聚物進(jìn)行兩組實驗(即兩組的3個孔/寡聚物)。對于每一反應(yīng)，將Cy3-標(biāo)記的寡聚物(100 UL/孔，I PM或0. I u M)加入微量滴定板(Reacti-Bind (高結(jié)合能力)板,購自ThermoFisher Scientific, IL,USA.)的鏈霉抗生物素包被的孔中。將一組(對于每一寡聚物，一式三份)暴露于紫外光20分鐘，而將另一組(對于每一寡聚物，一式三份)保持在暗處。反應(yīng)后，除去過量試劑，各孔用I XPBS洗滌三次。隨后各孔用100 uL IXPBS補(bǔ)充，將微量滴定板在Tecan讀板器(激發(fā)波長為544 nm及發(fā)射波長為595 nm)上讀數(shù)。每組的各寡聚物用兩種不同濃度(I ii M和0. I PM)進(jìn)行，并比較相對熒光計數(shù)。圖3顯示在兩種不同濃度的Cy3-T20_SFAD和Cy3_T20_SDAD下，每組的平均熒光計數(shù)。圖3顯示在暴露于紫外光時，Cy3-T20-SFAD寡聚物與鏈霉抗生物素的顯著交聯(lián)。當(dāng)將I ii M Cy3-T20-SFAD用于實驗時，0. 44%的Cy3_T20_SFAD與鏈霉抗生物素交聯(lián)。當(dāng)使用0. I UM的濃度時，0. 15%的Cy3-T20-SFAD與鏈霉抗生物素交聯(lián)。當(dāng)在暗處進(jìn)行時(對照)，Cy3-T20-SFAD的交聯(lián)顯著減少。對照寡聚物和Cy3-T20_SDAD在紫外暴露的和未暴露的樣品之間未顯示顯著差異。實施例5
DNA探針與細(xì)胞的交聯(lián)通過將花菁染料標(biāo)記的DNA寡聚物(Cy3-T20-SANPAH或Cy3-T20-NH2(對照))與細(xì)胞孵育來研究。Cy3_T20_SANPAH包括可與細(xì)胞蛋白反應(yīng)(因此交聯(lián)探針)的疊氮化物官能團(tuán)。對照探針Cy3-T20-NH2不含任何的交聯(lián)官能團(tuán)。反應(yīng)用每一寡聚物濃度為25 nM的兩組來進(jìn)行。采用用于脫蠟和兩步介質(zhì)抗原修復(fù)實驗方案的Ventana Discovery系統(tǒng)的實驗方案,將LNCap (雄激素-敏感的人前列腺腺癌細(xì)胞)沉淀載玻片(購自Cell Signaling Technology Inc. , MA, USA.)脫臘并在Ventana自動染色器上修復(fù)抗原。用洗滌劑(I次)、水(3次)和IXPBS (I次)洗滌載玻片。對于每一反應(yīng)，將300 u L的寡聚物溶液置于每一載玻片上，且將載玻片在暗處孵育lh。將一組(對于每一寡聚物)暴露于紫外光(透射儀)40分鐘，而將另一組(對于每一寡聚物)置于暗處。反應(yīng)后，除去過量的試劑，并用I XPBS洗滌載玻片達(dá)10分鐘。再用IXPBS洗滌載玻片并用DAPI (I u g/mL, 2. 86 y M)染色5分鐘。隨后將載玻片從DAPI溶液中移出，用Vectashield裝上,并成像。用Zeiss成像儀用20 ms的Cy3曝光進(jìn)行成像。圖4顯示每組的平均熒光計數(shù)。在紫外光下用Cy3-T20_SANPAH孵育的載玻片與其余相比顯示更高的熒光計數(shù)。這清楚地表明在紫外暴露時，寡聚物Cy3-T20-SANPAH與細(xì)胞交聯(lián)。在其它組中觀察到微弱染色。通過載玻片置于IXPBS中來移出蓋玻片，在40°C下用0. 5XSSC孵育載玻片過夜。在用IXPBS (0N洗滌)洗滌后，裝上載玻片并在Ziess上成像。將Cy3曝光時間保持在20 ms。圖4顯示每組的平均熒光計數(shù)。圖4清楚地表明只有含有交聯(lián)劑綴合的寡聚物的載玻片和暴露于光才顯示良好信號。定量分析證實了這一點。實施例6對組織樣品中聚(A) mRNA和U6 snRNA探針的多重檢測通過同時加入靶結(jié)合探針，隨后如下序貫檢測已結(jié)合靶的探針來實施。將5’ -生物素-標(biāo)記的LNA mRNA原位雜交探針聚T (25) Vn (購自Exiqon, USA)和5’ -地高辛-標(biāo)記的miRCURY LNA "*檢測探針U6hsa/mmu/rno (購自Exiqon, USA)分別用于檢測總的聚(A) mRNA和U6 snRNA探針。將含有人結(jié)腸癌組織樣品的載玻片在histochoice (購自AMRESCO，USA)中脫蠟，并在漸減量的乙醇中再水合15分鐘。隨后將組織樣品在I XPBS、含0.3% Triton X-100的IXPBS(wt/wt %)，然后在IXPBS中洗滌。隨后將組織樣品在50%、70%、95%和100%乙醇(水中的v/v %)中各自脫水10分鐘，并風(fēng)干20分鐘。施加含有雜交緩沖液(50%甲酰胺，2XSSC，500 u g/ml 酵母 tRNA, 0. 1% 吐溫-20)中的聚 T (25) Vn 和 U6 hsa/mmu/rno (25 nM)溶液。將探針在95°C的溫度塊中加熱10分鐘，簡短離心，并施加到組織樣品中。隨后將組織樣品用蓋玻片蓋上，并密封。隨后將載玻片在37°C在增濕室孵育12 h。雜交后，在67°C下，將組織樣品在2 X SSC中洗滌5分鐘，在0. 5 X SSC中洗滌5分鐘，和在0. 5 X SSC中洗滌10分鐘。隨后在室溫下，將組織樣品用I X PBS洗滌，并用3% BSA PBS (wt/wt%)中的Cy3-標(biāo)記的鏈霉抗生物素(Jackson Immunolabs, USA)孵育30分鐘,并用Cy3濾色塊在 Zeiss顯微鏡上成像。圖5(樣品I)在Cy3通道中顯示強(qiáng)信號，表明檢測到聚(A) mRNA。在檢測聚(A) mRNA后，將載玻片用堿性含3% H2O2的200 mM NaHCO3 (化學(xué)漂白液)處理15分鐘。將載玻片在I XPBS中漂洗，再次用含3% H2O2的200 mM NaHCO3處理20分鐘，隨后用IXPBS漂洗。隨后在所有通道中對載玻片成像。圖5(樣品2)顯示大多數(shù)Cy3信號在用化學(xué)漂白液處理后被漂白。最后，將載玻片用羅丹明-標(biāo)記的抗-地高辛抗體(Roche，USA)孵育以檢測U6轉(zhuǎn)錄物。用Cy3濾色塊通過成像來觀察載玻片。圖5(樣品3)在Cy3通道顯示強(qiáng)信號(羅丹明熒光與Cy3熒光重疊)，表明檢測到U6 snRNA轉(zhuǎn)錄物。甚至在對組織樣品進(jìn)行化學(xué)漂白后，地高辛標(biāo)記的U6. hsa/mmu/rno探針仍保留在樣品中。實施例7
交聯(lián)劑改性的、花菁標(biāo)記的5’ -Cy3-b-肌動蛋白-LNA-AmM-SANPAH (如結(jié)構(gòu)I所示；核苷酸之后的星號(*)表明該核苷酸是鎖核酸(LNA)核苷酸)如下合成。
權(quán)利要求
1.檢測生物樣品中多個靶的方法，所述方法包括 (a)使所述生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針； (b)將所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接； (C)觀察來自第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號； (d)修改所述觀察到的信號； (e)自第二組的所述許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號；和 (f)觀察所述第二組信號。
2.權(quán)利要求I的方法，還包括用第3、第4和第η組的所述許多已結(jié)合靶的探針來重復(fù)步驟⑷至⑴多次以觀察第3、第4和第η組信號。
3.權(quán)利要求I的方法，還包括將所述觀察到的信號與所述多個靶的檢測相關(guān)。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述許多已結(jié)合靶的探針的全部與所述生物樣品共價連接。
5.權(quán)利要求I的方法，其中所述已結(jié)合靶的探針與所述生物樣品經(jīng)由靶自身或經(jīng)由位于靶附近的分子而共價連接。
6.權(quán)利要求I的方法，其中所述靶結(jié)合探針包括來源于靶結(jié)合部分和獨立地可檢測部分的單兀。
7.權(quán)利要求6的方法，其中第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針的獨立地可檢測部分包括信號產(chǎn)生部分。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述信號產(chǎn)生部分包括熒光團(tuán)、生色團(tuán)、拉曼標(biāo)簽、SERS標(biāo)簽或其組合。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述靶結(jié)合部分與獨立地可檢測部分經(jīng)由可裂解接頭偶聯(lián)。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述獨立地可檢測部分包括獨特的核酸序列、半抗原、酶或其組合。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述獨立地可檢測部分包括掩蔽的信號產(chǎn)生部分。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述掩蔽的信號產(chǎn)生部分包括掩蔽的熒光團(tuán)、掩蔽的生色團(tuán)、掩蔽的拉曼標(biāo)簽、掩蔽的SERS標(biāo)簽或其組合。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述信號通過解掩蔽所述掩蔽的信號產(chǎn)生部分自所述許多已結(jié)合靶的探針而生成。
14.權(quán)利要求I的方法，其中所述信號通過將信號產(chǎn)生部分與所述已結(jié)合靶的探針的每一個締合自所述許多已結(jié)合靶的探針而生成。
15.權(quán)利要求I的方法，還包括在接觸步驟之后的用于除去任何未結(jié)合靶的靶結(jié)合探針的步驟。
16.權(quán)利要求I的方法，還包括對所述生物樣品成像以獲取背景信號標(biāo)志性特征，隨后使所述生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸。
17.權(quán)利要求I的方法，其中所述多個靶的檢測包括確定所述多個靶的存在情況、不存在情況、位置或量。
18.權(quán)利要求I的方法，其中所述多個靶選自寡核苷酸、核酸、肽、蛋白質(zhì)、激素、受體、多糖、脂質(zhì)及其組合。
19.權(quán)利要求I的方法,其中所述多個靶基本上由多種核糖核酸組成。
20.權(quán)利要求I的方法，其中所述多個靶基本上由多種蛋白質(zhì)組成。
21.檢測生物樣品中多個靶的方法，所述方法包括 (a)使所述生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針； (b)將所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接； (C)自第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針生成第一組信號； (d)觀察所述第一組信號； (e)修改所述觀察到的信號； (f)自第二組的所述許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號；和 (g)觀察所述第二組信號。
22.權(quán)利要求21的方法，還包括用第3、第4和第η組的所述許多已結(jié)合靶的探針來重復(fù)步驟(e)至(g)以觀察第3、第4和第η組信號。
23.權(quán)利要求22的方法，其中整數(shù)值η的范圍為5-100。
24.權(quán)利要求21的方法，還包括將所述觀察到的信號與所述多個靶的檢測相關(guān)。
25.權(quán)利要求21的方法，還包括對所述生物樣品成像以獲取背景信號標(biāo)志性特征，隨后生成所述第一組信號。
26.權(quán)利要求25的方法，還包括在相關(guān)性步驟前，將背景信號標(biāo)志性特征從后續(xù)信號觀察步驟中觀察到的信號減去。
27.檢測生物樣品中多個靶的方法，所述方法包括 (a)使所述樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針； (b)將所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接； (C)使所述許多已結(jié)合靶的探針與第一組信號產(chǎn)生探針接觸，該第一組信號產(chǎn)生探針能夠結(jié)合第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針并能產(chǎn)生第一組信號； (d)經(jīng)由觀察所述第一組信號來檢測所述第一組的多個靶； (e)修改所述觀察到的第一組信號；和 (f)用后續(xù)組的信號產(chǎn)生探針重復(fù)步驟(C)至(e)多次以檢測后續(xù)組的多個靶，其中所述后續(xù)組的信號產(chǎn)生探針能夠結(jié)合后續(xù)組的所述許多已結(jié)合靶的探針，并能夠產(chǎn)生后續(xù)組信號。
28.權(quán)利要求27的方法，其中通過施加化學(xué)劑來修改所述觀察到的第一組信號。
29.權(quán)利要求27的方法，還包括用于除去未結(jié)合多個靶的靶結(jié)合探針的步驟，隨后使所述已結(jié)合靶的探針與所述第一組信號產(chǎn)生探針接觸。
30.權(quán)利要求29的方法，還包括用于除去未結(jié)合第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號產(chǎn)生探針的步驟，隨后檢測所述第一組的多個靶。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述許多已結(jié)合靶的探針的全部與靶自身或與位于靶附近的分子共價偶聯(lián)。
32.權(quán)利要求27的方法，其中將所述步驟(c)至(f)重復(fù)最多達(dá)100次。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所述多個靶選自脫氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白質(zhì)及其組合。
34.權(quán)利要求27的方法，其中所述多個靶基本上由多種核糖核酸組成。
35.用于檢測生物樣品中多組多個靶的試劑盒，所述試劑盒包括 許多靶結(jié)合探針，其中每一靶結(jié)合探針能夠產(chǎn)生信號并且至少一種所述靶結(jié)合探針能夠與靶或與位于靶附近的分子交聯(lián)；和 至少一種化學(xué)劑，其能夠修改所述自至少一種靶結(jié)合探針?biāo)a(chǎn)生的信號。
36.用于檢測生物樣品中多個靶的裝置，所述裝置包括 樣品處理系統(tǒng)； 試劑分配系統(tǒng)； 探針交聯(lián)系統(tǒng)；和 信號檢測系統(tǒng)。
37.權(quán)利要求36的裝置，其中所述試劑分配系統(tǒng)分配至少一種含有至少一種靶結(jié)合探針的試劑溶液。
38.權(quán)利要求36的裝置，其中所述樣品處理系統(tǒng)、試劑分配系統(tǒng)、探針交聯(lián)系統(tǒng)或信號檢測系統(tǒng)中至少一種可在無操作員干預(yù)下操作。
39.權(quán)利要求36的裝置，其中所述裝置可用于用包括以下步驟的方法來檢測所述生物樣品中的多個靶 (a)使所述生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針； (b)觀察來自第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號； (C)修改所述觀察到的信號； (d)自第二組的所述許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號；和 (e)觀察所述第二組信號。
40.權(quán)利要求36的裝置，其中所述裝置可用于用包括以下步驟的方法來檢測所述生物樣品中的多個靶 (a)使所述生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針； (b)將所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接； (C)觀察來自第一組的所述許多已結(jié)合靶的探針的第一組信號； (d)修改所述觀察到的信號； (e)自第二組的所述許多已結(jié)合靶的探針生成第二組信號；和 (f)觀察所述第二組信號。
全文摘要
提供了用于檢測生物樣品中多個靶的方法，所述方法包括使所述生物樣品與許多靶結(jié)合探針接觸以形成許多已結(jié)合靶的探針，將所述已結(jié)合靶的探針中至少之一與所述生物樣品共價連接；和序貫觀察來自所述已結(jié)合靶的探針的信號。還提供了用于檢測所述多個靶的相關(guān)試劑盒和裝置。
文檔編號C12Q1/68GK102803510SQ201080058305
公開日2012年11月28日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日
發(fā)明者A.索德, J.R.尼爾遜, M.格德斯 申請人:通用電氣公司