專(zhuān)利名稱(chēng)：Tt1基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及TTl基因作為篩選標(biāo)記基因在植物遺傳 轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物誕生以來(lái)，全球抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑和品質(zhì)改良的 棉花、水稻、大豆、玉米等轉(zhuǎn)基因植物已達(dá)120多種，種植面積9000萬(wàn)公頃。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的 發(fā)展能夠?qū)⒕哂袃?yōu)良性狀的目的基因?qū)肷锘蚪M中，從而使得其遺傳性狀得到改良。目前基因轉(zhuǎn)移在技術(shù)上還存在著一些限制因素，其中之一就是轉(zhuǎn)化過(guò)程中只有少 數(shù)細(xì)胞能夠吸收外源DNA并整合進(jìn)基因組中，而大多數(shù)細(xì)胞仍是未轉(zhuǎn)化的。因此，目的基因 的引入常常需要篩選標(biāo)記基因，從而賦予受體生物以特定的選擇性標(biāo)記，以便于識(shí)別和鑒 定轉(zhuǎn)基因生物?，F(xiàn)在廣泛用于選擇的標(biāo)記基因主要有2大類(lèi)一類(lèi)是抗生素抗性基因，包括 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)、卡那霉素抗性基因(npt II) 等；另一類(lèi)是除草劑抗性基因，包括草丁膦抗性基因(bar)、草甘膦抗性基因(epsp)等。然而，當(dāng)獲得一個(gè)真正的轉(zhuǎn)基因植株后，篩選標(biāo)記基因就失去其功能和意義，這些 標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化后仍保留在生物體內(nèi)，其繼續(xù)表達(dá)的產(chǎn)物也會(huì)帶來(lái)一些不良后果，具有許 多潛在的危害第一安全性。篩選標(biāo)記基因中抗生素抗性標(biāo)記基因的安全問(wèn)題，主要是指其抗性 基因轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的在環(huán)境中的傳播。另外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物中的標(biāo)記基因是否會(huì)通過(guò)食物在 腸道中水平轉(zhuǎn)移至微生物，從而影響抗生素治療的有效性。對(duì)除草劑抗性基因的擔(dān)憂(yōu)主要 是因?yàn)檫@類(lèi)基因可能存在雜草化等生態(tài)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。盡管風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告對(duì)一些篩選標(biāo)記基因提 供了安全保證，公眾對(duì)安全的關(guān)心已經(jīng)大大阻礙了轉(zhuǎn)基因作物的商品化，而且對(duì)其他標(biāo)記 基因及其產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是一個(gè)既昂貴又繁瑣的過(guò)程。第二影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生。當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化后，需要從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中鑒別并分離出轉(zhuǎn) 化細(xì)胞。篩選標(biāo)記基因同目的基因共同轉(zhuǎn)化，然后將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞培養(yǎng)在含有抗生素或除 草劑的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠存活并生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)而最終死亡。非轉(zhuǎn)化細(xì) 胞在逐漸凋亡過(guò)程中能夠分泌毒素或生長(zhǎng)抑制劑，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向轉(zhuǎn)化細(xì)胞的運(yùn)輸，進(jìn)而 影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖及分化。第三影響多重轉(zhuǎn)化。通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將多個(gè)外源目的基因?qū)胫参矬w內(nèi)，已成 為育種學(xué)家們的研究目標(biāo)。標(biāo)記基因的使用雖然有助于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選，但影響多重轉(zhuǎn)化。 在細(xì)胞第一次轉(zhuǎn)化中使用了某一特殊的標(biāo)記基因，在隨后的轉(zhuǎn)化中就要使用不同的標(biāo)記基 因。盡管轉(zhuǎn)基因植物能給人類(lèi)帶來(lái)了巨大的利益，但目前仍有很多人擔(dān)心轉(zhuǎn)基因植物 可能對(duì)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成威脅，轉(zhuǎn)基因食品也可能對(duì)人類(lèi)健康造成危害。為了尋找新的、安全 的篩選標(biāo)記代替抗生素基因、抗除草劑基因，以甘露糖(磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因pmi)、木糖 (木糖異構(gòu)酶基因xylA)為篩選劑的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。其原理是因這些糖類(lèi)不被一般植物細(xì)胞吸收而使非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長(zhǎng)受阻，使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分離出來(lái)。雖然這些糖類(lèi)對(duì)生物 細(xì)胞無(wú)害且易于被微生物分解，避免了抗生素的副作用，但用于遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，不同植物所需 篩選劑濃度差別很大，且pmi本身就存在于一些豆科植物中外，可用其篩選的植物范圍較 小，在絕大多數(shù)植物上的效果還有待驗(yàn)證。因此，為了消除人們的這種擔(dān)憂(yōu)，如何利用安全、有效的篩選標(biāo)記基因進(jìn)行外源目 的基因的篩選，已經(jīng)成為近年來(lái)植物轉(zhuǎn)基因研究中的一個(gè)熱點(diǎn)，也是今后基因工程研究的 重要方向之一，目前本領(lǐng)域需要提供新的有效方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為轉(zhuǎn)基因植物的篩選提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的方案是提供了 TTl基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選中的應(yīng)用。其中，上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并序列；或O)在⑴限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。進(jìn)一步的，上述⑵在⑴限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加1個(gè)或幾 個(gè)(10個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或 相似的多肽。本發(fā)明還提供了一種植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選方法。該方法包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成含有所述TTl基因的 重組載體；b、將步驟a中的重組載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物細(xì)胞中；C、經(jīng)使用逆境條件進(jìn)行篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。另一方面，該方法還可以包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成含有所述TTl基因的 重組載體；b、將步驟a中的重組載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物細(xì)胞中；C、然后將目標(biāo)植物細(xì)胞培育成植株或其后代，所述植物的后代包括植物種子及植 物組織，經(jīng)使用逆境條件進(jìn)行篩選獲得轉(zhuǎn)化體。上述的逆境篩選是指在目標(biāo)植物的野生型不能承受而轉(zhuǎn)入TTl基因的轉(zhuǎn)基因型 能夠承受的高溫、低溫或高鹽的至少一種逆境下進(jìn)行篩選，能承受逆境并存活的表明為轉(zhuǎn) 化體，即轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。本發(fā)明還提供了一種基因工程用載體。該基因工程用載體使用TTl基因作為篩選 標(biāo)記基因。本發(fā)明的上述逆境篩選可以在愈傷組織培養(yǎng)階段進(jìn)行，也可以在待篩選植物的種 子萌發(fā)階段進(jìn)行。在愈傷組織分化、生根階段或分化生根后的進(jìn)行篩選時(shí)，將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織放 入培養(yǎng)基中在逆境條件下篩選，篩選壓力應(yīng)按照由低到高的原則，隨著篩選次數(shù)的增加，篩 選壓力的強(qiáng)度也逐漸增加；如第一次篩選效果較差時(shí)(轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因不能區(qū)分，都生長(zhǎng)良好)，第二次篩選可適當(dāng)提高篩選壓力濃度。篩選數(shù)天后可見(jiàn)有的愈傷組織逐漸分化 出葉苗或根系，或逐漸長(zhǎng)大，表明此類(lèi)愈傷組織轉(zhuǎn)入重組載體，即為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性；而有的愈 傷組織逐漸褐化或透明，或停止生長(zhǎng)，則表明此類(lèi)愈傷組織耐逆境能力較低，未轉(zhuǎn)入重組載 體，即為轉(zhuǎn)基因陰性。比如高鹽(NaCl)逆境條件進(jìn)行篩選時(shí)，以在愈傷組織分化、生根階段或分化生根 后的篩選階段，將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織放入含有5 40mg/L NaCl的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基種類(lèi)以具 體的待篩選物種確定)中篩選，篩選濃度應(yīng)按照由低到高的原則，隨著篩選次數(shù)的增加，篩 選濃度也逐漸增加；第一次篩選效果較差時(shí)(轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因不能區(qū)分，都生長(zhǎng)良好)， 第二次篩選可適當(dāng)提高NaCl濃度。篩選數(shù)天后可見(jiàn)有的愈傷組織逐漸分化出葉苗或根系， 或逐漸長(zhǎng)大，表明此類(lèi)愈傷組織轉(zhuǎn)入重組載體，即為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性；而有的愈傷組織逐漸褐化 或透明，或停止生長(zhǎng)，則表明此類(lèi)愈傷組織耐鹽性較低，未轉(zhuǎn)入重組載體，即為轉(zhuǎn)基因陰性。 生長(zhǎng)良好的愈傷組織可轉(zhuǎn)入不含NaCl的培養(yǎng)基中恢復(fù)生長(zhǎng)，待葉片及根系發(fā)育完全后移 栽，獲得轉(zhuǎn)基因植株。在種子萌發(fā)階段進(jìn)行篩選時(shí)將待篩選植物的種子放入逆境條件中，可見(jiàn)有些種 子逐漸發(fā)芽，并開(kāi)始生長(zhǎng)，表明此類(lèi)種子為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性；而有些種子不能發(fā)芽，或即使發(fā)芽 也不能生長(zhǎng)，則表明此類(lèi)種子為轉(zhuǎn)基因陰性。發(fā)芽并能繼續(xù)生長(zhǎng)的種子可移入正常環(huán)境中 生長(zhǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。比如高鹽(NaCl)逆境條件進(jìn)行篩選時(shí)，將轉(zhuǎn)基因植物的種子放入含0. 5 2g/L NaCl的水或培養(yǎng)基中，在常規(guī)種子生長(zhǎng)的光照、溫度、濕度條件下生長(zhǎng)5 10天，可見(jiàn)有些 種子逐漸發(fā)芽，并開(kāi)始生長(zhǎng)，表明此類(lèi)種子為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性；而有些種子不能發(fā)芽，或即使發(fā) 芽也不能生長(zhǎng)，則表明此類(lèi)種子為轉(zhuǎn)基因陰性。發(fā)芽并能繼續(xù)生長(zhǎng)的種子可移入正常環(huán)境 中生長(zhǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，該 基因來(lái)源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)。在本發(fā)明中，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO. 1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指所述序列中有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同 氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO. 1同 源性低至約89%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所編碼的多肽的序列。另外，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生序列”的含義還包括能 在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳的在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO. 1核苷酸序列雜交的核苷酸序 列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列的同源性至少80%，較佳地至少89%， 更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本發(fā)明中的相同功能是指提高植物的 抗逆性能。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO. 1所編碼的相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常 為1 90個(gè)，較佳地1 60個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最佳地1 10個(gè))核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為30個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其 編碼的多肽也能提高植物的抗逆性能。本發(fā)明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領(lǐng)域 已知的各種載體，尤其是真核表達(dá)載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發(fā)明可用上述重組 載體轉(zhuǎn)化宿主植物細(xì)胞，篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然后使用各種上述的逆境條件進(jìn)行篩選。本發(fā)明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線(xiàn)性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線(xiàn)性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽 的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動(dòng)子控制序 列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位 置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前 導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明提供了篩選標(biāo)記基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。 將TTl基因作為篩選標(biāo)記基因，用于篩選的成本低，而且在轉(zhuǎn)化目的基因的同時(shí)使植物獲 得了另一個(gè)逆境抗性，這使得篩選基因同時(shí)具有一定的應(yīng)用價(jià)值，且該應(yīng)用價(jià)值對(duì)于生物 沒(méi)有負(fù)面影響。


圖1 愈傷組織在含氯化鈉的分化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，左管為未轉(zhuǎn)入TTl基因的愈傷 組織；右管為轉(zhuǎn)入TTl基因的愈傷組織，右管具有一定的耐鹽性，即能長(zhǎng)出葉片(如右管所 示)°圖2 轉(zhuǎn)基因水稻植株中TTl基因的PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為陽(yáng)性對(duì) 照(+)，待檢測(cè)植株1 7號(hào)，野生型陰性對(duì)照(_)。圖3 愈傷在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況(若確實(shí)轉(zhuǎn)入TTl基因，該愈傷可長(zhǎng)出愈傷 芽，黑圈中所示)。圖4 轉(zhuǎn)基因油菜植株中TTl基因的PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。從左至右依次為陽(yáng)性對(duì) 照(+)，待檢測(cè)植株1 8號(hào)，野生型陰性對(duì)照(_)。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖，進(jìn)一步說(shuō)明而不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī) 條件，例如 Sambrook，Russell 的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。下述實(shí)施例中，所 用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚(yú)堿型菌系的LBA4404菌株；大腸桿菌 (E. coli)采用DH5a菌株，菌株均購(gòu)自于Qiagen公司。載體pBI121購(gòu)自于Clontech公 司。其余化學(xué)實(shí)際均為市售分析純。下述實(shí)施例中，“SEQ ID N0. 1”單獨(dú)出現(xiàn)時(shí)，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可理解1其為“SEQ IDN0. 1所示核苷酸序列”的簡(jiǎn)稱(chēng)。實(shí)施例一 TTl基因的克隆及過(guò)量表達(dá)重組載體的構(gòu)建1、TTl基因的克隆以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因?yàn)檎T餌蛋白，根據(jù)酵母雙雜交方法(見(jiàn)Clontech公司所公開(kāi)的資料)，篩選到油菜中的一個(gè)EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根據(jù)這段篩選到的序列，通過(guò)5’RACE (見(jiàn)Takara公司所公開(kāi)的資料)的方法獲得本發(fā)明 所述基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物(SEQID NO. 3) :5，-ATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。用TRIzoI法提取油菜RNA (見(jiàn)hvitrogen公司公開(kāi)資料)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA (見(jiàn) Promega公司公開(kāi)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒資料)。經(jīng)PCR從油菜cDNA中擴(kuò)增SEQ ID NO 1所示的 核苷酸序列。對(duì)PCR產(chǎn)物純化(見(jiàn)Qiagen公司所公開(kāi)的PCR產(chǎn)物純化資料)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證， 得到序列SEQ ID NO 1的基因片段。2、TTl過(guò)量表達(dá)重組載體的構(gòu)建根據(jù)SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，上游引物(SEQID NO. 5) :5，-CGCGGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 6) :5，-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。經(jīng)PCR，從油菜cDNA中擴(kuò)增完整的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。對(duì)PCR產(chǎn)物 純化(見(jiàn)Qiagen公司所公開(kāi)的資料)，然后用BamHl與Mcl酶切，膠回收，與載體pBI121 連接(連接位點(diǎn)=BamHl與Mel)，獲含SEQ ID NO 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒。實(shí)施例二水稻遺傳轉(zhuǎn)化及NaCl篩選愈傷組織1、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用的水稻材料(Oryza sativa L.)為粳稻日本晴，為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所 保存。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚(yú)堿型菌系的LBA4404菌株；大腸桿 菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通過(guò)凍融法將含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中繁殖， 提取質(zhì)粒(見(jiàn)Qiagen公司公開(kāi)資料)，將含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 LBA4404中，涂平板形成單菌落待用。2、外植體培養(yǎng)——成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代選取外觀健康，飽滿(mǎn)，無(wú)病斑的成熟水稻種子脫去穎殼，75%酒精中浸泡1分鐘， 用無(wú)菌水沖洗干凈后，0. 升汞滅菌20分鐘，再用無(wú)菌水沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)上晾 干，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB+2，4-D 2. 5mg/L)上，于^TC下暗培養(yǎng)。2周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的 誘導(dǎo)情況并進(jìn)行繼代，以后每2周繼代一次。3、工程菌的活化與浸染在平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，經(jīng)PCR檢測(cè)(上游引物(SEQ ID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID N0. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，確定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性菌落，放在IOmlYEP液體培養(yǎng)基(酵 母提取物IOg+胰蛋白胨5g+氯化鈉IOg+加水至IL+利福平50 μ g/mL)中，250r/min，28°C 活化培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)液300 μ 1于:3ml YEP液體培養(yǎng)基中，在250r/min，28°C的條件 下遮光振動(dòng)培養(yǎng)，至菌液達(dá)0D600 = 0. 5左右，即可用于轉(zhuǎn)化。上述含目的基因的菌液在無(wú)菌的50ml的離心管中以5000r/min離心5分鐘后回 收菌體，用30ml的NBCO (NB+2，4_D 2. 0mg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)液體培養(yǎng)基重懸含目的基因的菌體。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的，顆粒狀胚性愈傷組織用無(wú)菌鑷子將其適當(dāng)夾小，創(chuàng) 造傷口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染時(shí)間為10 30min，之后放入有濾紙的平皿中吸干 多余菌液。4、共培養(yǎng)與NaCl篩選將吸干菌液的愈傷置于NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)固體 培養(yǎng)基上，22 25°C暗培養(yǎng)2 3天，直至愈傷組織上出現(xiàn)少量菌斑為止。將共培養(yǎng)的愈 傷組織放在廣口瓶中，用無(wú)菌水清洗至清澈，再浸泡于含頭孢霉素500mg/L NBCO液體培養(yǎng) 基中30 60min，將處理后的愈傷組織用無(wú)菌濾紙吸干。將愈傷組織接種到預(yù)分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L)上，暗培養(yǎng)10 15 天。再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L+6-BAlmg/L+NaCl 12mg/L)上，25 27°C光照培養(yǎng)(12小時(shí)/天)約1 2個(gè)月。如果轉(zhuǎn)入TTl基因，則該愈傷具有一定的耐鹽 性，即能長(zhǎng)出葉片(見(jiàn)圖1)。之后將長(zhǎng)出葉片幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基(NB+NAA 0. 25mg/L+NaCl 20mg/L)上培養(yǎng)，當(dāng)根長(zhǎng)到2cm左右高時(shí)取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入盆栽。5、轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè)取上述步驟篩選出的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性水稻植株新鮮葉片，抽提總DNA(見(jiàn)Qiagen公司 所公開(kāi)的資料)，以提取的DNA做模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)。上游引物(SEQID NO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID NO. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反應(yīng)完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，有目標(biāo)條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖2)，表明目的基 因轉(zhuǎn)化成功。實(shí)施例三油菜遺傳轉(zhuǎn)化及NaCl篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織1、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用的甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L)材料為蜀雜九號(hào)84100-18，為四川大學(xué)生 命科學(xué)院提供。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚(yú)堿型菌系的LBA4404菌 株；大腸桿菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通過(guò)凍融法將含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中繁殖， 提取質(zhì)粒(具體方法參見(jiàn)Qiagen公司公開(kāi)的資料)，將含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，涂平板形成單菌落待用。2、下胚軸的預(yù)培養(yǎng)選取籽粒飽滿(mǎn)的甘藍(lán)型油菜種子，4°C過(guò)夜春化后用70%乙醇浸泡30s lmin， 0. 1 %的升汞(HgC12)溶液浸泡8 lOmin，無(wú)菌水沖洗5次，濾紙吸干，接種于MS固體培養(yǎng) 基上，24°C暗培養(yǎng)2 5天，然后取出光照l(shuí)^i/d繼續(xù)萌發(fā)7 10天。取5 7cm無(wú)菌苗下胚軸，將油菜下胚軸切成7mm左右小段，分散均勻置于預(yù)培養(yǎng) 基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2，4_D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)中進(jìn)行 2 5 天 的預(yù)培養(yǎng)。3、下胚軸的浸染及共培養(yǎng)在平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，經(jīng)PCR檢測(cè)(上游引物(SEQ ID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID N0. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，確定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性菌落，將SEQ ID NO. 1過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含40mg/L利福平LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜后收集菌體，重懸于 含100mg/L乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中至0D600 = 0. 4 0. 6，搖菌1 2h。將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的健壯的油菜下胚軸分別浸入含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒的 農(nóng)桿菌菌液中30s lmin，之后用無(wú)菌濾紙迅速吸干多余的菌液，將油菜下胚軸平放于共 培養(yǎng)基(MS+2mg/L6-BA+lmg/L2,4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)上，培養(yǎng) 2 天。4、NaCl篩選培養(yǎng)與誘導(dǎo)將共培養(yǎng)后的油菜下胚軸分別接入分化培養(yǎng)基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2， 4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L乙酰丁香酮)中繼續(xù)培養(yǎng)。每2周更新培養(yǎng)基一次，培養(yǎng)4 周，得到愈傷芽。將愈傷芽在篩選培養(yǎng)基(MS+ang/L6-BA+2. 5mg/L AgN03+NaCl 10mg/L)上，若確 實(shí)轉(zhuǎn)入TTl基因，該愈傷可長(zhǎng)出愈傷芽(見(jiàn)圖3)。待芽長(zhǎng)至4 6片真葉時(shí)，將芽從愈傷 組織中切下，移入生根培養(yǎng)基(1/2MS+0. 15mg/L NAA+250mg/L頭孢霉素+NaCl 15mg/L)中。 待再生苗根系生長(zhǎng)發(fā)達(dá)時(shí)，然后將培養(yǎng)罐蓋揭開(kāi)，在培養(yǎng)室中煉苗2 3d。煉苗后將含SEQ IDN0. 1的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株分別在生根培養(yǎng)基(1/2MS+0. 15mg/LNAA)上發(fā)育出完整根 系，將其轉(zhuǎn)入盆栽。5、轉(zhuǎn)基因油菜的PCR檢測(cè)將上述步驟篩選出的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性油菜植株新鮮葉片，各取葉片少量抽提總 DNA (見(jiàn)Qiagen公司所公開(kāi)的資料)，以提取的DNA做模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。上游引物(SEQID NO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID N0. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反應(yīng)完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，有目標(biāo)條帶出現(xiàn)(見(jiàn)圖4)，表明目的基 因轉(zhuǎn)化成功。實(shí)施例四油菜遺傳轉(zhuǎn)化及熱激篩選轉(zhuǎn)基因油菜種子1、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建采用的甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L)材料為蜀雜九號(hào)84100-18，為四川大學(xué)生 命科學(xué)院提供存。農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚(yú)堿型菌系的LBA4404 菌株；大腸桿菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通過(guò)凍融法將含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中繁殖， 提取質(zhì)粒(見(jiàn)Qiagen公司公開(kāi)資料)，將含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 LBA4404中，涂平板形成單菌落待用。2、下胚軸的預(yù)培養(yǎng)選取籽粒飽滿(mǎn)的甘藍(lán)型油菜種子，4°C過(guò)夜春化后用70%乙醇浸泡30s lmin， 0. 1 %的升汞(HgC12)溶液浸泡8 lOmin，無(wú)菌水沖洗5次，濾紙吸干，接種于MS固體培養(yǎng) 基上，24°C暗培養(yǎng)2 5天，然后取出光照l(shuí)^i/d繼續(xù)萌發(fā)7 10天。取5 7cm無(wú)菌苗下胚軸，將油菜下胚軸切成7mm左右小段，分散均勻置于預(yù)培養(yǎng) 基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2，4_D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)中進(jìn)行 2 5 天 的預(yù)培養(yǎng)。3、下胚軸的浸染及共培養(yǎng)在平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，經(jīng)PCR檢測(cè)(上游引物(SEQ IDNO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID NO. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，確定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性菌落，將SEQ ID NO. 1過(guò)量表達(dá)重組 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種于含40mg/L利福平LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜后收集菌體，重懸于 含100mg/L乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中至0D600 = 0. 4 0. 6，搖菌1 2h。將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的健壯的油菜下胚軸分別浸入含SEQ ID NO. 1的過(guò)量表達(dá)重組質(zhì)粒的 農(nóng)桿菌菌液中30s lmin，之后用無(wú)菌濾紙迅速吸干多余的菌液，將油菜下胚軸平放于共 培養(yǎng)基(MS+2mg/L6-BA+lmg/L2,4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)上，培養(yǎng) 2 天。4、篩選培養(yǎng)與誘導(dǎo)將共培養(yǎng)后的油菜下胚軸分別接入分化培養(yǎng)基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2， 4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L乙酰丁香酮)中繼續(xù)培養(yǎng)。每2周更新培養(yǎng)基一次，培養(yǎng)4 周，得到愈傷芽。將愈傷芽在篩選培養(yǎng)基(MS+ang/L 6-BA+2. 5mg/LAgN03)上，待芽長(zhǎng)至4 6片真 葉時(shí)，將芽從愈傷組織中切下，移入生根培養(yǎng)基(1/2MS+0. 15mg/LNAA+250mg/L頭孢霉素) 中。待再生苗根系生長(zhǎng)發(fā)達(dá)時(shí)，然后將培養(yǎng)罐蓋揭開(kāi)，在培養(yǎng)室中煉苗2 3d。煉苗后將 含SEQ IDN0. 1的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株分別在生根培養(yǎng)基(1/2MS+0. 15mg/LNAA)上發(fā)育出 完整根系，將其轉(zhuǎn)入盆栽培養(yǎng)，收種備用。5、轉(zhuǎn)基因油菜種子的熱激篩選選取轉(zhuǎn)基因油菜種子各100粒，放入培養(yǎng)皿中，加水4°C春化過(guò)夜。之后將種子放 入盛水的EP管中，置于46°C水浴鍋中熱激池，之后將種子平鋪于墊有浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿 中，待觀察。約7天后，將可發(fā)芽的種子移入土壤中繼續(xù)生長(zhǎng)，待長(zhǎng)至3-4片真葉時(shí)，進(jìn)行 PCR檢測(cè)。6、轉(zhuǎn)基因油菜的PCR檢測(cè)將上述步驟篩選出的油菜植株新鮮葉片，各取葉片少量抽提總DNA(見(jiàn)Qiagen公 司所公開(kāi)的資料)，以提取的DNA做模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。上游引物(SEQID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID N0. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反應(yīng)完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，表明目的基因轉(zhuǎn)化成 功，篩選出的植株確為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。
權(quán)利要求
1.TTl基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其簡(jiǎn)并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選方法，其特征在于包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成含有所述TTl基因的重組 載體；b、將步驟a中的重組載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物細(xì)胞中；c、經(jīng)使用逆境條件進(jìn)行篩選獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
4.植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選方法，其特征在于包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達(dá)調(diào)控序列后，形成含有所述TTl基因的重組 載體；b、將步驟a中的重組載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物細(xì)胞中；C、然后將目標(biāo)植物細(xì)胞培育成植株或其后代，所述植物的后代包括植物種子及植物組 織，經(jīng)使用逆境條件進(jìn)行篩選獲得轉(zhuǎn)化體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的逆境篩選是指在目標(biāo)植物的 野生型不能承受而轉(zhuǎn)入TTl基因的轉(zhuǎn)基因型能夠承受的高溫、低溫或高鹽的至少一種逆境 下進(jìn)行篩選，能承受逆境并存活的表明為轉(zhuǎn)化體，即轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的逆境篩選在待篩選植物的愈傷組 織培養(yǎng)階段進(jìn)行或者在待篩選植物的種子萌發(fā)階段進(jìn)行。
8.基因工程用載體，其特征在于使用TTl基因作為篩選標(biāo)記基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TT1基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為轉(zhuǎn)基因植物的篩選提供一種新的有效選擇。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的方案是提供了TT1基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化篩選中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，將TT1基因作為篩選標(biāo)記基因，用于篩選的成本低，而且在轉(zhuǎn)化目的基因的同時(shí)使植物獲得了另外的逆境抗性，這使得篩選基因同時(shí)具有一定的應(yīng)用價(jià)值，且該應(yīng)用價(jià)值對(duì)于生物沒(méi)有負(fù)面影響，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102140474SQ20101055221
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者楊毅 申請(qǐng)人:四川貝安迪生物基因工程有限公司